TÍTULO: AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE CITRUS AURANTIFOLIA E CITRUS LIMONIA

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1 16 TÍTULO: AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE CITRUS AURANTIFOLIA E CITRUS LIMONIA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA AUTOR(ES): SILVIO DE ALMEIDA JUNIOR ORIENTADOR(ES): RICARDO ANDRADE FURTADO COLABORADOR(ES): DENISE CRISPIM TAVARES, HELOIZA DINIZ NICOLELLA

2 1. RESUMO Acredita-se que a dieta possa contribuir para o aumento de riscos de câncer, no qual, estima-se entre 90 a 95% dos tumores estão relacionados a fatores ambientais, incluindo hábitos alimentares. Sendo assim, o estudo de efeitos tóxicos de alimentos sobre células é de grande importância na prevenção de doenças e na promoção de saúde. Assim, foi realizado o teste de citotoxicidade do óleo essencial das folhas de C. aurantifolia e C. limonia, avaliado pelo ensaio colorimétrico de viabilidade celular, baseados no uso do sal de tetrazolium (XTT). Para a realização do XTT foi utilizada a linhagem celular de fibroblasto de pulmão humano (GMO7492A). Para a determinação da concentração citotóxica sobre a linhagem normal foram avaliadas 8 concentrações, sendo 19,53 a 2500,00 µg/ml. Os resultados na linhagem GM07492A mostraram que concentrações menores/igual a 625,00 µg/ml não apresentaram resultados significativamente diferentes do controle negativo, indicando ausência de efeito citotóxico. Os valores encontrados de IC50 foi de 493,9 µg/ml para o óleo essencial das folhas de C. aurantifolia e 458,4 µg/ml para C. limonia, sendo o C. aurantifolia relativamente mais toxico que C. limonia. Palavras-chave: citotoxicidade, limão china, limão taiti.

3 2. INTRODUÇÃO A incidência de doenças em algumas regiões parece ser influenciada amplamente pelo estilo de vida (1). Apesar dos benefícios já demonstrados pela ingestão de alimentos de origem vegetal, como frutas, alguns estudos tem identificado que a população brasileira consome uma quantidade inferior destes alimentos em relação a recomendação da Organização Mundial da Saúde (OMS) que é de 400 gramas ao dia, ou cinco porções diárias de frutas e hortaliças (2). Por essa razão a população tem buscado por princípios ativos de interesse. Dentre os compostos bioativos encontrados nos alimentos, carotenoides e compostos fenólicos tem sido amplamente pesquisado nos últimos anos, sendo evidenciados efeitos protetores frente a agentes de danos ao DNA (3). Por outro lado, acredita-se ainda que a dieta possa contribuir para o aumento de riscos de câncer, no qual, estima-se que entre 90 a 95% dos tumores estão relacionados a fatores ambientais, incluindo hábitos alimentares (4). Sendo assim, o estudo de efeitos tóxicos de alimentos sobre células é de grande importância na prevenção de doenças e na promoção de saúde. 2.1 Citrus aurantifolia Citrus aurantifolia pertence à família Rutaceae, conhecido popularmente por limão-taiti, limão, limoeiro, lima-ácida e lime. Tem como constituinte químico a felandrina, hidrocarbonetos terpênicos, limonina, óleo essencial (limoneno), ácidos orgânicos (cítrico e málico), bioflavonóides (hespiridina), pectinas, vitamina A (retinol), vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), niacina), sais minerais (potássio, fósforo, ferro, cálcio, sódio, magnésio, enxofre, cloro), vitamina C (ácido ascórbico). É utilizado na medicina popular para ações adstringente, alcalinizante, antianémica, antibiótica, antidepressiva, ante emética, antiescorbútica, antiespasmódica, antiinflamatória, antisséptica, antitérmica, aperiente, bactericida, clareador da pele, depurativa, diaforética, diurético, expectorante, refrescante, sedativa, sudorífera, tônica estomacal, vermífuga, vitaminizante, através de suas folhas e seus frutos em chás, infusões, extratos e óleos essenciais além da utilização direta em região cutânea e capilar (5).

