QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM FRUTAS VERMELHAS (Fragaria vesca, Rubus idaeus, Morus nigra)

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1 QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM FRUTAS VERMELHAS (Fragaria vesca, Rubus idaeus, Morus nigra) Valéria Rampazzo*, Amanda Y. Takikawa* e Charles W. I. Haminiuk* *Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Campo Mourão, PR, Brasil valeria_rampazzo@hotmail.com Resumo No presente estudo, compostos fenólicos do morango, framboesa e amora foram avaliados. Foi utilizada cromatografia líquida de alta eficiência combinada com detecção de arranjo de diodos (RP- CLAE-DAD/UV-Vis) para o estudo dos compostos fenólicos. Ácidos gálico, cafêico e trans-cinâmico foram encontrados em todas as frutas analisadas. Rutina foi o principal polifenol encontrado na framboesa e amora. Uma concentração elevada de flavan-3-ol (catequina) foi observada no morango. Pequena quantidade de caempferol foi encontrada no morango. Palavras chave: frutas vermelhas, compostos fenólicos, flavonóides, CLAE. Abstract In the present study, phenolic compounds of strawberry, raspberry and blackberry were evaluated. Reversephase high-performance liquid chromatography combined with diode array detection (RP-HPLC-DAD/UV- Vis) was used to study the phenolic compounds. Gallic, caffeic and transcinnamic acids were found in all fruits analyzed. Rutin was the major polyphenol found in raspberry and blackberry. A high concentration of flavan-3- ol (catechin) was observed in strawberry. Small amount of kaempferol was found in strawberry. Keywords: berries, phenolic compounds, flavonols, HPLC. Introdução Espécies de frutas vermelhas pertencentes a família Rosaceae incluem uma variedade de culturas economicamente significativas e são cultivadas em muitos países [1]. Estas frutas possuem uma significativa quantidade de compostos fenólicos que além dos efeitos na saúde, muitos destes compostos têm um impacto diretamente sobre a qualidade dos produtos que os contêm, em parte porque são responsáveis por suas propriedades sensoriais [2]. O consumo de frutas vermelhas tornou-se popular nos últimos anos entre pessoas que se preocupam com a saúde devido aos altos níveis de fitoquímicos valiosos: polifenóis, flavonoides, taninos, ácidos fenólicos e antocianinas. Frutas vermelhas contêm componentes essenciais tais como vitaminas, 1/7

2 minerais e fibras que proporcionam benefícios para a saúde além da nutrição básica [3]. Além de evitar a deterioração oxidativa dos lipídios, antioxidantes atuam beneficamente na saúde [4]. A formação de radicais livres está associada com o metabolismo normal das células aeróbias. O consumo de oxigênio inerente na multiplicação de células conduz à geração de uma serie destes radicais. A interação entre essas espécies e moléculas de natureza lipídica em excesso produz novos radicais hidroperóxidos e peróxidos diferentes [5]. Cromatografia líquida de alta eficiência, juntamente com um detector de fotodiodo fornece uma ferramenta poderosa e econômica para análise de polifenóis em extratos de plantas. CLAE-DAD/UV-Vis fornece uma vasta informação sobre as estruturas dos compostos fenólicos [6]. Os espectros de absorção UV-vis de compostos fenólicos permitem a identificação de picos cromatográficos e sua classificação. Uma combinação destes dados com os espectros de massa e informações a partir da literatura pode ser usada para tentar identificar a estrutura de polifenóis [7]. O objetivo deste trabalho foi quantificar compostos fenólicos identificados no morango (Fragaria vesca), framboesa (Rubus idaeus) e amora (Morus nigra) por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Metodologia As frutas utilizadas para as análises foram morango, framboesa e amora-preta. Ambas as três, fornecidas pela Central de Abastecimento (CEASA) do município de Maringá-PR. As amostras foram liofilizadas e trituradas. Os extratos das frutas vermelhas foram obtidos com diluição 1:10 (500 mg amostra/ 10 ml de solvente), sendo o metanol o solvente utilizado. As soluções reservadas em tubos foram mantidas por 24 horas em homogeneizador rotatório e após isso, centrifugadas em tubos do tipo falcon com rotação de 6000 rpm durante 15 minutos. Os extratos foram mantidos refrigerados e protegidos da luz para que não houvesse degradação dos compostos. Para que fossem obtidos resultados que expressassem quantitativamente e qualitativamente os compostos fenólicos encontrados nas amostras de frutas vermelhas, foi utilizado o cromatógrafo líquido de alta eficiência com detecção de diodo (CLAE- DAD/UV-Vis) com sistema Ultimate 3000 CLAE (Dionex, Idstein, Alemanha). Equipado com uma bomba Ultimate 3000, coluna do 2/7

