Divisão de trabalho e sua relação com a dinâmica dos hidrocarbonetos cuticulares em Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Divisão de trabalho e sua relação com a dinâmica dos hidrocarbonetos cuticulares em Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) Danielle Caroline de Jesus Santos Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia. Ribeirão Preto SP 2013

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Divisão de trabalho e sua relação com a dinâmica dos hidrocarbonetos cuticulares em Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) Danielle Caroline de Jesus Santos Orientador: Fábio Santos do Nascimento Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia. Ribeirão Preto SP 2013

3 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho por qualquer meio convencional ou eletrônico para fins de estudo ou pesquisa, desde que citada a fonte. FICHA CATALOGRÁFICA Jesus-Santos, Danielle Caroline Divisão de trabalho e sua relação com a dinâmica dos hidrocarbonetos cuticulares em Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) Division of labor and its relation to the dynamics of cuticular hydrocarbons in Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) Ribeirão Preto, p.: Il.; 30cm Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP Área de Concentração: Entomologia Orientador: Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento 1. Meliponini 2. Melipona scutellaris 3. Polietismo temporal 4. Hidrocarbonetos de cutícula

4 Agradeço, ao Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento pela orientação e confiança ao Dr. Sidnei Mateus pela amizade e inestimável auxílio durante a execução do trabalho ao CNPq pelo auxílio financeiro ao programa de pós-graduação em Entomologia da FFCLRP da USP aos meus pais José e Maria Luiza e aos meus irmãos Glauber e Késia, de quem tive que me ausentar durante a execução do trabalho, pelo apoio, carinho e incentivo aos meus familiares que sempre me apoiaram aos amigos que conquistei nesse tempo que estive em RP, especialmente Aline Andrade e Maria Juliana pelo apoio incondicional no momento em que mais precisei aos colegas dos Laboratórios de Comportamento Animal, de Zoologia de Invertebrados e de Ecologia à Renata e Vera, secretárias das pós-graduações em Entomologia e Biologia Comparada, respectivamente à Cidinha pelo carinho comigo e com o nosso ambiente de trabalho à todos que de alguma forma me incentivaram, apoiaram e contribuíram para a realização desse trabalho. Meus sinceros agradecimentos a todos vocês!!!

5 Oh, I get by with a little help from my friends, Mm, gonna try with a little help from my friends. Oh, I get high with a little help from my friends, Yes, I get by with a little help from my friends, With a little help from my friends. (The Beatles, With a little help from my friends)

6 Aos meus pais José e Maria Luiza, exemplos de conduta, dedico.

7 Resumo JESUS-SANTOS, D. C. Divisão de trabalho e sua relação com a dinâmica dos hidrocarbonetos cuticulares em Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini). 63 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Divisão do trabalho é um dos aspectos primordiais para a manutenção da coesão em uma colônia de insetos sociais, o qual é possibilitado pela existência de um complexo sistema de comunicação mediado por via olfativa. Isso permite às operárias organizarem suas tarefas de forma a maximizar a produtividade da colônia. Contudo, o mecanismo pelo qual insetos sociais morfologicamente idênticos são distribuídos em distintos grupos de tarefas permanece ainda pouco compreendido. Os hidrocarbonetos cuticulares desempenham papel essencial nos processos de reconhecimento de insetos. O presente estudo teve como objetivos relacionar a idade das operárias envolvidas nas principais atividades em colônias de Melipona scutellaris e verificar se os perfis químicos de hidrocarbonetos cuticulares se modificam ao longo da vida das mesmas. Os resultados mostraram que a seqüência temporal de desempenho das atividades por operárias dessa espécie é compatível àquelas encontradas em outras espécies de abelhas sem ferrão: trabalho com cerume, construção e aprovisionamento de células de cria, oviposição, limpeza da colônia, recebimento e desidratação de néctar e forrageamento. Essa seqüência segue o padrão de maturação comportamental bastante difundido entre os insetos sociais, no qual indivíduos jovens realizam atividades dentro do ninho e os mais velhos fora deste. Embora tenha havido sobreposição temporal no desempenho das diferentes atividades, foi encontrada relação significativa entre idade e as atividades desempenhada pelos indivíduos. Além disso, foi verificada variação dependente da idade na composição dos hidrocarbonetos cuticulares, a qual pode também estar relacionada à tarefa que o indivíduo desempenha devido à relação direta entre a idade e atividade encontrada em abelhas sociais. Palavras-chave: Meliponini, Melipona scutellaris, polietismo temporal, hidrocarbonetos de cutícula.

8 Abstract JESUS-SANTOS, D. C. Division of labor and its relationship to the dynamics of cuticular hydrocarbons in Melipona scutellaris (Hymenoptera, Apidae, Meliponini). 63 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Division of labor is considered one of the main aspects to the maintenance of cohesion in a colony of social insects, which is possible due to the existence of a complex system of olfactory communication. Because this system, workers can maximize their activities and the productivity of the colony. However, the mechanism by which morphologically identical social insects are distributed into distinct tasks are poorly understood. Cuticular hydrocarbons play an essential role in the recognition processes in social insects. This study aims to verify the existence of a relationship between the age of workers involved in the main colonial activities and the cuticular chemical profiles during their careers. The results showed the existence of a temporal sequence of activities, similar to other stingless bees, composed mainly by cerumen working, building and provisioning of brood cells, oviposition, nest cleaning, receiving and nectar dehydration and foraging. This sequence reflects a characteristic behavioral pattern widespread among social insects, in which younger individuals perform within nest activities while older perform foraging and defense. Although the occurrence of a temporal overlap in the task performance according to the ages has been observed, some activities were well defined. In addition, there was a significant correlation between workers age and cuticular hydrocarbon profiles, which can be secondarily associated to their functional groups. Keywords: Meliponini, Melipona scutellaris, age polyethism, cuticular hydrocarbons.

9 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 9 Objetivos MATERIAL E MÉTODOS Espécie e colônias Coleta de dados comportamentais Coleta de dados químicos Análise dos dados comportamentais Análise dos dados químicos RESULTADOS Atividades desempenhadas X idade das operárias Caracterização dos perfis de hidrocarbonetos de operárias de Melipona scutellaris DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS...52

10 Introdução 1- INTRODUÇÃO A vida colonial, juntamente com o vôo e metamorfose, foi um evento extremamente marcante na evolução dos insetos sociais e com certeza serviu de fonte para o seu sucesso ecológico (WILSON, 1985). Colônias de insetos sociais são grupos de indivíduos que convivem e se reproduzem como uma unidade, a qual representa um nível de organização acima do nível de indivíduo com suas próprias características morfológicas, comportamentais, organização interna e padrão de história de vida (WILSON, 1971). As principais características envolvidas na manutenção da coesão social são: a divisão reprodutiva de trabalho, a sobreposição de gerações e o cuidado parental (WILSON, 1971). Outra importante característica da organização social é a divisão de trabalho entre a casta não reprodutiva (WILSON; 1971; OSTER; WILSON, 1978; WILSON, 1987). Segundo Wilson (1971), a divisão de trabalho corresponde a uma variação nas atividades desempenhadas pelas operárias de uma colônia. Mais precisamente, cada operária especializa-se em um subconjunto do repertório de tarefas, sendo que esse subconjunto varia entre as operárias de acordo com o padrão de divisão de trabalho apresentado pela espécie (BESHERS; FEWELL, 2001). Dois padrões gerais de divisão de trabalho são reconhecidos em insetos sociais: (i) polietismo temporal ou padrões correlacionados com a idade de execução de tarefas e (ii) polietismo morfológico, no qual o tamanho e/ou forma da operária está relacionado com seu desempenho de atividades. Polietismo temporal ocorre em insetos sociais sem diferenciação morfológica de operárias e, invariavelmente, segue o padrão de operárias jovens realizando atividades dentro do ninho e operárias mais velhas desempenhando tarefas fora do ninho como forrageamento e defesa (revisado em ROBINSON, 1992; NASCIMENTO et al., 2005). 9