4 2.2 Citrus limonia Citrus limonia, também chamado de limão-cravo, limão-rosa, limão marmelada e limão da china e seu fruto se assemelha a uma tangerina. A árvore é de crescimento rápido, atingindo m; tem espinhos curtos; os botões de flores e pétalas são roxo-matizado (4). O principal uso do limoeiro-cravo, entretanto, talvez seja um pouco menos nobre do que o consumo do suave e ácido suco de seu fruto. Uma das características mais apreciadas da planta é justamente a resistência e a rusticidade da árvore, e não particularmente a riqueza e o sabor da fruta: no Brasil, essa árvore costuma ser o cavalo preferido para enxertia dos demais cítricos, sobretudo da laranja e do limão-taiti (5). 3. OBJETIVOS Nesse contexto e sabendo-se da grande importância do estudo dos efeitos tóxicos no auxílio de prevenção de doenças e promoção de saúde, se torna relevante avaliar a atividade citotóxica. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico dos óleos essenciais das folhas de C. aurantifolia e C. limonia em fibroblastos de pulmão humano (GMO7492A). 4. METODOLOGIA O óleo essencial foi cedido gentilmente pelo professor Dr. Mayker Dantas do Instituto Federal Goiano, Campus Rio Verde, que realizou a identificação da planta e extração do óleo essencial. Para avaliação atividade citotóxica foi utilizado ensaio colorimétrico do XTT - Kit XTT (Roche Diagnostics): a linhagem normal de fibroblasto de pulmão humano (GM07492A), gentilmente cedida pelo Laboratório de Mutagênese da Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão Preto, São Paulo. As células encontram-se estocadas em nitrogênio líquido (-195ºC), em alíquotas de 1 x 10 6 células/ml em uma solução de congelamento composta de 50% de meio de cultura (HAM F10 + DMEM, na proporção 1:1, Sigma-Aldrich, 40% de soro bovino fetal (Nutricell) e 10% de DMSO (Sigma-Aldrich). Para realização dos experimentos as células foram descongeladas e colocadas em cultivo em meio de cultura HAM F10 + DMEM, na proporção 1:1. O

5 meio de cultura foi suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1,2 g/l de bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich), 0,1 g/l de estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 0,06 g/l penicilina (Sigma-Aldrich). As células foram cultivadas em monocamada com 10 ml de meio de cultura utilizando frascos descartáveis de 25cm² (Corning) a 36,5ºC em estufa de CO2 (Sanyo) em atmosfera de 5% de gás carbônico (CO2). A cada dois ou três dias, as células foram sub cultivadas, usando PBS para lavá-las e tripsina (solução 10x, Sigma-Aldrich) na proporção 1 tripsina: 9 PBS, para desprender as células da superfície interna do frasco de cultura. Após o desprendimento das células 1,5 ml de meio de cultura completo (suplementado com 10% de soro bovino fetal) foi adicionado ao frasco para inativação da tripsina e homogeneizado. Em seguida, 200 ul de células foram colocados em cultivo em novos frascos contendo 10 ml de meio de cultura completo e incubado a 36,5ºC. Para a realização dos ensaios, a linhagem celular escolhida (GM07492A) foi utilizada a partir da quarta passagem até a décima quarta passagem. 5. DESENVOLVIMENTO A atividade citotóxica na linhagem celular foi avaliada após 24 horas de tratamento. A metodologia empregada seguiu as orientações do fabricante com algumas modificações. O óleo essencial obtido das folhas dos limoeiros (C. aurantifolia e C. limonia) foi diretamente diluído em meio de cultura (HAM F10 + DMEM 1:1) suplemento com 10% de soro bovino fetal nas diferentes concentrações que variam de 19,53 a 2500 µg/ml. Para realização dos experimentos, 1x10³ células foram semeadas em microplacas contendo 96 poços. Em cada poço, o volume máximo foi de 100 µl de meio de cultura (HAM F10 + DMEM 1:1) suplementado com 10% de soro bovino fetal. Após 24 h, as culturas foram tratadas com as diferentes concentrações do produto natural acima descrito. Foram incluídos poços para grupos controles negativos (sem tratamento), solvente (DMSO 0,4%) e positivo (DMSO 25%). Em seguida, as placas foram incubadas a 36,5ºC por 24 horas. Passado o período de tratamento, o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas com 100 µl de PBS para retirada do tratamento evitando possíveis alterações no resultado e expostas a 100 µl de meio cultura HAM-F10 sem vermelho de fenol. Então, 25 µl de XTT foram adicionados em cada poço. As microplacas foram incubadas a 36,5ºC por 17h. As absorbâncias das amostras foram determinadas por meio de um leitor de

