UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias, rainhas virgens e rainhas fisogástricas de Melipona marginata Lepeletier, (Hymenoptera, Apinae, Meliponini) Maria Juliana Ferreira Caliman Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências - Área: Entomologia. RIBEIRÃO PRETO / SP 2008

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias, rainhas virgens e rainhas fisogástricas de Melipona marginata Lepeletier, (Hymenoptera, Apinae, Meliponini) Maria Juliana Ferreira Caliman Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Zucchi Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências - Área: Entomologia. RIBEIRÃO PRETO / SP 2008

3 FICHA CATALOGRÁFICA Ferreira-Caliman, Maria Juliana Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias, rainhas virgens e rainhas fisogástricas de Melipona marginata Lepeletier, (Hymenoptera, Apinae, Meliponini) Ribeirão Preto, Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto USP, Área de concentração: Entomologia. Orientador: Zucchi, Ronaldo 1. Insetos sociais. 2. Hidrocarbonetos cuticulares. 3. Meliponíneos. 4. Cromatografia gasosaespectrometria de massa.

4 Agradeço, Ao Prof Dr Ronaldo Zucchi pela oportunidade, paciência, orientação e amizade. Ao Sr. Sidnei Mateus, mestre e doutor em entomologia, especialista em laboratório de insetos, informalmente meu co orientador e principalmente meu grande amigo, pela ajuda incondicional durante a realização deste trabalho. À amiga Izabel Cristina Casanova Turatti, técnica do laboratório de química orgânica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, pela realização das amostras químicas. Ao amigo Prof. Dr. Fabio dos Santos Nascimento pela orientação durante a montagem do projeto e pelo incentivo durante a realização do mesmo. À CNPq pelo auxilio financeiro. Aos meus filhos, Letícia e Pedro, e ao meu esposo, Wellington, pelo carinho e pela paciência incondicionais durante a realização deste trabalho. Aos meus pais, Sônia e Assis, e à minha irmã, Silvia, que sempre estiveram comigo apesar da distância física que nos separa. À senhora Neuza Caliman por me ajudar sempre que necessário. À Gisele, amiga de todas as horas e ouvinte paciente, que sempre me confortou e me deu ânimo para continuar mesmo nas horas mais difíceis. À Patrícia, amiga que conquistei durante esse último ano e que desejo manter eternamente. Ao grande amigo Leo, sempre presente e dedicado. Ao colega de trabalho Túlio pelo auxílio durante a realização dessa dissertação e pela ajuda na correção da mesma. À amiga Cidinha pela amizade e por cuidar sempre com carinho de nosso ambiente de trabalho. A todos os colegas de laboratório: Cristiano, Michael Hncir, Denise, Plésio, Victor, Rafael, Ayrton, Elinton, Carolina, Janaina, Elynor, Marco, Cyro, Yara e em especial às amigas Giovanna e Juliana Alonso.

5 Thatʹs What It Takes (George Harrison) And now it begins to shine And you found the eyes to see Each little drop at dawn of every day Your smile, it comes back to me And whatever you may say Donʹt let it stop, never fade away As we got to get out in this world together, doesnʹt matter if we start to make some changes. If thatʹs what it takes Then Iʹve got to be strong Donʹt want to be wrong If thatʹs what it takes The closer I get Into that open door Iʹve got to be sure If thatʹs what it takes And now that itʹs shining through And you can see all this world Donʹt let it stop, never fade away If we got to be in this life forever, Then weʹd better be taking all the chances, If thatʹs what it takes

6 Ao senhor Cícero Caliman, exemplo de bondade e alegria, dedico.

7 Índice Resumo...1 Abstract...2 Introdução...3 Objetivos...7 Material e Métodos...8 Espécie e Colônias...8 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de operárias...8 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens...9 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas fisogástricas...9 Análise das amostras...10 Análises do desenvolvimento ovariano de rainhas virgens...11 Análise dos resultados...11 Resultados...13 Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias...13 Influência da origem da população sobre o perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias Composição cuticular de rainhas virgens...23 Composição cuticular de rainhas fisogástricas...29 Discussão e Conclusões...37 Bibliografia...42 Apêndice...48

8 Resumo Os feromônios desempenham um papel chave em muitos aspectos da vida dos insetos e os membros de uma colônia utilizam uma grande variedade de compostos químicos durante a sua existência. Os hidrocarbonetos cuticulares são importantes para os insetos sociais porque possibilitam o reconhecimento de coespecificos, companheiras de ninho, ou mesmo indivíduos de diferentes castas. O presente estudo teve como objetivos principais a caracterização das variações do perfil químico de operárias e de rainhas da abelha sem ferrão Melipona marginata, relacionando as com a idade e o comportamento apresentados pelos indivíduos. Para a identificação dos compostos cuticulares utilizou se cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa. A composição de hidrocarbonetos da cutícula dos indivíduos da espécie consistiu em alcanos, alcenos, alcadienos e alcanos ramificados, e variou de 21 até 33 átomos de carbono. Esses compostos variaram quantitativamente e qualitativamente entre e dentro das castas, de acordo com a idade dos indivíduos (exceto rainha fisogástrica). Os perfis cuticulares de operárias e rainhas virgens foram caracterizados principalmente por alcanos e alcenos, enquanto o de rainhas fisogástricas foi caracterizado por alcanos, alcenos, alcadienos e metil alcanos. O fator que mais influenciou o perfil cuticular das rainhas fisogástricas foi a ausência de postura. Além disso, observou se a existência de variações da composição química cuticular de acordo com a origem da população, ou seja, colônias provenientes de uma mesma região tiveram indivíduos com perfil de hidrocarbonetos semelhantes. 1

9 Abstract Pheromones play a key role in many aspects of the life of insects. Members of social insect colonies employ a large variety of chemical signals during their life. Among these, cuticular hydrocarbons are of primary importance for social insects since they allow the recognition of conspecifics, nestmates, or even members of different castes. The aims of the present work were (1) to characterize the variation of the chemical profile among workers, virgin queens, and physogastric queens of the stingless bee Melipona marginata, and (2) to investigate the dependence of the chemical profiles on the age and the behaviour of the studied individuals. The cuticular compounds were identified using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC MS). The cuticular hydrocarbon profile of M. marginata was composed of alkanes, alkenes, alkadienes and branched alkanes, varying from 21 to 33 carbons atoms. These compounds varied quantitatively and qualitatively within the investigated castes according to age of the respective individuals (except for the physogastric queens). The cuticular profiles of workers and virgin queens were characterized mainly by alkanes and alkenes, whereas the profiles of the physogastric queens were characterized by alkanes, alkenes, alkadienes and methil alkanes. The factor that predominantly influenced the cuticular profile of the physogastric queens was the absence/presence of oviposition. In addition to observed the variations within a colony, the cuticular chemical profile of M. marginata differed between different populations, that is, colonies originating from same region had individuals with similar hydrocarbon profiles, whereas those from different regions had not. 2