11 Introdução Padrões de polietismo morfológico são variáveis; sua determinação ocorre pré-imaginalmente e a generalização mais freqüentemente encontrada mostra que onde as subcastas são conspícuas, seja pelo tamanho ou morfologia, o comportamento torna-se mais especializado e os repertórios mais restritos (OSTER; WILSON, 1978). Embora tenha sido brevemente descrito, o polietismo fisiológico corresponde a um terceiro padrão de divisão de trabalho, no qual subgrupos de operárias podem apresentar modificações fisiológicas relacionadas com a reprodução (desenvolvimento ovariano) e comunicação (desenvolvimento diferencial das glândulas) (revisado em ROBINSON, 2009). Abelhas sem ferrão apresentam divisão de trabalho semelhante à encontrada em abelhas melíferas (KERR; SANTOS NETO, 1953, BASSINDALE; 1955). As diferentes tarefas realizadas pelas operárias não estão rigidamente estabelecidas, mas freqüentemente são observados grupos de indivíduos realizando atividades de acordo com sua idade (WILLE, 1983). Essa flexibilidade comportamental foi encontrada em Trigona postica (SIMÕES; BEGO, 1979) e Melipona marginata (MATEUS; ALONSO; ZUCCHI, 2007). O polietismo apresentado pelas abelhas sociais é baseado em um processo denominado de maturação comportamental, no qual à medida que ficam mais velhas deixam de executar as tarefas intra-nidais e passam a realizar atividades consideradas externas, como defesa e forrageamento (HUANG; PLETTNER; ROBINSON, 1998, ROBINSON, 1992). Essa transição tem o hormônio juvenil como principal regulador, além de estar associada a mudanças nas estruturas cerebrais e capacidade de resposta a vários estímulos relacionados ao forrageamento (FAHRBACH et al., 2003; HUANG; PLETTNER; ROBINSON, 1998, PANKIW; PAGE, 2000). Nas abelhas sem-ferrão (Apidae, Meliponini), indivíduos muito jovens produzem cera e trabalham no favo de cria onde nasceram, e vão se afastando à medida que envelhecem, até 10

12 Introdução deixarem o ninho para serem forrageiras (CEPEDA, 2006). Apesar da possível variação entre as espécies, as abelhas em geral passam por quatro etapas: recém-emergida, abelha cuidadora, guarda e forrageadora. As tarefas associadas a esses estágios são: (1) incubação e reparação do favo de cria, (2) construção e aprovisionamento das células, limpeza do ninho e alimentação de adultos jovens e da rainha, (3) reconstrução do invólucro, recepção e desidratação de néctar e proteção na entrada do ninho, (4) coleta de pólen, néctar, própolis e outros materiais (WILLE, 1983). O polietismo temporal, bem como outros padrões de divisão de trabalho, é regulado por um sistema de comunicação entre os organismos envolvidos, pois permite a troca de informações entre os membros da colônia. Tal linguagem pode ser mediada por diversos canais sensoriais, especialmente sinais químicos (BILLEN, 2006). A forma de comunicação mais difundida entre insetos sociais é baseada em mensageiros químicos, dentre os quais os feromônios (BILLEN, 2006), e os receptores olfativos amplamente distribuídos pelos apêndices, especialmente nas antenas (ATKINS, 1980). Os feromônios são compostos químicos secretados por uma glândula exócrina do animal para o exterior e que promovem uma reação específica em um indivíduo da mesma espécie, como, por exemplo, a execução de um determinado comportamento (KARLSON; BUTENANDT, 1959). Feromônios primários 1 têm efeitos profundos no comportamento social e na homeostase da colônia e são uma importante força motriz na evolução da harmonia social (LE CONTE; HEFETZ, 2008). Os insetos sociais apresentam os mais complexos sistemas envolvendo feromônios que controlam desde a colaboração entre os indivíduos da colônia na coleta de alimentos e cuida- 1 Feromônio primário: um feromônio que na percepção afeta em longo prazo processos fisiológicos ou endócrinos no receptor, seguido por alterações tardias na resposta comportamental (LE CONTE; HEFETZ, 2008). 11

13 Introdução dos com a prole à reprodução e defesa (WILLIAMS et al., 1993). Tal interação entre os membros da colônia é conhecida como divisão do trabalho, definida por Oster e Wilson (1978) como uma força de trabalho organizada entre grupos de indivíduos. Os componentes altamente voláteis, de baixo peso molecular, como os feromônios de alarme e de atração das abelhas, são transmitidos pelo ar. Já outros menos voláteis são retidos na superfície do corpo, onde são detectados por quimiorreceptores. Em Apis mellifera, a fixação dessas substâncias tende a ser realizada pelas ligas de cera na epicutícula das abelhas (CARVALHO; BENTO; MARCHINI, 2001). Os processos de comunicação entre os insetos sociais envolvem, como principais compostos, os hidrocarbonetos de superfície (BREED; BENNETT, 1987, BLOMQUIST et al., 1998, SINGER; ESPELIE; GAMBOA, 1998, HOWARD; BLOMQUIST, 2005, LE CONTE; HEFETZ, 2008, NUNES et al., 2009a, TANNURE-NASCIMENTO et al., 2008, 2009). A cutícula dos insetos é coberta por fina camada impermeável de cera composta por lipídios de alto peso molecular, os quais, segundo LOCKEY (1988), serviriam primariamente como proteção contra a perda de água. A função feromonal dos hidrocarbonetos teria evoluído mais tarde. Essa função secundária é uma das razões da diversidade de compostos cuticulares encontrados entre os grupos e as conseqüentes combinações altamente específicas (HOWARD; BLOMQUIST, 2005). A ocorrência de hidrocarbonetos cuticulares mostra-se característica entre os grupos de insetos (espécie ou colônia), podendo variar dentro destes de acordo com a idade, casta ou sexo dos indivíduos (BLOMQUIST et al., 1998, MONNIN; PEETERS, 1999). Estes compostos também estão relacionados com a identificação dos indivíduos geneticamente relacionados, da função que estes exercem na colônia, entre outras respostas comportamentais (BREED; BENNETT, 1987, JUNGNICKEL et al., 2004). Em abelhas sem ferrão, os estudos 12

14 Introdução mostram variação na composição de hidrocarbonetos cuticulares relacionadas à população, castas, indivíduos de diferentes idades e papéis funcionais dentro da colônia (ABDALLA et al., 2003, NUNES et al., 2008, 2009, FERREIRA-CALLIMAN et al., 2010, 2012). Tais diferenças no perfil químico cuticular em insetos sociais constituem uma assinatura química individual, podendo ter origem endógena, ou seja, produzidas pelo próprio indivíduo, caracterizando uma origem genética; ou apresentar uma origem exógena, sendo adquiridos a partir do meio externo (CARLIN, 1988, revisado por LORENZI; BAGNÈRES; CLÉMENT, 1996). Apesar do crescente número de estudos que envolvem as diferentes abordagens ligadas ao estudo da química cuticular nos Meliponini, esse é um campo ainda pouco conhecido quando comparado a outros grupos de insetos sociais. Deixando assim uma lacuna no conhecimento de uma área importante da biologia desse grupo. O presente estudo foi motivado pela oportunidade de conhecer melhor os compostos que fazem parte da química cuticular das abelhas sem ferrão e compreender como esses se comportam ao longo da vida das operárias de Melipona scutellaris. Além de contribuir para o conhecimento do repertório comportamental da espécie em função da idade das operárias, esse é o primeiro estudo a levantar informações sobre a dinâmica dos hidrocarbonetos cuticulares em Melipona scutellaris. Objetivos O presente estudo teve como objetivos (i) descrever a idade das operárias envolvidas nas principais atividades em colônias de Melipona scutellaris e (ii) caracterizar os perfis de hidrocarbonetos cuticulares de operárias de M. scutellaris em diferentes idades (recémemergidas, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias), avaliando como o perfil químico cuticular se modifica ao longo da vida das mesmas. 13