6 multiplacas (Elisa Asysm programa Microwin 2.000) no comprimento de onda de 450 nm e comprimento de referência de 620 nm. A quantidade de produto solúvel formado (formazan) foi proporcional ao número de células viáveis. Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados de IC50 (concentração que inibe 50% de crescimento) obtidos para GM07492A. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA). Em seguida foi utilizado o método Tukey para a comparação dos diferentes tratamentos. As diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando P < 0,05. Todas as análises foram realizadas no GraphPad Prisma, V RESULTADOS A técnica do ensaio colorimétrico do XTT consiste na absorção do sal pela membrana celular, o transporte até a membrana mitocondrial e a metabolização do sal de tetrazólio (3-[1- (fenil amino carbonil]-3,4-tetrazólio]-bis (4-metil-6-nitro) ácido benzeno sulfonato sódio hidratado) em formazan. É um ensaio recomendado para screenings complexos de substancias químicas por apresentar um índice confiável para avaliar atividade mitocondrial e, assim, a viabilidade e função celulares (10). Estudos sugerem que a redução do corante XTT ocorre na superfície da célula, quando que as oxirredutases mitocondriais contribuem para a resposta do sal. Assim, fica então postulado que o XTT é capaz de medir o estado redox de nucleotídeos de piridina na célula (9, 10), produzindo um formazan altamente colorido e alaranjado (11). Os resultados de viabilidade celular dos óleos essenciais pelo sal de XTT estão representados no gráfico 1. A partir dos resultados, foi realizado o cálculo do IC50 (concentração que inibe 50% de crescimento) expressos na Tabela 1.

7 Gráfico 1 Viabilidade celular de fibroblastos de pulmão de humano (GM07492A) tratadas com diferentes concentrações (µg/ml) de Citrus aurantifolia e Citrus limonia. Viabilidade celular (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Controle Negativo Controle Solvente 19,5 39,1 78,1 156,3 312,5 625,0 1250, ,0 Controle Positivo Citrus limonia Citrus aurantifolia Tabela 1. Valores de IC50 para linhagem celular (GMO7492A) obtidos após tratamento durante 24 horas com óleo essencial das folhas de C. aurantifolia e C. limonia. IC50 (µg/ml) Citrus aurantifolia 493,9 + 71,5 Citrus limonia 458,4 + 75,0 IC50 - concentração inibitória para 50% da célula

8 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS Em suma, com os resultados obtidos a partir do óleo essencial foi possível observar citotoxicidade sobre a linhagem celular testada (GMO7492A) em concentrações igual ou superiores a 625 µg/ml para os dois óleos avaliados. Os valores encontrados de IC50 foram de 493,9 µg/ml para o óleo essencial das folhas de C. aurantifolia e 458,4 µg/ml para C. limonia, sendo o C. aurantifolia relativamente mais toxico que C. limonia. 8. FONTES CONSULTADAS 1. Parkin, D. M.; Khlat, M. Studies of cancer in migrantis: rationale and methodology. European journal of cancer, Oxford, Bigio, Roberta Schein et al. Determinants of fruit and vegetable intake in adolescents using quantile regression. Rev. Saúde Pública [online]. 2011, 3. Chen, C.; Kong, A. N. Dietary cancer-chemopreventive compounds: from signaling and gene expression to pharmacological effects. Trends in Pharmacological Sciences, Amsterdan, Anand, P., Kunnumakara, A.B., Sundaram, C. et al. Cancer is a Preventable Disease that Requires Major Lifestyle Changes. Pharmaceutical Research, acessado em 01/ Morton, J Mandarin Lime. p In: Fruits of warm climates. Julia F. Morton, Miami, FL acessado m 01/09 8. Philips DH, Arlt VM. Genotoxicity: damage to DNA and its consequences. Experientia Supplementum, 2009, Marshall NJ, Goodwin CJ, Holt SJ. A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regulation, 1995.

9 10. Berridge MV, Herst PM, Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, Roehm NW, Rodgers GH, Hatfield SM, Glasebrook AL. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Imunological Methods, 1991.