10 1 INTRODUÇÃO Aspectos Gerais do grupo Melipona. Os Meliponini correspondem ao grupo de abelhas sociais que não apresentam ferrão e encontram se amplamente distribuídos pelos trópicos e subtrópicos (Sakagami 1982). Entre esses insetos, a organização social avançada é evidenciada por uma complexidade de comportamentos que proporcionam às colônias uma unidade social coerente (e.g. processo de aprovisionamento e oviposição POP; revisado em Zucchi et al. 1999). As eussociedades de insetos são constituídas tipicamente por duas castas, sendo a rainha especializada em realizar a postura de ovos, e as operárias responsáveis pelas tarefas de manutenção do ninho (Michener 1974). Na maioria das espécies de abelha sem ferrão ocorre desenvolvimento dos ovários de operárias mesmo na presença da rainha (Sakagami et al. 1963), e esses ovos frequentemente são utilizados na alimentação da rainha fisogástrica (Sakagami & Zucchi 1963). Além disso, em algumas espécies de Melipona, ocorre a produção de machos pelas operárias durante certas fases de desenvolvimento da colônia (revisado por Velthuis et al 2005). As diferentes tarefas entre as operárias não estão rigidamente estabelecidas, mas freqüentemente ocorre uma tendência para a execução de atividades em certas idades (Wille 1983). Simões & Bego (1979) e Mateus et al. (2007) verificaram que as atividades desempenhadas por operárias de Scaptotrigona postica e Melipona marginata, respectivamente, modificam se de acordo com a idade dos indivíduos, havendo uma sequência de atividades desempenhadas pelas operárias. Dentre os Meliponini, as Melipona são caracterizadas pela ausência de células reais, ou seja, rainhas e operárias emergem de células de mesmo tamanho e forma (Sakagami 1982). Assim, a determinação de castas é realizada através de uma somatória de fatores genéticos e alimentares (Kerr 1950, Kerr & Nielsen 1966) e a produção de rainhas virgens pode chegar a 25% das fêmeas produzidas em colônias com boas condições de alimento (Kerr 1948). Embora essa proporção varie de acordo com a condição colonial, ocorre uma constante produção de rainhas virgens, fato que assegura a substituição da rainha em casos de orfandade (Michener 1974, Sakagami 1982, Engels & Imperatriz Fonseca 1990). 3

11 Entretanto, a produção excessiva de rainhas virgens pelas Melipona é o método mais dispendioso entre as abelhas eussociais (Michener 1974). Segundo Wenseleers & Ratnieks (2004) a expectativa de vida desses indivíduos é muito baixa, sendo quase todas mortas pelas operárias, com exceção dos casos de substituição da rainha fisogástrica ou de produção de enxame (Sakagami 1982). Certos comportamentos podem propiciar a sobrevida de rainhas virgens de algumas espécies, como andar rapidamente pela colônia e esconder se entre os potes e frestas da caixa, ambos observados em M. marginata por Kleinert & Imperatriz Fonseca (1994). Aspectos Ecológicos e Comportamentais dos Hidrocarbonetos cuticulares em Insetos Sociais. A comunicação recíproca de natureza cooperativa é um critério essencial para a manutenção da integridade das sociedades de insetos (Wilson 1971). Para tanto, são utilizados mecanismos que envolvem compostos químicos denominados feromônios e receptores olfativos amplamente distribuídos pelos apêndices, especialmente nas antenas (Atkins 1980). Estudos mostram que as respostas comportamentais dos insetos estão intimamente relacionadas às variações quantitativas e qualitativas dos feromônios no meio em que vivem (revisado por Howard & Blomquist 2005). No caso dos insetos sociais, grande parte dos estímulos químicos e conseqüentes respostas comportamentais ocorrem dentro da própria colônia, entre companheiras de ninho. Comportamentos que requerem dispersão rápida dos sinais químicos, como os de alarme, podem envolver feromônios constituídos por moléculas pequenas e que são altamente voláteis. Entretanto, os insetos sociais desenvolveram vários outros mecanismos de comunicação nos quais estão envolvidos compostos não voláteis como muitos hidrocarbonetos (revisado por Howard & Blomquist 2005). A cutícula dos insetos é revestida por hidrocarbonetos que oferecem uma barreira de proteção contra a desidratação (Lockey 1988). Durante o processo evolutivo, esses compostos foram sendo cada vez mais empregados para a comunicação, principalmente, entre os insetos sociais (Le Conte & Hefetz 2008). Howard & Blomquist (2005) consideram essa atuação secundaria dos hidrocarbonetos uma das razões da diversidade de compostos 4

12 cuticulares encontrados entre os grupos e as conseqüentes combinações altamente específicas. Os hidrocarbonetos cuticulares atuam como feromônios moduladores e desencadeadores de comportamentos. Segundo Wilson (1963), feromônios desencadeadores são aqueles que provocam mudanças imediatas e reversíveis no comportamento de outro organismo e moduladores são aqueles envolvidos em processos comportamentais a longo prazo. A ocorrência desses compostos mostra se característica entre os grupos de insetos (espécie ou colônia), podendo variar dentro deste de acordo com a idade, casta ou sexo dos indivíduos (Blonquist et al. 1998, Monnin & Peters 1999, Sledge et al. 2001) Estudos recentes mostram que os hidrocarbonetos presentes na cutícula de formigas Ponerine atuam em processos comportamentais como sinais de fertilidade e dominância (Le Conte & Hefetz 2008). Esses compostos agiriam como feromônios moduladores do comportamento, ou seja, sua produção durante a atividade ovariana de rainhas ou operárias férteis provocaria a inibição do desenvolvimento ovariano de outras operárias (revisado por Monnin 2006). Testes sobre a influência da presença da rainha no desenvolvimento ovariano de formigas mostram que a inibição só ocorre quando as operárias estão muito próximas da rainha, ou seja, por meio de feromônios de contato como, por exemplo, os hidrocarbonetos cuticulares (Liebig et al. 2000). Esse efeito modulador também foi observado em Bombus terrestris por Lopez Vaamonde et al. (2007). Os autores demonstraram que feromônios não voláteis inibem tanto o comportamento de postura de operárias quanto o desenvolvimento de outras rainhas em colônias da espécie. Entretanto, em muitas espécies de insetos sociais as operárias são capazes de modificar a razão sexual produzindo sua própria prole de machos (Velthuis et al. 2002, Tóth et al. 2002, Koedam et al. 2005, Ratnieks et al. 2006). Os hidrocarbonetos agem como feromônios desencadeadores em processos de reconhecimento de companheiras de ninho e de distinção de indivíduos intrusos (Breed 1983, Singer et al. 1998, Blomquist et al. 1998, Nunes 2008). Além disso, também são atribuídas a eles funções relacionadas à identificação dos indivíduos dentro da colônia, ou seja, a qual casta pertence, quais são os indivíduos geneticamente relacionados, qual a sua função na colônia e outras respostas comportamentais (Breed & Bennett 1987, Jungnickel et al. 2004). 5