15 Material e métodos 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Espécie e colônias Assim como as demais abelhas sociais da família Apidae, as abelhas do gênero Melipona apresentam polietismo etário como padrão de divisão de trabalho. Optou-se, nesse estudo, pela espécie Melipona scutellaris (Latreille, 1811) devido à robustez dos indivíduos e à adaptação das colônias ao ambiente de estudo. Tratam-se de abelhas robustas de grande porte, pertencentes à tribo Meliponini (MICHENER, 2007). São eussociais e, assim como a maioria das espécies do gênero Melipona, constroem seus ninhos em ocos de árvores (MICHENER, 2007). Possuem distribuição Neotropical, sendo encontradas, no Brasil, nos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Sergipe (CAMARGO, PEDRO, 2008). Duas colônias de M. scutellaris foram mantidas em caixas de observação e cobertas com uma lâmina de vidro (SAKAGAMI, 1966; Fig. 1). Em períodos de baixa temperatura, as caixas foram aquecidas à 27 o C. Nos outros meses, foram mantidas em temperatura ambiente. As caixas de observação foram conectadas com o meio externo através de um tubo flexível de PVC (Fig. 1). A coleta dos dados comportamentais foi conduzida entre os meses de março e junho de 2011 (colônia 1), e entre Setembro de 2011 e Janeiro de 2012 (colônia 2). 14

16 Material e métodos 10cm Figura 1. Esquema do aparato montado para a realização do experimento. A. Tubo de entrada. B. Caixa de entrada. C. Colônia. D. Caixa auxiliar de observação. E. Caixa climatizadora. As colônias de M. scutellaris, assim como as de outros meliponíneos, possuem regiões mais ou menos delimitadas (ver Anexo A). Na parte central encontra-se a área de cria onde discos formados do agrupamento lateral das células encontram-se horizontalmente empilhados, separados por pilares de cerume. Esta área é recoberta por um conjunto de lamelas de cerume que formam o invólucro, estrutura que atua na proteção e controle da temperatura nesse local. Na periferia localiza-se a área de estoque de alimento, formada por potes construídos com cerume. E ainda uma região de acúmulo de corpos e de diversos materiais a serem descartados, a qual também é utilizada para defecação das abelhas. Os discos de cria são continuamente construídos, havendo diferença de estágio de maturação entre os mesmos. Geralmente, os favos de cria pré-emergentes, estão dispostos abaixo daqueles em que novas células de cria estão sendo construídas, impossibilitando acompanhar o comportamento das operárias que realizam tarefas nesse local. Para que os 15

17 Material e métodos comportamentos de tais indivíduos pudessem ser verificados, favos amadurecidos foram colocados em uma caixa auxiliar de observação conectada à colônia principal (Fig.1D) A parte superior do invólucro foi retirada para a verificação dos comportamentos das abelhas nos favos de cria. Para manter a observação, o mesmo era retirado quando reparado pelas operárias Coleta de dados comportamentais Favos de cria foram retirados de cada colônia e mantidos em incubadora para DBO (Demanda Bioquímica de Oxigênio; modelo MA 415, Marconi) a 27±3 o C. Operárias com menos de 24 horas de emergência (N=195, colônia 1 e N=236, colônia 2) foram marcadas com tinta atóxica Magic no mesossoma, seguindo um código de cores que permitiu atribuir um número diferente a cada indivíduo. Uma hora após a marcação, os indivíduos foram introduzidos em suas respectivas colônias de origem. Registros em vídeo (filmadora Sony Handycam modelo HDR-XR550V) foram realizados diariamente, duas vezes por dia, até que as abelhas perdessem suas marcas, aparecessem mortas no lixo ou simplesmente desaparecessem. Cada sessão de filmagem teve duração de duas horas, na qual o observador percorria as diferentes áreas do ninho separadamente, ex. área de cria, área de estoque de alimento, depósito de lixo, paredes internas do ninho e tubo de entrada, registrando as tarefas desempenhadas pelas abelhas marcadas que estavam visíveis em cada uma dessas áreas. Esse sistema de observação foi baseado no trabalho sobre polietismo etário realizado com Trigona minangkabau (INOUE; SALMAH; SAKAGAMI, 1996). 16

18 Material e métodos 2.3. Coleta dos dados químicos A análise química foi realizada a partir da técnica não-destrutiva de micro-extração em fase sólida (SPME), de modo que as operárias marcadas e observadas durante o comportamento pudessem ser analisadas e devolvidas às colônias de origem, mantendo assim, suas atividades na colônia. A extração se deu por contato e leve fricção de fibra de polidimetilsiloxano SUPELCO (30 μm bounded) no abdome e cabeça das abelhas por cerca de 10 segundos (FERREIRA-CALIMAN, 2008). A amostragem constituiu-se de indivíduos com menos de um dia de idade, emergidos dos favos de cria mantidos em incubadora, além de indivíduos com 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias (N=10 para cada grupo para cada colônia). Apesar de recém emergidas não constituírem um grupo funcional na colônia, a caracterização do seu perfil de hidrocarbonetos cuticulares permitiu acompanhar a mudança do mesmo com a idade. As amostras foram analisadas em um sistema de cromatografia a gás acoplada a um espectômetro de massas SHIMADZU, modelo CGMS-QP2010, utilizando-se hélio como gás carreador a uma taxa de 1ml/min. A temperatura do sistema foi elevada de 150 C à 280 C, a uma taxa de 3 C/min, mantendo-se a temperatura final por 15min. O injetor e o detector foram mantidos à temperatura de 250 C Análise dos dados comportamentais Os registros em vídeos foram analisados utilizando o software PMB (Sony Corporation). A partir dessas análises, foi montado um etograma com as principais atividades exibidas pelas operárias. Tais atividades foram definidas a partir de repertórios descritos em 17

19 Material e métodos trabalhos anteriores (KOLMES; SOMMEIJER, 1992, INOUE; SALMAH; SAKAGAMI, 1996, SILVA, 2008). As atividades foram (ver Anexo B): 1) CC Construção de célula de cria. Uma operária adiciona e/ou molda cerume utilizando a mandíbula durante o processo de construção da célula. 2) RS Raspagem da superfície do favo utilizando as mandíbulas. Uma abelha caminha sobre as células operculadas; com a cabeça baixa, toca o material da superfície com movimentos rápidos da mandíbula. 3) TI Trabalhando no invólucro. Uma abelha adiciona e/ou molda cerume com a mandíbula no processo de construção do invólucro ou na remoção de cerume da lamela para utilizar na construção de outra estrutura qualquer na colônia. 4) AP Aprovisionamento de célula de cria. Uma abelha regurgita o alimento larval na célula antes da postura da rainha. 5) OP Operculação de célula de cria. Uma abelha fecha com auxílio da sua mandíbula, a célula na qual a rainha acaba de realizar postura. 6) TP Trabalhando no pote de alimento. Uma operária usa sua mandíbula para adicionar e/ou moldar cerume no processo de construção do pote ou no processo de remoção de cerume a ser utilizado na construção de qualquer outra estrutura na colônia. 7) CM Carreamento de material como cerume ou resina a serem utilizados na construção de qualquer estrutura na colônia. 8) ML Manipulação de lixo. A abelha manipula o lixo com a mandíbula, moldando-o em pequenas porções que serão retiradas da colônia. 9) AC Adição de cera ao depósito. A abelha raspa o dorso do abdome com a perna traseira e adiciona a cera retirada ao depósito. 18

20 Material e métodos 10) RC Remoção de cerume das células velhas de cria. Retira com auxílio da mandíbula o cerume dos favos de cria pré emergente. 11) MR Manipulação de resina no depósito. 12) DN Desidratação de néctar. A abelha faz movimentos contínuos de exposição e retração de uma gota do néctar entre as mandíbulas. 13) FF Fechamento de frestas entre o tampo de vidro e a caixa de observação. 14) CL Carreamento de lixo. A abelha carrega restos de células utilizadas, cadáveres e outros materiais para o lixo. 15) RN Recepção de néctar das forrageadoras quando chegam do campo. 16) FO Forrageamento de recursos fora da colônia. Operárias saem do ninho e coletam pólen, néctar, água, barro e resina. 17) TR Trofalaxia. Troca de alimento entre as operárias. 18) PO Postura de ovo trófico. Operária faz postura na célula que está sendo aprovisionada e a rainha se alimenta desse ovo. A partir do etograma, os dados foram organizados de modo que se pudesse visualizar a distribuição da realização das diferentes atividades em função da idade das operárias que as realizam. Para a análise da freqüência dos comportamentos foi confeccionado um gráfico de dispersão das idades em relação às atividades (programa Statistica 7; Statsoft, Inc). Quando apropriado, nas análises dos dados comportamentais, os resultados foram apresentados com a média ± desvio padrão. 19