3 compartimento de amostra Ultimate 3000, detector de fotodiodo e software Chromeleon foi utilizado. Coluna de fase reversa Acclaim 120, C18 5 mm 120 A (4,6 mm x 250 mm) foi utilizada para a separação dos compostos fenólicos. A coluna foi mantida a 40ºC em todas as análises e os comprimentos de onda utilizados para detecção foram 280, 300 e 320 nm. Ácidos fenólicos e flavonóis são normalmente detectados em comprimentos de onda entre 210 e 320 nm. O volume injetado foi de 10 µl. As fases móveis utilizadas foram água acidificada com ácido fosfórico 1% e metanol. A eluição dos compostos fenólicos foi realizada através de gradiente entre as duas fases móveis : 0-15 % B em 2 min, % B em 5 min, % B em 10 min, % B em 15 min, % B em 25 min, % B em 30 min, % B em 35 min, % B em 45 min e % B em 60 min. Os padrões utilizados para este estudo foram: ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafêico, ácido p-cumárico, ácido ferrúlico, rutina, trans-cinâmico, miricetina, quercetina, kaempferol) e flavonóis (rutina, miricetina, quercitina e caempferol). As soluções padrões foram preparadas em metanol e as curvas de calibração foram obtidas a partir de injeções em duplicatas de pelo menos cinco concentrações. Na análise em CLAE, os compostos fenólicos são identificados comparando o tempo de retenção com os dos padrões puros [8]. Resultados Os compostos fenólicos apresentam diversas características bioativas e demandam precisão na determinação destes compostos em diferentes matrizes alimentares. A preparação da amostra é um aspecto primário e crítico de qualquer análise. Engloba várias etapas que vão desde amostra de moagem, a extração, de pré-concentração de hidrólise, e derivatização [9], assim, para que houvesse um melhor aproveitamento da análise foi determinado que o solvente que extrairia os compostos a serem quantificados para esses tipos de amostras é o metanol. As tabelas 1, 2 e 3 apresentam os valores obtidos a partir da quantificação de compostos fenólicos analisados em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) da amostra de amora, framboesa e morango respectivamente. 3/7

4 Tabela 1. Compostos fenólicos identificados na amora Composto Comprimento Concentração fenólico de onda (nm) (mg/100g)* Ácido gálico 280 0,39 Ácido 280 0,39 cafêico Rutina 370 4,92 Ácido transcinâmico 370 0,05 Quercetina 370 0,14 Total 5,89 *mg/100g de peso seco Tabela 2. Compostos fenólicos identificados na framboesa Composto Comprimento Concentração fenólico de onda (nm) (mg/100g)* Ácido gálico 280 0,88 Ácido 280 0,58 cafêico Ácido p ,20 Cumárico Rutina ,22 Miricetina 370 0,62 Ácido Transcinâmico 306 0,24 Quercetina 370 0,20 Total 12,86 *mg/100g de peso seco Tabela 3. Compostos fenólicos identificados no morango Composto Comprimento Concentração fenólico de onda (nm) (mg/100g)* Ácido gálico 280 1,18 Catequina ,06 Ácido cafêico Ácido p- cumárico Ácido transcinâmico 280 2, , ,18 Caempferol 370 0,06 Total 75, 16 *mg/100g de peso seco Como pode ser verificado, ácidos gálico, cafêico e trans-cinâmico foram encontrados em todas as frutas analisadas. Rutina foi o principal polifenol encontrado na framboesa (10,22 mg/100g) e amora (4,92 mg/100g). Concentração elevada de flavan-3-ol (catequina) foi observada no morango (64,06 mg/100g). Pequena quantidade de caempferol foi encontrada no morango. Comparado as outras frutas vermelhas analisadas (framboesa e amora), o morango foi a fruta que apresentou maiores valores de compostos fenólicos. Discussão Os compostos fenólicos são abundantes em frutos coloridos, e devido a sua popularidade e alto consumo, estes servem como uma das nossas mais importantes fontes alimentares de 4/7