13 Segundo Breed et al. (1995, 2004), os recém emergidos apresentam um perfil químico cuticular que será influenciado ao longo do tempo pelo contato destes com material do ninho onde se encontram. Abdalla et al. (2003) e Nunes et al. (2008) mostram que operárias de Melipona bicolor e Schwarziana quadripuntacta, respectivamente, apresentam variações na composição de hidrocarbonetos de acordo com a idade dos indivíduos. Gamboa et al. (1986) classificam os odores de reconhecimento presentes na superfície corporal de insetos sociais, de acordo com a sua origem, em ambientais e hereditários. Os ambientais seriam aqueles adquiridos pelos indivíduos a partir das condições ambientais como alimento e material levado para o ninho, e os hereditários estariam relacionados a fatores genéticos e fatores maternais não genéticos (extracromossomais). Deste modo, o perfil químico cuticular dos indivíduos de colônias sob condições idênticas pode convergir sob influência do meio ambiente comum, ou permanecerem diferenciados quando os odores endógenos (hereditários) prevalecerem sobre os primeiros. Sabe se que os perfis de hidrocarbonetos cuticulares das abelhas melíferas são, em grande parte, geneticamente determinados, atuando assim como pistas de reconhecimento entre subfamílias (Arnold et al. 2000). Os hidrocarbonetos cuticulares também fornecem pistas do status reprodutivo das rainhas em insetos sociais. Operárias de formigas são capazes de distinguir a produtividade e a idade das rainhas através de seus perfis de hidrocarbonetos (Hannonen et al. 2002). Dietemann et al. (2003) mostram que os hidrocarbonetos cuticulares também atuam no reconhecimento de operárias de formigas com atividade de postura. Sugere se ainda que haja uma correlação entre atividade ovariana e perfil de hidrocarbonetos cuticulares e que esse perfil seria utilizado por operárias para discriminarem fêmeas férteis de não férteis (Monnin et al. 1998, Peeters et al. 1999, Liebig et al. 2000, Cuvillier Hot et al. 2001, Sledge et al. 2001). Um dos fatores que influenciam a aceitação da rainha por uma colônia são os compostos que ela emite para comunicar sua presença (Breed 1981, Breed & Stiller 1992). Rainhas produzem e emitem numerosos compostos de glândulas e regiões de seus corpos que as operárias utilizam apara identificá la como rainha (Velthuis 1970). Acredita se que o grau de fertilidade possa variar entre as rainhas virgens de Melipona e que isso influenciaria no processo de escolha daquela acompanhará o enxame (Koedam et al. 1995a). Durante os ataques de operárias às rainhas virgens dessas abelhas o abdômen parece ser a parte mais 6

14 suscetível aos ataques (Silva 1972, Bego 1989). Cruz Landim (1967) e Mota (1988) mostraram que o abdômen dessas abelhas concentra um grande número de glândulas tegumentares. Os conhecimentos sobre as características dos hidrocarbonetos cuticulares em meliponíneos vêm crescendo nos últimos anos graças às descobertas de novas técnicas de extração e análise químicas. A cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa (CG MS) tem sido amplamente utilizada e, juntamente com o estudo do comportamento, vem fornecendo subsídios para o entendimento dos aspectos sociobiológicos desses insetos. OBJETIVOS O trabalho realizado teve por finalidade: A) Caracterizar os perfis de hidrocarbonetos cuticulares de operárias de Melipona marginata em três diferentes idades e verificar como o perfil químico cuticular varia entre populações de diferentes localidades; B) Caracterizar os perfis químicos cuticulares de rainhas virgens de diferentes idades, além de caracterizar o perfil quando estas estão envolvidas em dois diferentes comportamentos: sofrendo agressão por parte das operárias e agrupando se em um refúgio comum; C) Avaliar como o perfil químico de rainhas fisogástricas dessa espécie se apresenta em relação à idade e à atividade de postura. 7

15 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Espécie e colônias. A espécie Melipona marginata encontra se distribuída por todos os estados das regiões sudeste e sul, além do estado da Bahia (Silveira et al 2002). Possui nome popular de manduri, manduri menor, minduri, gurupu do miúdo ou taipeira (Nogueira Neto 1970). Para a caracterização do perfil químico cuticular de operárias e rainhas foram utilizadas quatro colônias provenientes de Cunha SP (colônias 1, 2, 4 e 5) e duas colônias provenientes de Itanhaém SP (colônias 3 e 6), mantidas no Laboratório de Ecologia e Evolução da FFCLRP USP em caixas de madeira com tampa de vidro e um tubo plástico transparente que possibilitou a conexão da colônia com o exterior do laboratório. As colônias foram alimentadas quando necessário com solução açucarada a 50% e, nos períodos de baixa temperatura, foram aquecidas em estufa à 28ºC. 2.2 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de operárias. Foi caracterizado o perfil de hidrocarbonetos de operárias de duas colônias provenientes de Cunha (Colônias 1 e 2) e uma colônia proveniente de Itanhaém (Colônia 3). A coleta dos indivíduos ocorreu sob as mesmas condições, durante o mesmo período, para que não houvesse influência no perfil relacionada às variações ambientais. Além disso, as colônias utilizadas já se encontravam instaladas no laboratório há mais de três meses, minimizando a possibilidade de influência de materiais coletados no local de origem. Para a amostragem de indivíduos com idade intermediária e idade avançada foram coletadas operárias com postura de ovo trófico e atividade no campo, respectivamente. Estima se, para a espécie, que a idade de operárias ovipositando (ovo trófico) seja de 9 a 10 dias de vida (Mateus et al. 2007). Para a coleta de operárias recém emergidas, foram separados favos de cada colônia e mantidos em incubadora BOD modelo MA 415 à 28ºC. Durante o estudo, algumas colônias passaram por orfandade, tendo sido observada neste período a postura por operárias. Na colônia 1 esse comportamento iniciou se 7 dias após a morte da rainha, sendo coletadas 10 operárias no momento seguinte à postura. A extração dos compostos ocorreu por meio de banhos em solvente apolar hexano (500μl) por um minuto. 8