21 Material e métodos 2.5. Análise dos dados químicos Os cromatogramas resultantes foram analisados com auxílio do programa CGMSsolutions for Windows (Shimadzu Corporation). Para a identificação dos compostos, os espectros de massa foram comparados com dados da biblioteca Wiley (MCLAFFERTY; STAUFFER; LOH, 2000) e com dados de íons diagnósticos disponíveis na literatura. Os dados obtidos foram comparados entre os grupos por meio de análise estatística multivariada. Apenas os compostos compartilhados pelos indivíduos de todos os grupos foram utilizados nas análises. De início, uma análise dos componentes principais (PCA) foi utilizada para definir os compostos que seriam comparados, os quais tiveram pelo menos 5% de contribuição para os dois primeiros fatores dessa análise. Em seguida, análise discriminante foward stepwise foi utilizada para contrastar o perfil químico cuticular dos indivíduos dos grupos experimentais. Para essa análise, os compostos escolhidos com base na PCA foram reajustados para 100%. Erros na composição dos dados amostrais (AITCHISON, 1986) foram evitados pela transformação das áreas dos picos seguindo a seguinte fórmula: Z = ln [ ( A p / g ( A p ) ] Na qual, A p é a área do pico, g ( A p ) é a média geométrica do pico em cada grupo experimental e Z é a área transformada do pico. 20

22 Resultados 3. RESULTADOS 3.1. Atividades desempenhadas X idade das operárias Colônia 1 As operárias de Melipona scutellaris viveram, em média, 41,50 ± 13,07 com longevidade mínima de 20 dias e máxima de 75 dias. A maioria das abelhas passou os primeiros dias de vida sem realizar nenhum tipo de tarefa, as quais começaram a ser desempenhadas por volta do 6 dia, exceto para carreamento de material como cerume ou resina (CM), remoção de cerume das células de cria (RC) e raspagem da superfície do favo (RS) que foram realizadas por indivíduos com apenas 3 dias de idade (Tabela 1, Fig. 2). Como acima descrito, as primeiras atividades desempenhadas pelas operárias estão relacionadas ao trabalho com cerume, seja retirando-o das diversas estruturas do ninho como invólocro, potes, células velhas de cria ou superfície do favo ou carregando-o (TI, TP, RC, RS e CM, respectivamente). Após essas atividades, as abelhas estiveram envolvidas nas atividades reprodutivas do ninho como construção, aprovisionamento, postura de ovo trófico e operculação de células de cria (CC, AP, PO, OP, respectivamente). Em seguida, realizaram trabalho com o lixo (ML, CL), fechamento de frestas entre a caixa de observação e o vidro (FF) e, por último, forrageamento (FO) (Fig. 3). Dentre as atividades que demandaram manipulação de cerume - TI, TP, RC, RS e CM-, as operárias que as desempenharam estiveram distribuídas, em média, no intervalo entre 8 e 30 dias de idade (Fig. 2). Dessas, a atividade de carreamento de 21

23 Resultados cerume foi realizada por indivíduos no intervalo entre 3 e 42 dias, ocorrendo em maior freqüência entre 8 e 20 dias. A remoção desse material a partir das células velhas de cria foi realizada no período entre 3 e 36 dias, apresentando freqüência similar ao longo desse período. A raspagem da superfície do favo ocorreu no intervalo entre 3 e 31 dias, sendo mais freqüente entre 8 e 17 dias. Já os trabalhos no invólocro e nos potes foram desempenhados entre 9 e 43 dias e 6 e 55 dias, respectivamente, tendo o primeiro maior freqüência entre 10 e 19 dias e o último entre 16 e 26 dias (Tabela 1; Fig. 3). As operárias envolvidas nas atividades reprodutivas do ninho (CC, AP, OP, PO) fazem parte de uma estreita faixa etária, que compreende, em média, de dez a 18 dias (Fig. 2). As abelhas que construíram células de cria tiveram, em média, 13,88 dias, as que aprovisionaram essas células apresentaram idade média de 13,64 dias, as que realizaram postura de ovo trófico tiveram 14,20 dias e as que realizaram operculação de célula 14,30 dias, em média (Tabela 1). Essa última foi registrada dez vezes, o que dificulta precisar sua distribuição temporal (Fig. 3). Embora tenha havido sobreposição de idade das abelhas que construíram células e as que as aprovisionaram, foi observado que nem todas que constroem célula realizaram o aprovisionamento, evidenciando certo grau de especialização dos indivíduos que realizam essa função. 22

24 Resultados Tabela 1. Ocorrência das principais atividades realizadas pelas operárias da M. scutellaris (colônia 1). Média média de idade em que a tarefa ocorreu; DP desvio padrão; Min. menor idade que o comportamento foi executado (dias); Máx. idade máxima que o comportamento foi executado (dias); N número de vezes que o comportamento foi observado. Atividade Média ± DP Min. Máx. N AC 29.0 ± AP ± CC 13,88 ± 4, CL 32,33 ± 8, CM 17,49 ± 7, FF 28,40 ± 6, FO 40,05 ± 8, ML 32,90 ± 7, MR 31,75 ± 7, OP 14,30 ± 3, PO 14,20 ± 3, RC 17,44 ± 8, RN 26,00 ± 7, RS 13,53 ± 5, TI 17,35 ± 7, TP 22,11 ± 7, TR 27,09 ± 12,

25 Resultados Mean Mean±SD Min-Max Outliers Idade TP TI RC RS CM CC AP OP PO AC MR ML CL FF RN FO TR Comportamento Figura 2. Distribuição das atividades comportamentais realizadas pelas operárias de Melipona scutellaris (colônia 1) em função da variação da idade das mesmas em dias. A atividade de adicionar cera ao depósito (AC) foi registrada apenas 6 vezes na colônia 1, sendo realizada por operárias com idade média de 29 dias (Tabela1). Como a atividade ocorreu poucas vezes, a interpretação sobre sua distribuição entre as idades das operárias fica comprometida (Fig. 3). 24

26 Resultados Comportamento TR FO RN FF CL ML MR AC PO OP AP CC CM RS RC TI TP Idade <= 0 (0;5] (5;10] (10;15] (15;20] (20;25] (25;30] > 30 Figura 3: Freqüência das atividades realizadas pelas operárias Melipona scutellaris (colônia 1) em função da idade (em dias) das mesmas. As abelhas que estiveram envolvidas nas atividades de limpeza do ninho, possuíam idade intermediária. Aquelas que realizaram o carreamento de lixo (CL) estavam no intervalo entre 23 e 41 dias de idade, já as que desempenharam manipulação de lixo (ML) tinham entre 25 e 40 dias (Fig. 2). Ambas as atividades apresentaram freqüência homogênea nos seus intervalos de ocorrência (Fig. 3). 25

27 Resultados A atividade de fechamento de frestas (FF) foi registrada apenas cinco vezes na colônia 1, sendo realizada por indivíduos de idade intermediária (Fig. 2), com média de idade de 28,40 dias (Tabela 1). Devido à baixa ocorrência, a interpretação da distribuição dessa atividade entre as idades das operárias fica comprometida (Fig. 3). A tarefa de manipulação de resina no depósito (MR) foi registrada 33 vezes na colônia 1, sendo realizada por indivíduos com idade média de 31,75 dias (Tabela 1). A distribuição da ocorrência dessa atividade é homogênea (Fig. 3). A atividade de recepção de néctar (RN) foi registrada apenas sete vezes na colônia 1, sendo realizada por indivíduos com idade intermediária (Fig. 2), com média de idade de 26 dias. Como essa atividade apresentou baixa ocorrência, a interpretação sobre sua distribuição entre as idades das operárias fica comprometida (Fig.3). Já a desidratação de néctar foi registrada apenas duas vezes, sendo desempenhada por um indivíduo de 37 dias e outro de 45 dias de idade. O comportamento de trofalaxia (TR) foi registrado 181 vezes na colônia 1, sendo realizado por indivíduos com idade média de 27,09 dias (Tabela 1). Tal comportamento teve ocorrência homogênea ao longo de todas as idades (Fig. 3). A atividade de forrageamento de recursos (FO) foi registrada 214 vezes na colônia 1, sendo essencialmente realizada por indivíduos mais velhos (Fig. 2) com média de idade de 40,05 dias (Tabela 1). Essa atividade foi realizada por indivíduos com idade entre 23 e 75 dias, distribuindo-se uniformemente nesse intervalo (Fig. 3). 26