5 compostos fenólicos [10, 11]. Frutas vermelhas são relatadas por conter uma grande variedade de compostos fenólicos, incluindo derivados de ácido hidroxibenzóico e hidroxicinâmico, antocianinas, flavonóis, proantocianidinas e taninos hidrolisáveis [12]. Não é uma tarefa fácil definir método que é adequado para uma análise de um diverso grupo de fenólicos por causa das diferenças das estruturas químicas e a sensibilidade dos compostos com as condições de extração e hidrólise. Flavonóides exigem duras condições de desconjugação comparados a ácidos hidroxicinâmicos ou catequinas. Além disso, o requisito de condições na separação cromatográfica varia extensivamente. O método combinado tem de ter em conta todos os compostos sob estudo [13]. A natureza, o tamanho, estrutura, solubilidade, o grau da posição de glicosilação, e conjugação de compostos fenólicos com outros compostos podem influenciar a sua biodisponibilidade, absorção, distribuição, metabolismo e excreção em seres humanos [14, 15]. Entre os compostos identificados nas frutas estudadas, os que se apresentaram em maior quantidade foram rutina para framboesa e amora, e catequina no morango. Neste grupo de polifenóis, alguns membros são conhecidos por sua atividade anti-inflamatória, antioxidante, antimicrobiana e anticancerígena, onde além da rutina e catequina, também estão inclusos neste grupo, a quercetina, miricetina e caempferol [16], que também foram encontrados nas amostras, em menor quantidade. Os compostos fenólicos presentes nas frutas são indentificados a partir da comparação do tempo de retenção que as amostras obtiveram com os dos padrões identificados previamente pelo método. As vantagens dos alimentos que possuem propriedades bioativas surgem quando o consumidor está interessado em contribuir para manter uma boa saúde através da nutrição [2], assim, quando alimentos como as frutas vermelhas estudadas são consumidas regularmente, podem propiciar benefícios a longo prazo para a saúde, além de possuírem aspectos sensoriais agradáveis tendo assim uma boa aceitação popular. Conclusão Com os dados obtidos da análise em CLAE, foi possível verificar que o morango se destacou quanto ao conteúdo de compostos fenólicos e flavonóis comparado as outras frutas vermelhas estudadas (amora e framboesa). Ácidos gálico, cafêico e transcinâmico foram detectados em todas as 5/7

6 amostras, entretanto, apresentou-se em maior quantidade, rutina nas amostras de amora e framboesa e catequina no morango. A utilização do CLAE- DAD/UV-Vis mostrou-se eficaz na determinação de compostos fenólicos dispostos nas frutas, comprovando a qualidade do método. Agradecimentos Os autores deste trabalho agradecem a Fundação Araucária, pelo apoio financeiro necessário para o desenvolvimento deste projeto. Referências bibliográficas bioactivos de das frutas y sus efectos em la salud. Actividad Dietética 2:64-8. [3] Flis, S., Jastrzebski, Z., Namiesnik, J., Avila, P.A., Toledo, F., Leontewicz, H., Leontowicz, M., Suhaj, M., Trakhtenberg, S., Gorinstein, S. (2012). Evaluation of inhibition of cancer cell proliferation in vitro with different berries and correlation with their antioxidant levels by advanced analytical methods. Jounal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 62: [4] Krishnaiah D, Sarbatly R, Nithyanandam R. (2010). A review of the antioxidant potential of medicinal plant species. Food Bioprod Process. [1] Ninomiya, M., Itoh, T., Ishikawa, S., Saiki, M., Narumiya, K., Yasuda, M., Koshhikawa, K., Nozawa, Y., Koketsu, M. (2010). Phenolic constituents isolated from Fragaria ananassa Dunch. Inhibit antigen-stimulated degranulation through direct inhibition os spleen tyrosine kinase activation. Bioorganic & Medicinal Chemistry 18, [2] Navarrete, Nuria Martinez., Vidal, M. Del Mar Camacho., Lahuerta, Juan José Martinez. (2008). Los compuestos [5] Uchida K. (2000). Role of reactive aldehyde in cardiovascular diseases. Free Radic Biol Med 28: [6] Fang, Z., Zhang, M., Wang, L. (2007). HPLC-DAD-ESIMS analysis of phenolic compuons in bayberries (Myrica rubra Sieb. Et Zucc.). Food Chemistry 100: [7] Yang, Haihua., Ge, Yiqiang., Sun, Yujing., Liu, Donghong., Ye, Xingqian., Wu, Dan. (2011) Identification and characterization of low-molecular-weight phenolic compounds in bayberry (Myrica rubra Sieb. Et Zucc.) 6/7

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