16 A caracterização dos grupos amostrais fará referência à atividade que os indivíduos desempenhavam no momento da coleta, exceto para operárias recém emergidas. As operárias com postura de ovos tróficos (idade intermediária) serão caracterizadas como operárias com atividade no favo de cria e aquelas com postura na ausência da rainha como operárias poedeiras. As operárias mais velhas serão chamadas de campeiras. 2.3 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens. Para a caracterização do perfil cuticular de rainhas virgens foram utilizadas três colônias de M. marginata. Foram coletadas rainhas virgens recém emergidas (N=10 para uma colônia) e com 2 dias de idade (N=20 para a colônia 1 e N=15 para as colônias 2 e 3). Os favos de cria foram previamente retirados e mantidos em incubadora BOD modelo MA 415 à 28ºC e à medida que operárias e machos emergiam eram devolvidos para as colônias de origem. As rainhas virgens receberam marcação com tinta plástica (cuidadosamente retirada no momento da extração dos compostos) e mantidas juntamente com o favo até o terceiro dia de vida quando foram coletadas e congeladas para análise dos compostos cuticulares. Além da caracterização do perfil de acordo com a idade caracterizou se o perfil de rainhas virgens envolvidas em dois diferentes comportamentos. Foram coletadas 7 rainhas virgens agrupadas em um refúgio comum (entre o cerúmen depositado no vidro da caixa de observação) e outras 10 no momento em que eram agredidas pelas operárias. As rainhas desse último grupo apresentavam abdômen inflado, característica de rainhas virgens desta e de outras espécies de Melipona durante a execução (Imperatriz Fonseca e Zucchi 1995, van Veen et al. 1999). Os compostos cuticulares foram extraídos por meio de banhos em solvente apolar hexano (500 μl) por 1 minuto. 2.4 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas fisogástricas. Todas as amostras do perfil químico de rainhas fisogástricas foram obtidas através da técnica não destrutiva de micro extração em fase sólida (SPME), de modo que elas permanecem ativas no ninho após a coleta das amostras. A extração de hidrocarbonetos 9

17 ocorreu por meio do contato e leve fricção de fibra de polidimetilsiloxano SUPELCO (30 μm bounded) por cerca de 10 segundos no abdômen dessas rainhas. Foram coletadas amostras de rainhas com produtividade considerada com freqüência normal para essas colônias, além daquelas que, em alguns períodos do ano permaneceram sem ovipositar. Em determinada fase de desenvolvimento das colônias 5 e 6, as rainhas não eram vistas sob o favo de cria, sugerindo inclusive que as colônias estivessem órfãs. Entretanto, eventualmente passou se a observá las caminhando sob os potes de alimento e invólucro do favo de cria. Nesse período não houve construção de células pelas operárias. Foram coletadas amostras da composição de hidrocarbonetos cuticulares dessas rainhas durante esse período. A rainha da colônia 5 também foi analisada após a retomada da atividade de postura (54 dias), sendo que a rainha da colônia 6 morreu 35 dias após reiniciar essa atividade. Uma vez que as 2 rainhas já haviam sido analisadas quando ovipositavam normalmente, puderam se comparar as mudanças no perfil químico durante as diferentes situações de postura. Para análise da variação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das rainhas fisogástricas em relação à idade realizou se a amostragem dos compostos cuticulares no 6º, 32º e 65º dia após o início da atividade de postura de uma rainha. As rainhas das 6 colônias foram analisadas, sendo que para três colônias obtiveramse amostras de rainhas sucessoras (Colônia 1, Colônia 2 e Colônia 5). As análises realizadas com o método SPME possibilitam, além da manutenção do indivíduo na colônia, a coleta gradual de amostras. Entretanto, apenas uma pequena fração da cutícula desse indivíduo é amostrada, diferente do que obtem se com técnicas que utilizam solventes. Deste modo, duas rainhas foram analisadas por meio de banhos em hexano (500 μl) por 1 minuto a fim de se comparar os resultados obtidos pelas duas diferentes técnicas, além de utilizar esse perfil para comparar a composição de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens e rainhas fisogástricas. 2.5 Análise das amostras. As amostras diluídas em hexano e as fibras de polidimetilsiloxano foram levadas para análise no Laboratório de Produtos Naturais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, local onde se encontra instalado um sistema 10

18 de Cromatografia Gasosa acoplado à Espectrometria de Massas SHIMADZU, modelo GCMS QP2010, equipado com coluna DB 5MS 30m e hélio como gás carreador à 1 ml/min, utilizando o método ionização eletrônica (EI). O protocolo de temperatura usado foi: 150 o C 280 o C a uma taxa de 3 o C/min (mantido 15 minutos). Análises são feitas em modo splitless. 2.6 Análises do desenvolvimento ovariano de rainhas virgens. Após a obtenção dos compostos cuticulares, as rainhas virgens foram dissecadas para a caracterização do desenvolvimento ovariano. Foi utilizada Lupa LEICA modelo DFC 500 acoplada a um microcomputador contendo um programa de captura de imagem IM50 Versão 4.0 (Leica Microsystens Imaging Solutions Ltd). Não foram avaliados os diferentes graus de desenvolvimento dos ovários, sendo classificado como presente a partir do estágio inicial de desenvolvimento. 2.7 Análise dos resultados. Os dados obtidos foram analisados com o auxílio do programa GCMSsolutions for Windows (Shimadzu Corporation). Os cromatogramas apresentaram vários picos cromatográficos em diferentes posições devido aos diferentes tempos de retenção (TR) de cada soluto na coluna cromatográfica. Cada pico cromatográfico, por sua vez, contém todas as informações obtidas pelo espectrômetro de massa. A quantificação foi realizada com base nas áreas de pico obtidas pelos cromatogramas (Singer & Espelie 1992). Após detectar possíveis contaminantes da amostra, como ftalato (composto proveniente do plástico) as concentrações relativas foram ajustadas. Substâncias presentes em menos de quatro indivíduos foram representadas como traços nas tabelas de concentrações relativas. Utilizou se análise estatística multivariada para comparar os grupos experimentais. Análise dos principais componentes (PCA) foi usada para definição dos principais picos de compostos a serem comparados. Posteriormente, análise discriminante stepwise foi utilizada para se contrastar o perfil químico dos grupos experimentais. Substâncias ausentes na maior parte dos indivíduos de um grupo foram excluídas das analises estatísticas. Os compostos 11

19 apontados pela análise dos componentes principais como responsáveis por menos de 5% de contribuição para os dois primeiros fatores dessa análise não foram utilizados na análise discriminante, sendo as porcentagens dos compostos utilizados reajustadas para 100%. Para se evitar erros na composição dos dados amostrais (Aitchison 1986), a área de cada pico apontado pelo cromatograma foi transformado de acordo com a seguinte fórmula: Z = ln [ Ap / g (Ap) ] onde, Ap é a área do pico, g (Ap) é a média geométrica do pico em cada grupo de operárias e Z é a área transformada do pico. Todas as os testes estatísticos dessa dissertação foram feitos com auxílio do pacote Statistica for Windows 7.0 (Statsoft, inc). 12