28 Resultados Colônia 2 As operárias de Melipona scutellaris viveram, em média, 45,97 ± 16,99 com longevidade mínima de 14 dias e máxima de 70 dias. As abelhas iniciaram cedo (3 dias) em suas vidas a participação em tarefas na colônia (Tabela 2). Em uma sequência temporal, as primeiras atividades desenvolvidas envolveram a manipulação de cerume seja retirando-o de estruturas do ninho como invólocro, potes, células velhas de cria ou superfície do favo ou carregando-o (TI, TP, RC, RS e CM, respectivamente). Em seguida, as abelhas estiveram envolvidas nas atividades reprodutivas do ninho como construção, aprovisionamento e operculação de células de cria (CC, AP, OP, respectivamente). Logo após, realizaram trabalho com o lixo (ML, CL), fechamento de frestas entre a caixa de observação e o vidro (FF) e, por último, forrageamento (FO) (Fig. 4). Considerando o conjunto de atividades que demandaram manipulação de cerume TI, TP, RC, RS e CM -, as operárias que o desempenha estiveram distribuídas no intervalo de entre 4 e 32 dias (Fig. 5). A atividade de carreamento de cerume foi realizada por indivíduos no intervalo entre 1 e 50 dias, ocorrendo em maior freqüência entre 4 e 15 dias. A remoção desse material a partir das células velhas de cria foi realizada no período entre 4 e 48 dias, com uma leve tendência de ocorrer com maior freqüência entre 4 e 12 dias. A raspagem da superfície do favo ocorreu no intervalo entre 3 e 29 dias, sendo mais freqüente entre 4 e 14 dias. Os trabalhos no invólocro e nos potes foram desempenhados entre 3 e 39 dias e 4 e 42 dias, respectivamente, tendo o primeiro maior freqüência entre 5 e 16 dias e o último ocorrido com igual freqüência ao longo do seu intervalo de distribuição (Fig. 4). 27

29 Resultados Tabela 2. Ocorrência das principais atividades realizadas pelas operárias da M. scutellaris (colônia 2). Média média de idade em que a tarefa ocorreu; DP desvio padrão; Min. menor idade que o comportamento foi executado (dias); Máx. idade máxima que o comportamento foi executado (dias); N número de vezes que o comportamento foi observado. Atividade Média ± DP Min. Máx. N AC 17,25 ± 7, AP 11,30 ± 3, CC 11,78 ± 3, CL 32,11 ± 13, CM 14,19 ± 10, DN 31,11 ± 10, FF 30,89 ± 12, FO 40,60 ± 9, ML 28,54 ± 12, MR 28,78 ± 10, OP 10,00 ± 1, RC 17,62 ± 13, RN 40,22 ± 10, RS 9,50 ± 3, TI 14,93 ± 8, TP 20,45 ± 10, TR 30,51 ± 15, A distribuição temporal da atividade de adicionar cera ao depósito (AC) ficou restrita ao intervalo de 12 a 18 dias, exceto para um registro no 40 dia (Tabela 2; Fig. 5). Dentro desse intervalo, não houve maior freqüência em uma idade específica (Fig. 4). 28

30 Resultados Comportamento TR FO RN DN FF CL ML MR AC OP AP CC CM RS RC TI TP Idade <= 0 (0;5] (5;10] (10;15] (15;20] (20;25] (25;30] (30;35] (35;40] (40;45] (45;50] > 50 Figura 4. Freqüência das atividades realizadas pelas operárias Melipona scutellaris (colônia 2) em função da idade (dias) das mesmas. As operárias envolvidas nas atividades reprodutivas do ninho (CC, AP, OP) fazem parte de uma estreita faixa etária, que compreende, em média, de oito a 14 dias (Fig. 5). As abelhas que construíram células de cria tiveram, em média, 11,78 dias e os que aprovisionaram essas células apresentaram idade média de 11,30 dias. Apenas três indivíduos realizaram operculação de célula de cria, os quais tinham 9, 10 e 11 dias de 29

31 Resultados vida. (Tabela 2). Embora tenha havido sobreposição de idade das que construíram células e as que as aprovisionaram, foi observado que nem todas que constroem célula realizaram o aprovisionamento. E, ainda, não foi registrado nenhum indivíduo realizando postura de ovo trófico nesta colônia Mean Mean±SD Min-Max Outliers Idade TP TI RC RS CM CC AP OP AC MR ML CL FF DN RN FO TR Comportamento Figura 5. Distribuição das atividades comportamentais realizadas pelas operárias de Melipona scutellaris (colônia 2) em função da variação da idade das mesmas em dias. 30

32 Resultados As abelhas que estiveram envolvidas nas atividades de limpeza do ninho, possuíam idade intermediária. Aquelas que realizaram o carreamento de lixo (CL) estavam no intervalo entre 18 e 45 dias de idade, já as que desempenharam manipulação de lixo (ML) tinham entre 16 e 40 dias, em média (Fig. 5). Ambas as atividades apresentaram freqüência homogênea nos seus intervalos de ocorrência (Fig. 4). A atividade de fechamento de frestas (FF) foi registrada apenas cinco vezes na colônia 1, sendo realizada por indivíduos de idade intermediária (Fig. 2), com média de idade de 28,40 dias (Tabela 1). Devido à baixa ocorrência, a interpretação da distribuição dessa atividade ocorreu poucas vezes, a interpretação sobre sua distribuição entre as idades das operárias fica comprometida (Fig. 3). A tarefa de manipulação de resina no depósito (MR) foi registrada 33 vezes na colônia 1, sendo realizada por indivíduos com idade média de 31,75 dias (Tabela 1). A distribuição da ocorrência dessa atividade é homogênea (Fig. 3). A atividade de recepção de néctar (RN) é desempenhada por indivíduos com idade média que varia entre 30 e 50 dias, já a tarefa de desidratação de néctar (DN) foi realizada, em média, por operárias entre 20 e 42 dias de idade (Fig. 5). Tais atividade não apresentaram tendência de ser realizada em uma idade específica nesse intervalo ( Fig. 4). O comportamento de trofalaxia (TR) foi registrado 157 vezes na colônia 2, sendo realizado por indivíduos com idade média de 30,51 dias (Tabela 2). Tal comportamento teve ocorrência homogênea ao longo de todas as idades (Fig. 4). A atividade de forrageamento de recursos (FO) foi essencialmente realizada por indivíduos mais velhos (Fig. 5) com média de idade de 40,60 dias (Tabela 2). Essa atividade foi realizada com maior freqüência no intervalo entre 30 e 48 dias (Fig 4). 31

33 Resultados 3.2. Caracterização dos perfis de hidrocarbonetos cuticulares de operárias de Melipona scutellaris Os resultados demonstraram que as duas colônias de Melipona scutellaris possuem semelhante composição cuticular quanto à diversidade de hidrocarbonetos, os quais possuem cadeias carbônicas que variam entre 19 e 33 átomos. Esses compostos estão divididos em alcanos lineares, alcenos, metilados e alcadienos em ordem decrescente de abundância relativa. Os indivíduos mais velhos das duas colônias não apresentam o hidrocarboneto de cadeia pequena Nonadecano (n-c19), exceto os de 21 dias da colônia 2. Esse mesmo composto está presente em menor proporção na cutícula de operárias recém emergidas (RE) da colônia 2, aumentam nas operárias de 7 dias e tornam a diminuir nas de 14 e 21 dias. A colônia 1 apresenta situação inversa em relação ao mesmo composto, o qual possui maior proporção nos indivíduos recém-emergidos e diminui gradativamente nos de 7 e 14 dias. Contudo, os altos valores do desvio padrão indicam grande variação entre indivíduos dentro do mesmo grupo etário. Evidencia-se, ainda, diferença entre as duas colônias quanto à ausência/presença de alguns compostos. A colônia 2 possui menor número de hidrocarbonetos em relação à outra colônia, faltando àquela o Heptacoseno (TR ), 7-Metil C 27, 11-Metil C 29, Dotriaconteno e Dotriacontano. Já na colônia 1 não foram encontrados o Hexacoseno e o 9-Metil C