20 3 RESULTADOS 3.1 Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias em relação à idade. Os resultados mostram que as operárias das três colônias analisadas possuem composição cuticular semelhante quanto à diversidade de hidrocarbonetos. Os hidrocarbonetos variaram entre o C22 e o C31, sendo os mais representativos os alcanos, seguidos de alcenos e, em menor freqüência, alcadienos. Observa se que alguns compostos estão presentes somente em uma ou duas faixas etárias das operárias. As recém emergidas foram caracterizadas pela presença do heneicosano e ausência dos alcadienos (ZZ nonacosadieno e ZZ hentriacontadieno). As operárias do favo, de modo geral, apresentaram a maior variedade de compostos. As operárias campeiras caracterizam se principalmente pela ausência do octacosano. Tricosano e pentacosano foram os compostos que aumentaram a concentração relativa durante a idade das operárias nas três colônias analisadas. Colônia 1 As operárias da colônia 1 apresentaram um total de 23 hidrocarbonetos, sendo a maioria alcenos e alcanos (tabela 1). Aqueles com maior representatividade durante toda a fase de vida das operárias foram: tricosano, pentacosano, Z heptacoseno (Tempo de Retenção 33,295), heptacosano e Z nonacoseno (TR 38,016). Foram analisados 4 grupos de operárias desta colônia, entretanto, as operárias com postura de ovo na ausência da rainha (operárias poedeiras) não foram coletadas sob as mesmas condições que os outros 3 grupos. Assim, estas não foram utilizadas para efeito de análise da ocorrência dos compostos na cutícula das operárias ao longo do tempo. O perfil de hidrocarbonetos dessas operárias apresentou se bem diferenciado daquele caracterizado para operárias ovipositando na presença da rainha, com variação em quase todos os compostos. Entre os 3 grupos restantes o Z pentacoseno (TR 28,453) aumentou sua concentração relativa enquanto outros compostos foram perdidos gradativamente com a idade da operária, como o Z heptacoseno (TR 33,295) e Z hentriaconteno (TR 42,350). O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 52,60% da variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 13

21 83,33% e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 96,13% dessa variação. A análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk s Lambda= 0,00016; F 21,66 = 63,933; p < 0,001). Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos foram: tricosano, tetracosano, Z pentacoseno (TR 28,253), Z pentacoseno (TR 28,453), pentacosano, Z heptacoseno (TR 33,295), heptacosano e Z nonacoseno (TR 38,016). Tabela 1: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de operárias recém emergidas (ORE), com atividade no favo de cria (OF), operária ovipositando na ausência da rainha (OP) e com atividades no campo (OC) de Melipona marginata COLÔNIA 1 (Cunha-SP). Tempo de Retenção Hidrocarboneto ORE (n=10) OF (n=10) OP (n=10) 18,200 Heneicosano 1,05 ± 0,333 OC (n=10) 23,708 Tricosano 17,40 ± 4,41 14,13 ± 6,48 8,46 ± 12,449 23,40 ± 2,56 26,385 Tetracosano 0,40 ± 0,10 0,54 ± 0,16 0,88 ± 0,083 28,253 Z Pentacoseno 1,22 ± 0,73 1,14 ± 1,573 1,03 ± 0,23 28,453 Z Pentacoseno 1,56 ± 0,59 2,90 ± 0,68 5,01 ± 1,04 28,975 Pentacosano 14,09 ± 1,11 25,46 ± 3,86 22,33 ± 8,947 26,73 ± 3,28 31,497 Hexacosano 0,45 ± 0,14 0,47 ± 0,10 2,16 ± 1,376 33,163 Z Heptacoseno 0,71 ± 0,10 3,77 ± 1,530 33,295 Z Heptacoseno 29,29 ± 5,28 7,28 ± 2,09 1,82 ± 0,619 6,53 ± 1,33 33,477 Z Heptacoseno 0,56 ± 0,55 2,17 ± 1,01 0,46 ± 0,400 2,37 ± 0,47 33,935 Heptacosano 9,16 ± 1,59 11,43 ± 3,08 17,1 ± 7,086 7,90 ± 0,85 36,423 Octacosano 0,55 ± 0,18 0,74 ± 0,54 6,41 ± 3,727 37,838 ZZ Nonacosadieno 4,75 ± 2,04 6,06 ± 3,510 37,909 ZZ Nonacosadieno 5,70 ± 1,76 4,79 ± 1,889 4,28 ± 0,96 38,016 Z Nonacoseno 17,06 ± 1,36 0,72 ± 0,26 8,06 ± 4,276 4,23 ± 0,81 38,192 Z Nonacoseno 0,95 ± 0,38 1,70 ± 1,021 0,66 ± 0,16 38,589 Nonacosano 1,09 ± 0,31 5,00 ± 1,41 5,41 ± 2,522 3,68 ± 1,04 41,977 ZZ Hentriacontadieno 0,55 ± 0,14 0,61 ± 0,530 0,68 ± 0,19 42,122 ZZ Hentriacontadieno 8,53 ± 2,57 8,58 ± 3,135 6,57 ± 1,40 42,350 Z Hentriaconteno 4,56 ± 0,63 1,14 ± 0,34 3,71 ± 2,022 42,442 Z Hentriaconteno 0,80 ± 0,18 42,962 Z Hentriaconteno 2,40 ± 0,69 2,16 ± 1,138 43,177 Hentriacontano 3,40 ± 0,750 1,43 ± 0,34 A classificação da matriz apontou um total de 100% de correta alocação das operárias dentro do grupo previsto. A tabela 2 e a figura 1 ilustram os resultados da análise discriminante e canônica, respectivamente, para todas as combinações entre diferentes idades. 14

22 Tabela 2: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de operárias da colônia 1. ORe-operária recém emergida, OF-operária do favo, OC-operária campeira, OP-operária poedeira (na ausência da rainha) Combinações Distância de Mahalanobis F 7,23 P ORe x OF 788,82 378,52 < 0,001 ORe x OC 855,14 430,61 < 0,001 ORe x OP 582,85 226,31 < 0,001 OF x OC 13,92 7,47 < 0,001 OF x OP 178,05 72,62 < 0,001 OC x OP 278,35 118,26 < 0,001 8 Raiz 1 vs. Raiz Raiz ORe OF -12 OC OP Raiz 1 Figura 1: Gráfico do resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de M. marginata, Colônia 1. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária do Favo (com postura de ovo trófico), OC- Operária Campeira, OP- Operária poedeira (produzindo machos na ausência da rainha). Colônia 2 As operárias da colônia 2 apresentaram um total de 25 hidrocarbonetos (tabela 3). Aqueles com maior representatividade durante toda a fase de vida das operárias foram: tricosano, pentacosano, heptacosano e Z hentriaconteno (TR 42,350). 15

23 Tabela 3: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de operárias recém emergidas (ORE), com atividade no favo de cria (OF) e com atividades de campo (OC) de Melipona marginata COLÔNIA 2 (Cunha-SP). Tempo de Retenção Hidrocarboneto ORE (n=10) OF (n=10) 18,200 Heneicosano 0,97 ± 0,28 OC (n=10) 23,142 Z Tricosene 1,64 ± 0,99 2,88 ± 0,45 23,708 Tricosano 13,33 ± 2,47 13,31 ± 8,99 18,94 ± 1,52 26,385 Tetracosano 0,37 ± 0,06 0,95 ± 0,07 28,253 Z Pentacoseno 1,31 ± 0,33 0,81 ± 0,28 1,70 ± 0,33 28,453 Z Pentacoseno 1,19 ± 0,26 4,52 ± 2,07 7,04 ± 0,51 28,975 Pentacosano 14,40 ± 1,49 20,51 ± 6,70 25,87 ± 1,72 31,497 Hexacosano 0,37 ± 0,06 0,39 ± 0,08 0,34 ± 0,06 33,163 Z Heptacoseno 0,68 ± 0,09 0,89 ± 0,80 1,02 ± 0,54 33,295 Z Heptacoseno 29,17 ± 2,13 0,75 ± 0,55 0,79 ± 0,18 33,477 Z Heptacoseno 0,69 ± 0,09 3,28 ± 0,71 3,83 ± 0,44 33,935 Heptacosano 8,38 ± 1,55 7,65 ± 3,52 5,47 ± 0,67 36,423 Octacosano 0,63 ± 0,17 0,61 ± 0,44 37,838 ZZ Nonacosadieno 0,85 ± 0,64 0,75 ± 0,47 37,909 ZZ Nonacosadieno 0,88 ± 0,56 0,96 ± 0,31 38,016 Z Nonacoseno 16,93 ± 1,28 0,70 ± 0,71 0,61 ± 0,56 38,192 Z Nonacoseno 0,64 ± 0,08 9,40 ± 3,07 13,30 ± 1,99 38,589 Nonacosano 1,61 ± 0,35 2,62 ± 1,48 1,93 ± 0,60 41,977 ZZ Hentriacontadieno 1,08 ± 0,46 1,00 ± 0,19 42,122 ZZ Hentriacontadieno 0,79 ± 0,36 0,70 ± 0,15 42,350 Z Hentriaconteno 8,16 ± 0,93 3,12 ± 2,00 2,59 ± 0,70 42,442 Z Hentriaconteno 1,61 ± 1,21 42,647 Z Hentriaconteno 0,88 ± 0,46 0,62 ± 0,28 42,962 Z Hentriaconteno 3,17 ± 1,39 4,37 ± 0,41 43,177 Hentriacontano 0,57 ± 0,15 2,26 ± 0,89 1,64 ± 0,37 Assim como entre as operárias da colônia 1, os compostos Z pentacoseno (TR 33,477) e Z nonacoseno (TR 38,192) aumentaram as concentrações relativas enquanto outros compostos foram sendo perdidos gradativamente com a idade: Z heptacoseno (TR 33,295), heptacosano, Z nonacoseno (TR 38,016) e Z hentriaconteno (TR 42,350). O grupo das operárias recém emergidas foi aquele que apresentou menor variedade de hidrocarbonetos em relação àquelas com idade mais avançada. O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 65,74% da variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 86,80% 16

24 e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 97,90% dessa variação. A análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk s Lambda= 0,00052; F 10,42 = 180,56; p < 0,001). Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos foram: tricosano, pentacoseno (TR 28,453), pentacosano, Z heptacoseno (TR 33,295), heptacosano, Z nonacoseno (TR 38,016 e TR 38,192), nonacosano e Z hentriaconteno (TR 42,962). A figura 2 ilustra os resultados da análise canônica entre os grupos. A tabela 4 mostra o resultado da análise discriminante para todas as combinações possíveis entre os grupos analisados. A classificação da matriz apontou um total de 100% de correta alocação dos indivíduos. 10 Raiz 1 vs. Raiz Raiz ORe OF OC Raiz 1 Figura 2: Gráfico do resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de M. marginata, Colônia 2. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária com atividade no favo de cria, OC- Operária Campeira. 17

25 Tabela 4: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de operárias da colônia 2. ORe-operária recém emergida, OF-operária com atividade no favo de cria OC-operária campeira Combinações Distância de F 5,21 P Mahalanobis ORe x OF 544,68 406,69 < 0,001 ORe x OC 601,84 505,55 < 0,001 OF x OC 71,49 53,37 < 0,001 Colônia 3 As operárias dessa colônia apresentaram menor variedade de hidrocarbonetos em relação às colônias 1 e 2, totalizando 19 compostos (tabela 5). Aqueles com maior representatividade durante toda a fase de vida das operarias foram: tricosano, pentacosano, Z heptacoseno (TR 33,295), heptacosano e Z nonacoseno (TR 38,192). Os compostos que foram sendo perdidos gradativamente com a idade da operária foram: Z heptacoseno (TR 33,295), octacosano, Z nonacoseno (TR 38,192) e Z hentriaconteno (TR 42,442). O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 51,90% da variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 73,85% e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 89,51% dessa variação. A análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk s Lambda= 0,00149; F 10,42 = 104,46; p < 0,001). Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos foram: tricosano, pentacoseno, pentacosano, Z heptacoseno (TR 33,500), Z nonacoseno (TR 38,069). A classificação da matriz apontou que todos os grupos são significativamente separados entre si, sendo 100% de correta alocação dos indivíduos. A tabela 6 mostra o resultado da análise discriminante para todas as combinações entre os grupos analisados. A Figura 3 mostra o resultado da analise canônica entre as operárias da colônia 3. 18