34 Resultados Colônia 1 As operárias da colônia 1 apresentaram um total de 45 hidrocarbonetos, majoritariamente divididos em alcanos, alcenos e metil alcanos (Tabela 3). Além desses, os alcadienos também estiveram presentes na epicutícula das abelhas. De maneira geral, as RE apresentam maior proporção de hidrocarbonetos de cadeia pequena comparadas com os indivíduos das demais idades. Destaca-se o Tricosano que teve expressiva abundância nesse grupo de indivíduos e se manteve estável em proporção relativamente baixa nos outros grupos. As RE caracterizaram-se, ainda, pela ausência de Pentacoseno (TR 27,583min e 27,894min), Heptacoseno (TR 32,649min), Nonacoseno (TR 37,444min), Dotriaconteno e Dotriacontano. Os hidrocarbonetos Pentacoseno (TR 27,894min), Dotriaconteno e Dotriacontano foram exclusivos dos indivíduos com mais de 21 dias. Destes, os de 42 dias caracterizaram-se pela presença de Heptacoseno (TR 32,880min) em elevada proporção e ausência do 5-Metil C 27. As substâncias Tricosano, Pentacosano, Heptacoseno (TR 32,481min), Heptacosano e Hentriaconteno foram as mais representativas em todas as idades das operárias. A proporção deste último não apresentou grande variação ao longo do tempo, diferente do Pentacosano, Heptacoseno (TR 32,481min) e Heptacosano que foram mais abundantes nos indivíduos mais velhos. O fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 36, 88% da variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores descreveu 61,28% dessa variação, a dos três primeiros fatores descreveu 69,96% e a dos quatro primeiros 78%. A análise discriminante foward stepwise (nível de tolerância = 0.05) separou os grupos 33

35 Resultados de operárias de acordo com os hidrocarbonetos cuticulares (Modelo Global: Wilk s Lambda = 0,00004; F 90,24 = 13,901; p < 0,001) (Figura 6 e Tabela 4). Os compostos utilizados para a análise foram Docosano, (Z)-Tricoseno, Pentacosano, 13-Metil C 25, 11-Metil C 25, 9-Metil C 25 Hexacosano, (Z)- Heptacoseno (TR ), Heptacosano, 13-Metil C 27, 11-Metil C 27, 7-Metil C 27, Octacosano, (Z)-Nonacoseno (TR ), Triacontano e (Z)-Hentriaconteno. A classificação da matriz apontou um total de 100% de correta alocação do indivíduos recém-emergidos, além dos de 07 e 42 dias. A correta alocação das operárias de 14, 21, 28 e 35 dias de vida foi de 80%, 60%, 60% e 66,67%, respectivamente. 34

36 Resultados Tabela 3 Valores médios e desvio padrão da proporção relativa dos hidrocarbonetos de operárias de Melipona scutellaris (colônia 1) em diferentes idades. TR tempo de retenção (minutos); RE operárias recém-emergidas. TR COMPOSTO RE 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias Nonadecano (n-c 19 ) 0,47 ± 0,55 0,12 ± 0,10 0,08 ± 0, Heneicosano (n-c 21 ) 0,94 ± 0,47 0,15 ± 0,08 0,09 ± 0,04 0,11 ± 0,05 0,09 ± 0,03 0,08 ± 0,02 0,12 ± 0, Docosano (n-c 22 ) 0,90 ± 0,94 0,03 ± 0,02 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,03 0,03 ± 0,01 0,04 ± 0, (Z)-Tricoseno 8,03 ± 9,01 0,10 ± 0,03 0,52 ± 0,40 0,55 ± 0,29 0,51 ± 0,56 0,41 ± 0,20 0,52 ± 0, Tricosano (n-c 23 ) 22,92 ± 13,35 4,61 ± 1,63 5,14 ± 1,21 4,26 ± 1,67 4,38 ± 1,20 5,47 ± 1,05 6,05 ± 0, Metil C 23 0,33 ± 0,19 0,08 ± 0,03 0,14 ± 0,06 0,15 ± 0,06 0,15 ± 0,07 0,12 ± 0,05 0,13 ± 0, Tetracosano (n-c 24 ) 2,09 ± 2,88 0,49 ± 0,12 0,55 ± 0,20 0,42 ± 0,17 0,43 ± 0,10 0,61 ± 0,15 0,63 ± 0, (Z)-Pentacoseno 10,60 ± 4,06 5,03 ± 1,25 7,86 ± 2,64 8,60 ± 2,21 7,35 ± 2,46 5,57 ± 2,26 5,86 ± 1, (Z)-Pentacoseno 0,31 ± 0,13 0,28 ± 0,07 0,33 ± 0,10 0,25 ± 0,09 0,29 ± 0,10 0,36 ± 0, (Z)-Pentacoseno 0,68 ± 0,77 1,35 ± 0,76 1,63 ± 1, Pentacosano (n-c 25 ) 10,35 ± 9,54 27,25 ± 5,71 24,88 ± 4,66 21,78 ± 7,56 24,69 ± 4,57 29,32 ± 5,52 25,95 ± 3, Metil C 25 ; 11-Metil C 25; 9- * Metil C 25 5,08 ± 10,34 0,13 ± 0,09 0,16 ± 0,11 0,24 ± 0,16 0,24 ± 0,19 0,04 ± 0,02 0,06 ± 0, Metil C 25 0,19 ± 0,17 0,02 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,01 ± 0,01 0,06 ± 0,09 ** Metil C 25 0,27 ± 0,15 0,16 ± 0,22 0,09 ± 0,03 0,06 ± 0,03 0,07 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,07 ± 0, Metil C 25 0,24 ± 0,09 0,36 ± 0,11 0,50 ± 0,16 0,51 ± 0,14 0,44 ± 0,13 0,35 ± 0,14 0,34 ± 0, Hexacosano (n-c 26 ) 0,69 ± 0,88 0,68 ± 0,17 0,70 ± 0,19 0,58 ± 0,24 0,62 ± 0,20 0,90 ± 0,19 0,96 ± 0, (Z)- Heptacoseno 3,99 ± 3,26 16,88 ± 4,49 18,68 ± 4,35 21,05 ± 6,74 18,15 ± 4,59 12,29 ± 3,82 13,05 ± 3, (Z)- Heptacoseno 0,33 ± 0,24 0,25 ± 0,06 0,32 ± 0,10 0,21 ± 0,04 0,26 ± 0,07 0,37 ± 0, (Z)- Heptacoseno 19,59 ± 2, Heptacosano (n-c 27 ) 5,66 ± 3,49 16,32 ± 3,90 16,89 ± 3,78 13,76 ± 4,83 14,32 ± 4,66 20,00 ± 2,96 0,28 ± 0,08 * Metil C 27 ; 11-Metil C 27 2,04 ± 3,83 0,32 ± 0,10 0,38 ± 0,15 0,36 ± 0,11 0,35 ± 0,15 0,23 ± 0,12 0,10 ± 0, Metil C 27 0,11 ± 0,07 0,07 ± 0,03 0,06 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,06 ± 0,03 0,03 ± 0,02 0,03 ± 0, Metil C 27 0,21 ± 0,26 0,01 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,02 ± 0,02 0,02 ± 0,02 0,01 ± 0,01 0,07 ± 0,13 Continua 35