26 Tabela 5: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de operárias recém emergidas (ORE), com atividade no favo de cria (OF) e com atividades de campo (OC) de Melipona marginata COLÔNIA 3 (Itanhaém-SP). Tempo de Hidrocarboneto ORE OF OC Retenção (n=10) (n=10) (n=10) 18,200 Heneicosano 0,83 ± 0,41 23,708 Tricosano 12,20 ± 2,20 7,26 ± 1,89 13,45 ± 2,33 26,385 Tetracosano 0,34 ± 0,05 0,48 ± 0,11 0,87 ± 0,06 28,253 Z Pentacoseno 1,09 ± 0,42 2,10 ± 0,62 1,94 ± 0,29 28,975 Pentacosano 12,22 ± 1,46 17,38 ± 2,53 27,88 ± 1,26 31,497 Hexacosano 0,47 ± 0,12 0,55 ± 0,10 0,85 ± 0,12 33,163 Z Heptacoseno 0,33 ± 0,11 1,89 ± 0,28 1,17 ± 0,27 33,295 Z Heptacoseno 32,56 ± 3,74 12,06 ± 1,78 10,37 ± 1,30 33,477 Z Heptacoseno 0,23 ± 0,03 33,935 Heptacosano 11,74 ± 4,26 10,41 ± 1,38 15,46 ± 2,21 36,423 Octacosano 0,78 ± 0,46 0,44 ± 0,09 38,016 Z Nonacoseno 0,52 ± 0,12 9,08 ± 2,25 4,59 ± 0,91 38,192 Z Nonacoseno 19,53 ± 2,13 8,44 ± 2,18 5,50 ± 0,57 38,589 Nonacosano 1,73 ± 1,01 1,73 ± 0,34 2,56 ± 0,60 41,977 ZZ Hentriacontadieno 3,83 ± 0,63 1,86 ± 0,23 42,122 ZZ Hentriacontadieno 2,69 ± 0,50 1,76 ± 0,29 42,350 Z Hentriaconteno 0,32 ± 0,34 1,36 ± 0,75 0,97 ± 0,29 42,442 Z Hentriaconteno 5,95 ± 0,94 1,45 ± 0,94 0,67 ± 0,28 43,177 Hentriacontano 0,42 ± 0,215 0,82 ± 0,326 0,39 ± 0,124 Tabela 6: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de operárias da colônia 3. ORe-operária recém emergida OF-operária com atividade no favo de cria OC-operária campeira Combinações Distância de F 5,21 P Mahalanobis ORe x OF 517,95 391,57 < 0,001 ORe x OC 592,58 471,56 < 0,001 OF x OC 23,34 18,57 < 0,001 19

27 5 Raiz 1 vs. Raiz Raiz Raiz 1 ORe OF OC Figura 3: Gráfico do resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de M. marginata, Colônia 3. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária com atividade no favo de cria, OC- Operária Campeira. Caracterização geral das operárias em relação à atividade desempenhada no momento da coleta. A partir dos dados obtidos para cada colônia individualmente realizou se a análise estatística para verificar a semelhança entre os indivíduos, independente de sua colônia de origem. Os resultados mostram que as operárias estão separadas significativamente em grupos de acordo com a idade (e conseqüente atividade). A análise dos componentes principais (PCA) descreveu 48,09% (Fator 1), 71,30% (Fator 1 + Fator 2) e 83,20% (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3). A análise discriminante stepwise dos compostos separou os grupos de operárias recém emergidas, com atividade no favo de cria e coma atividade no campo (Modelo Global: Wilk s Lambda= 0,00361; F 14,154 = 171,95; p < 0,001), sendo os compostos responsáveis pela separação: tricosano, pentacoseno (TR 28,253), pentacosano, Z heptacoseno (TR 33,477), Z nonacoseno (TR 38,016) e o hentriaconteno (TR 42,350). 20

28 As análises estatísticas mostram que, mesmo pertencendo a três diferentes colônias, as operárias apresentam se caracterizadas pela atividade que desempenham, sendo 100%; 95,60% e 90% de correta alocação para recém emergidas, operárias com atividade no favo e campeiras, respectivamente. O valor esperado para uma distribuição ao acaso é de 33,33%. A tabela 7 e a figura 4 ilustram os resultados das análises discriminante e canônica obtidos, respectivamente. 6 Raiz 1 vs. Raiz Raiz ORe -4 OF OC Raiz 1 Figura 4: Resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de três colônias de M. marginata. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária com atividade no favo de cria, OC- Operária Campeira. 21

29 Tabela 7: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares das operárias de três colônias de M. marginata. ORe-operária recém emergida OF- operaria com atividade no favo de cria OC- operária do campo Combinações Distância de F 7,77 P Mahalanobis ORe x OF 90,41 167,54 < 0,001 ORe x OC 260,07 508,25 < 0,001 OF x OC 83,28 156,84 < 0, Influência da origem da população sobre o perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias. Todos os grupos amostrais de operárias foram comparados entre si para a verificação da influência da origem da população sobre o perfil de hidrocarbonetos cuticulares. Os resultados mostram que os perfis das operárias das colônias 1 e 2 provenientes de Cunha SP são mais próximos entre si do que em relação à colônia 3, originaria de Itanhaém SP (tabela 8), sendo bem evidente entre as operárias recém emergidas e do campo. A tabela 9 mostra a classificação da matriz e a figura 5 ilustra o resultado da análise canônica. A análise dos componentes principais (PCA) descreveu 53,44% (Fator 1), 72,82% (Fator 1 + Fator 2) e 84,98% (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3). Tabela 8 :Distâncias de Mahalanobis entre as colônias 1, 2 e 3. ORe-operária recém emergida, OF-operaria com atividadede no favo de cria, OC-operária campeira Grupos Distâncias de Mahalanobis F 8,70 p ORe1 x ORe 2 16,814 9,55 < 0,001 ORe 1 x ORe 3 101,135 54,43 < 0,001 ORe 2 x ORe 3 130,164 70,06 < 0,001 OF 1 x OF 2 187,863 96,06 < 0,001 OF 1 x OF 3 194,080 99,24 < 0,001 OF 2 x OF 3 177,638 90,83 < 0,001 OC 1 x OC 2 20,516 11,65 < 0,001 OC 1 x OC 3 210, ,67 < 0,001 OC 2 x OC 3 191, ,85 < 0,001 Tabela 9: Classificação da matriz das operárias de acordo com atividade e colônia de origem. Valor esperado para distribuição ao acaso=11,12%. Grupo Amostral Porcentagem de correta alocação ORe col 1 ORe col 2 ORe col 3 OF col 1 OF col 2 OF col 3 OC col 1 OC col 2 OC col 3 100% 100% 100% 88,9% 100% 87,50 100% 100% 100% 22

30 10 Scatterplot (Spreadsheet10 10v*86c) Var ORe col 1 OF col 1 OC col 1 ORe col 2 OF col 2 OC col 2 ORe col 3 OF col 3 OC col 3 Var2 Figura 5: Gráfico do resultado da análise canônica entre operárias das 3 colônias de M.marginata. ORe-recém emergida, OF-operária do favo, OC-operária campeira, Col- colônia Composição cuticular de rainhas virgens A análise dos compostos cuticulares de rainhas virgens mostrou que, assim como ocorre em operárias, existe uma modificação no perfil de hidrocarbonetos em relação à idade dos indivíduos. Os hidrocarbonetos encontrados apresentaram de 23 a 33 átomos de carbonos e cada grupo de rainha foi caracterizado por apresentar formas diferentes destes compostos (tabela 10). As recém emergidas foram caracterizadas pela baixa presença de alcadienos (somente traços) e pela pouca diversidade dos alcenos, sendo os alcanos: tricosano, pentacosano, heptacosano, nonacosano e hentriacontano, e três alcenos Z heptacoseno (TR ), Z nonacoseno (TR ) e Z hentriaconteno (TR ) os compostos com maior concentração relativa. 23

31 As rainhas virgens com 2 dias de idade apresentaram maior diversidade de compostos em relação àquela encontrada em recém emergidas. Estão presentes na cutícula desses indivíduos principalmente alcanos seguidos por alcenos, sendo que não foram encontrados hidrocarbonetos metilados e somente um alcadieno, este último em concentrações muito baixas em duas das três colônias. Os hidrocarbonetos com maior representatividade nesses grupos foram: Tricosano, Pentacosano, Heptacosano, Nonacosano, Z Heptacoseno (TR ), Z Nonacoseno (TR ) e Z Hentriaconteno (TR ). A composição de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens coletadas em um refúgio comum mostra que estas apresentam perfis semelhantes aquele encontrado em rainhas com dois dias de vida, exceto pela alta concentração de Z nonacoseno (TR ) e Z heptacoseno (TR ). As rainhas coletadas no momento em que eram agredidas pelas operárias apresentaram maior diversidade de hidrocarbonetos em relação àquelas recém emergidas e com 2 dias de vida. Além dos alcanos e alcenos, foram encontrados alcanos metilados e alcadienos, além de uma maior variedade de alcenos. Os compostos mais representativos foram os mesmos encontrados nas recém emergidas e com dois dias, além do Z heptacoseno (TR ), Z nonacoseno (TR e TR ), Z hentriaconteno (TR ) e Z hentriaconteno (TR ). Esse grupo foi bem caracterizado pela presença de alcenos e alcadienos de cadeia longa (C29, C31 e C33) e por alcanos metilados (C27 e C29). As análises estatísticas revelaram que os grupos de rainhas virgens com 2 dias estão significativamente separados por colônias, sendo 95%, 61,54% e 100% de correta alocação dos indivíduos nas colônias 1, 2 e 3, respectivamente. O esperado em uma distribuição ao acaso para três grupos é de 33,3%. Os compostos responsáveis por essa separação foram: tricosano, pentacosano, Z heptacoseno (TR ), heptacosano, nonacosano e Z hentriacontene (TR ). O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 46,39% da variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 67,80% e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 80,97% dessa variação. A análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk s Lambda= 0,05635; F 10,58 = 18,634; p < 0,001). 24

32 Tabela 10: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens de Melipona marginata. Re-recém emergida. TR Hidrocarboneto Re Col 1 (N=10) 2 dias Col 1 (N=20) 2 dias Col 2 (N=15) 2 dias Col 3 (N=15) Refugiadas Col 2 (N=7) Heneicosano 0,63 ± 0,294 0,72 ± 0,368 1,37 ± 0,228 0,56 ± 0,191 0,61 ± 0,466 Agredidas Col 1 (N=14) Z Tricoseno 0,18 ± 0, Z Tricoseno 0,17 ± 0, Tricosano 8,93 ± 2,774 6,96 ± 3,40 12,53 ± 8,44 11,1 ± 2,506 6,37 ± 3,713 3,96 ± 2, Tetracosano 0,36 ± 0,223 0,10 ± 0,193 0,31 ± 0,078 0,17 ± 0, Z Pentacoseno 0,27 ± 0, Z Pentacoseno 0,87 ± 0,402 0,47 ± 0,226 1,60 ± 2,358 1,00 ± 0,425 0,72 ± 0,53 0,61 ± 0, Z Pentacoseno 1,47 ± 0,426 1,06 ± 0,391 0,83 ± 0,486 1,17 ± 0,578 0,78 ± 0, Pentacosano 10,9 ± 2,247 8,94 ± 2,246 12,5 ± 2,20 13,36 ± 2,17 9,74 ± 2,74 10,7 ± 4, ? 0,31 ± 0,195 0,10 ± 0, Hexacosano 0,56 ± 0,277 0,42 ± 0,166 0,35 ± 0,101 0,27 ± 0,086 1,39 ± 0, ? 0,43 ± 0,107 0,38 ± 0,212 0,36 ± 0, ZZ Heptacosadieno 0,46 ± 0,08 0,48 ± 0, ZZ Heptacosadieno traços 0,24 ± 0, Z Heptacoseno 1,13 ± 2,365 0,58 ± 0,258 0,49 ± 0,141 5,02 ± 3, Z Heptacoseno 0,66 ± 0, Z Heptacoseno 29,25 ± 0,22 23,4 ± 8,184 33,04 ± 9,22 35,61± 6,01 18,86 ± 16,1 11,1 ± 7, Z Heptacoseno 1,10 ± 0,824 1,11 ± 0,432 0,59 ± 0,244 0,47 ± 0,200 10,58 ± 12,5 0,92 ± 1, Heptacosano 10,76 ± 3,44 13,11 ± 5,84 11,26 ± 7,02 10,53 ± 4,28 13,4 ± 5,75 16,47 ± 3, Metil Heptacosano 1,37 ± 1,105 0,24 ± 0, Metil Heptacosano traços 0,19 ± 0, Octacosano 0,63 ± 0,149 1,03 ± 0,792 0,53 ± 0,192 0,50 ± 0,215 1,51 ± 0,826 0,25 ± 0, ZZ Nonacosadieno 0,61 ± 0,366 0,77 ± 0, ZZ Nonacosadieno 0,57 ± 0,301 traços 0,55 ± 0, ZZ Nonacosadieno traços 0,34 ± 0,091 traços 0,51 ± 0, Z Nonacoseno 0,93 ± 0,409 traços traços 0,77 ± 0,114 traços 3,49 ± 2, Z Nonacoseno traços 0,48 ± 0,125 0,78 ± 0,205 traços 5,81 ± 3, Z Nonacoseno 19,2 ± 2,27 16,63 ± 4,24 15,6 ± 3,491 16,45 ± 2,61 15,5 ± 7,525 10,32 ± 7, Z Nonacoseno 1,06 ± 0,423 1,59 ± 0,952 0,95 ± 0,795 9,22 ± 7,56 2,34 ± 2, Z Nonacoseno traços 1,06 ± 0,459 1,43 ± 0,08 2,04 ± 2, Nonacosano 4,93 ± 3,613 6,25 ± 3,824 4,81 ± 4,503 1,66 ± 1,307 6,94 ± 4,67 7,89 ± 9, Metil Nonacosano 0,30 ± 0, ZZ Hentriacontadieno 4,395 ± 5,36 traços 0,69 ± 0, ZZ Hentriacontadieno traços 1,10 ± 0, ZZ Hentriacontadieno traços traços traços 0,61 ± 0, ZZ Hentriacontadieno traços traços 1,09 ± 0,306 0,91 ± 1,316 0,41 ± 0, Z Hentriaconteno 8,25 ± 1,355 8,47 ± 3,064 5,88±1,815 4,42 ± 1,318 traços 6,94 ± 3,913 25