37 Resultados Continuação Tabela3 Valores médios e desvio padrão da proporção relativa dos hidrocarbonetos de operárias de Melipona scutellaris (colônia 1) em diferentes idades Metil C 27 0,49 ± 0,27 0,03 ± 0,02 0,02 ± 0,01 0,05 ± 0,04 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0, (Z)-Octacoseno 0,51 ± 0,22 0,14 ± 0,05 0,12 ± 0,03 0,18 ± 0,05 0,17 ± 0,05 0,13 ± 0,10 0,23 ± 0, Octacosano (n-c 28 ) 0,71 ± 0,98 0,28 ± 0,04 0,28 ± 0,08 0,95 ± 1,23 0,26 ± 0,08 0,72 ± 1,08 0,45 ± 0, (Z)-Nonacoseno 2,43 ± 2,17 4,36 ± 1,48 4,02 ± 0,76 4,30 ± 0,72 4,94 ± 1,61 2,59 ± 1,08 3,14 ± 0, (Z)-Nonacoseno 0,38 ± 0,31 0,22 ± 0,06 0,23 ± 0,05 0,18 ± 0,03 0,96 ± 2,44 0,24 ± 0, Nonacosano (n-c 29 ) 3,59 ± 2,17 4,22 ± 1,18 4,49 ± 1,05 4,08 ± 1,71 3,79 ± 1,57 5,42 ± 2,13 6,31 ± 1,38 * Metil C 29; 11-Metil C 29 0,99 ± 1,00 0,42 ± 0,35 0,28 ± 0,09 0,25 ± 0,12 0,28 ± 0,13 0,17 ± 0,08 0,17 ± 0, Triacontano (n-c 30 ) 1,42 ± 4,22 0,10 ± 0,16 0,06 ± 0,05 0,10 ± 0,08 0,04 ± 0,01 1,25 ± 3,75 0,08 ± 0, (Z)-Hentriaconteno 9,32 ± 3,83 11,54 ± 3,13 9,67 ± 1,46 11,50 ± 3,28 11,48 ± 2,61 7,62 ± 2,45 9,03 ± 1, Hentriacontano (n-c 31 ) 1,40 ± 0,74 1,66 ± 1,10 0,96 ± 0,46 1,48 ± 0,72 2,74 ± 1,80 1,15 ± 0,33 1,36 ± 0,29 * Metil C 31 ; 11-Metil C 31 0,55 ± 0,22 0,63 ± 0,23 0,47 ± 0,15 0,42 ± 0,14 0,54 ± 0,24 0,32 ± 0,12 0,34 ± 0, (Z)-Dotriaconteno 0,14 ± 0,04 0,13 ± 0,05 0,18 ± 0, Dotriacontano (n-c 32 ) 0,13 ± 0,12 0,07 ± 0,17 0,02 ± 0, (Z,Z)-Tritriacontadieno 0,31 ± 0,19 0,38 ± 0,20 0,33 ± 0,14 0,31 ± 0,15 0,36 ± 0,18 0,24 ± 0,11 0,21 ± 0, (Z,Z)-Tritriacontadieno 0,71 ± 0,93 0,29 ± 0,13 0,26 ± 0,08 0,22 ± 0,12 0,25 ± 0,14 0,32 ± 0,64 0,13 ± 0, (Z)-Tritriaconteno 2,03 ± 1,38 1,06 ± 0,26 1,01 ± 0,33 2,19 ± 1,92 1,28 ± 0,49 1,17 ± 0,45 1,51 ± 0, Tritriacontano (n-c 33 ) 0,44 ± 0,24 1,09 ± 1,07 0,51 ± 0,55 0,53 ± 0,50 0,33 ± 0,16 0,31 ± 0,27 0,28 ± 0,08 * Compostos que eluíram no mesmo tempo de retenção. ** Proporção de 5-Metil C 25 + fitalato 36

38 Resultados Tabela 4 Análise discriminante aplicada aos hidrocarbonetos cuticulares de operárias de Melipona scutellaris (colônia 1) em relação à sua idade. RE operárias recém-emergidas. Distância de Mahalanobis F 15,42 P RE x 7 dias 274,26 64,96 < 0,001 RE x 14 dias 249,65 62,41 < 0,001 RE x 21 dias 201,57 50,39 < 0,001 RE x 28 dias 235,21 55,70 < 0,001 RE x 35 dias 234,65 55,57 < 0,001 RE x 42 dias 926,06 163,64 < 0,001 7 dias x 14 dias 18,15 4,30 < 0,001 7 dias x 21 dias 29,84 7,07 < 0,001 7 dias x 28 dias 18,89 4,25 < 0,001 7 dias x 35 dias 22,50 5,06 < 0,001 7 dias x 42 dias 900,30 162,05 < 0, dias x 21 dias 7,87 1,97 < 0,05 14 dias x 28 dias 2,88 0,68 = 0, dias x 35 dias ,34 = 0, dias x 42 dias 963,95 180,74 < 0, dias x 28 dias 6,66 1,58 = 0, dias x 35 dias 10,70 2,53 < 0,01 21 dias x 42 dias 953,14 178,71 < 0, dias x 35 dias 7,15 1,61 = 0, dias x 42 dias 902,52 162,45 < 0, dias x 42 dias 912,99 164,34 < 0,001 37

39 Resultados RE 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias Figura 6 Análise canônica realizada com os hidrocarbonetos cuticulares de operárias de Melipona scutelaris (colônia 1) em relação à sua idade (dias). RE operárias recémemergidas. 38

40 Resultados Colônia 2 A análise química da epicutícula de operárias de Melipona scutellaris identificou 42 hidrocarbonetos (Tabela 5). Esses compostos compreenderam alcanos lineares, alcenos, alcadienos e metil alcanos, dos quais, os dois primeiros são os mais representativos. De maneira geral, os compostos mais abundantes em todos os grupos etários foram o Heptacoseno (TR min), seguido por Hentriaconteno, Pentacosano e Heptacosano. As abelhas com menos de 24h pós emergência (RE) caracterizaram-se pela ausência de Pentacoseno (TR 27,583 e 27,894min), Heptacoseno (TR 32,055min) e Nonacoseno (TR 36,724min). Nesse grupo de indivíduos, o Tricosano apresentou alta proporção, a qual diminuiu substancialmente nas outras faixas etárias. As operárias com 7 e 14 dias possuem composição bastante similar, caracterizando-se pela ausência de Docosano, Pentacoseno (TR 27,894min), 7-Metil C 25 e 9-Metil C 27. Ainda quanto à ausência de compostos, os indivíduos com mais de 21 dias não apresentaram Nonadecano. Desses indivíduos mais velhos, nos de 28 dias também não foi encontrado Pentacoseno (TR 27,894min). O fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 46, 16% da variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores descreveu 75,09% dessa variação e a soma dos três primeiros fatores descreveu 81,79%. A análise discriminante foward stepwise (nível de tolerância = 0.05) separou os grupos de operárias de acordo com os hidrocarbonetos cuticulares (Modelo Global: Wilk s Lambda = 0,00057; F 78,28 = 10,198; p < 0,001) (Figura 7). Os compostos utilizados para a análise foram Tricosano, 3-Metil C 23, (Z)-Pentacoseno (TR ), 5-Metil C 25, Hexacosano, (Z)- Heptacoseno (TR ), Heptacosano, 5-Metil C 27, 39

41 Resultados Tabela 5 - Valores médios e desvio padrão da proporção relativa de hidrocarbonetos de operárias de Melipona scutellaris (colônia 2) em diferentes idades. TR tempo de retenção (minutos); RE operárias recém-emergidas. TR COMPOSTO RE 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias Nonadecano (n-c 19 ) 0,15 ± 0,05 0,69 ± 0,48 0,35 ± 0,22 0,24 ± 0, Heneicosano (n-c 21 ) 0,41 ± 0,20 0,09 ± 0,04 0,10 ± 0,04 0,08 ± 0,05 0,28 ± 0,29 0,29 ± 0,21 0,33 ± 0, Docosano (n-c 22 ) 0,24 ± 0,18 0,05 ± 0,03 0,05 ± 0,03 0,16 ± 0,13 0,08 ± 0, (Z)-Tricoseno 1,98 ± 0,95 0,16 ± 0,09 0,50 ± 0,19 1,05 ± 0,55 0,91 ± 0,49 0,10 ± 0,09 0,44 ± 0, Tricosano (n-c 23 ) 16,24 ± 5,65 1,78 ± 0,27 1,96 ± 0,33 1,90 ± 0,67 2,38 ± 0,94 0,69 ± 0,57 3,00 ± 1, Metil C 23 0,14 ± 0,07 0,09 ± 0,04 0,16 ± 0,07 0,29 ± 0,09 0,26 ± 0,10 3,21 ± 4,83 0,19 ± 0, Tetracosano (n-c 24 ) 0,57 ± 0,13 0,32 ± 0,09 0,27 ± 0,13 0,32 ± 0,14 0,37 ± 0,14 0,13 ± 0,08 0,45 ± 0, (Z)-Pentacoseno 7,29 ± 2,52 5,84 ± 1,85 8,36 ± 2,58 11,74 ± 3,08 12,12 ± 5,28 0,25 ± 0,15 8,15 ± 3, (Z)-Pentacoseno 0,40 ± 0,09 0,31 ± 0,10 0,41 ± 0,11 0,42 ± 0,11 6,07 ± 3,77 0,33 ± 0, (Z)-Pentacoseno 0,27 ± 0,22 0,24 ± 0,15 0,44 ± 0, Pentacosano (n-c 25 ) 23,28 ± 6,14 15,54 ± 3,70 11,14 ± 4,88 11,25 ± 3,34 12,54 ± 6,02 0,25 ± 0,04 19,30 ± 5, * 13-Metil C 25 ; 11-Metil C 25; 9-Metil C 25 0,09 ± 0,06 0,12 ± 0,05 0,14 ± 0,07 0,25 ± 0,07 0,24 ± 0,08 9,78 ± 6,30 0,18 ± 0, Metil C 25 0,05 ± 0,03 0,09 ± 0,03 0,08 ± 0,03 0,12 ± 0,07 0,05 ± 0, Metil C 25 0,40 ± 0,19 0,11 ± 0,04 0,10 ± 0,04 0,16 ± 0,11 0,12 ± 0,04 0,05 ± 0,03 0,10 ± 0, Metil C 25; (Z)-Hexacoseno * 0,18 ± 0,06 0,54 ± 0,19 0,64 ± 0,21 0,94 ± 0,26 0,85 ± 0,28 0,13 ± 0,11 0,67 ± 0, Hexacosano (n-c 26 ) 0,35 ± 0,12 0,59 ± 0,16 0,51 ± 0,16 0,54 ± 0,20 0,50 ± 0,24 0,41 ± 0,31 0,66 ± 0, (Z)- Heptacoseno 5,02 ± 1,20 22,82 ± 5,83 26,42 ± 5,30 25,43 ± 4,85 25,73 ± 6,77 0,34 ± 0,18 19,23 ± 6, (Z)- Heptacoseno 0,45 ± 0,10 0,32 ± 0,08 0,75 ± 1,00 0,40 ± 0,06 12,94 ± 10,60 0,37 ± 0, Heptacosano (n-c 27 ) 9,04 ± 3,31 13,94 ± 4,10 14,06 ± 3,86 10,16 ± 2,98 11,61 ± 4,45 0,40 ± 0,34 15,39 ± 4, * 13-Metil C 27 ; 11-Metil C 27 0,13 ± 0,04 0,22 ± 0,13 0,19 ± 0,06 0,41 ± 0,29 0,31 ± 0,09 7,75 ± 4,50 0,24 ± 0, Metil C 27 0,07 ± 0,03 0,06 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,19 ± 0,12 0,04 ± 0, Metil C 27 0,66 ± 0,37 0,06 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,07 ± 0,07 0,05 ± 0,02 0,04 ± 0,02 0,05 ± 0,02 Continua 40

42 Resultados Continuação Tabela 5 - Valores médios e desvio padrão da proporção relativa de hidrocarbonetos de operárias de Melipona scutellaris (colônia 2) em diferentes idades. TR tempo de retenção (minutos); RE operárias recém-emergidas (Z)-Octacoseno 0,49 ± 0,29 0,08 ± 0,02 0,11 ± 0,03 0,12 ± 0,03 0,38 ± 0,66 0,05 ± 0,02 0,21 ± 0, Octacosano (n-c 28 ) 0,24 ± 0,16 0,31 ± 0,12 0,25 ± 0,10 0,26 ± 0,11 0,36 ± 0,20 0,14 ± 0,21 0,33 ± 0, (Z)-Nonacoseno 2,95 ± 0,50 4,01 ± 1,00 4,63 ± 0,81 4,85 ± 0,84 3,86 ± 0,70 0,22 ± 0,22 3,05 ± 0, (Z)-Nonacoseno 0,41 ± 0,08 0,22 ± 0,03 0,26 ± 0,04 0,21 ± 0,06 0,21 ± 0,09 0,21 ± 0, Nonacosano (n-c 29 ) 3,81 ± 1,00 6,20 ± 2,08 5,83 ± 1,90 4,88 ± 1,58 4,71 ± 2,14 2,41 ± 1,81 6,38 ± 1, * 13-Metil C 29; 9-Metil C 29 0,85 ± 0,44 0,16 ± 0,07 0,09 ± 0,02 0,19 ± 0,09 0,14 ± 0,05 0,16 ± 0,13 0,15 ± 0, Triacontano (n-c 30 ) 0,07 ± 0,11 0,14 ± 0,06 0,10 ±0,05 0,20 ± 0,09 0,10 ± 0,07 3,41 ± 1,90 0,10 ± 0, (Z)-Hentriaconteno 17,75 ± 4,55 17,12 ± 2,98 16,86 ± 2,62 15,42 ± 2,70 13,01 ± 2,89 0,21 ± 0,25 11,90 ± 2, Hentriacontano (n-c 31 ) 1,07 ± 0,45 2,65 ± 2,61 1,67 ± 0,60 1,75 ± 0,80 1,61 ± 0,83 0,86 ± 0,47 2,31 ± 0, * 15-Metil C 31 ; 13-Metil C 31 0,37 ± 0,21 0,38 ± 0,10 0,26 ± 0,07 0,41 ± 0,16 0,32 ± 0,14 0,22 ± 0,07 0,28 ± 0, (Z,Z)-Tritriacontadieno 0,28 ± 0,14 0,18 ± 0,03 0,14 ± 0,04 0,16 ± 0,03 0,09 ± 0,03 0,10 ± 0,04 0,12 ± 0, (Z,Z)-Tritriacontadieno 0,33 ± 0,19 0,07 ± 0,04 0,06 ± 0,02 0,08 ± 0,02 0,09 ± 0,10 9,59 ± 6,93 0,05 ± 0, (Z)-Tritriaconteno 3,64 ± 1,24 3,53 ± 0,65 3,33 ± 0,42 4,23 ± 1,23 3,68 ± 0,64 1,40 ± 0,79 4,04 ± 0, Tritriacontano (n-c 33 ) 0,34 ± 0,20 0,64 ± 0,30 0,57 ± 0,24 0,72 ± 0,35 0,68 ± 0,42 0,24 ± 0,12 1,21 ± 0,45 * Compostos que eluíram no mesmo tempo de retenção. 41

43 Resultados 13-Metil C 29, 9-Metil C 29, (Z,Z)-Tritriacontadieno (TR ) e (Z)-Tritriaconteno. A classificação da matriz apontou um total de 100% de correta alocação das operárias com menos de 21 dias dentro do grupo previsto. Esse percentual foi de 70% para os indivíduos entre 21 e 35 dias e de 66,67 para os de 42 dias de idade. Tabela 6 Análise discriminante aplicada aos hidrocarbonetos cuticulares de operárias de Melipona scutellaris (colônia 2) em relação à sua idade. RE operárias recém-emergidas. Distância de Mahalanobis F 13,49 P RE x 7 dias 382,39 111,92 < 0,001 RE x 14 dias 387,69 119,77 < 0,001 RE x 21 dias 386,94 119,55 < 0,001 RE x 28 dias 368,74 113,92 < 0,001 RE x 35 dias 338,97 104,73 < 0,001 RE x 42 dias 356,15 104,24 < 0,001 7 dias x 14 dias 17,30 5,06 < 0,001 7 dias x 21 dias 18,00 5,27 < 0,001 7 dias x 28 dias 29,31 8,58 < 0,001 7 dias x 35 dias 28,05 8,21 < 0,001 7 dias x 42 dias 30,33 8,43 < 0, dias x 21 dias 13,18 4,07 < 0, dias x 28 dias 14,11 4,36 < 0, dias x 35 dias 16,57 5,12 < 0, dias x 42 dias 12,17 3,56 < 0, dias x 28 dias 10,99 3,40 < 0, dias x 35 dias 20,99 6,48 < 0, dias x 42 dias 11,94 3,49 < 0, dias x 35 dias 9,57 2,96 < 0,01 28 dias x 42 dias 4,99 1,46 = 0, dias x 42 dias 6,63 1,94 < 0,05 42

44 Resultados RE 07 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias Figura 7 Análise canônica realizada com os hidrocarbonetos cuticulares de operárias de Melipona scutelaris (colônia 2) em relação à sua idade. RE operárias recém-emergidas. 43

45 Discussão 4. DISCUSSÃO As operárias de Melipona scutellaris viveram, em média, 41,50 ± 13,07 dias na colônia 1 e 45,97 ± 16,99 dias na colônia 2, sendo a longevidade máxima de 70 e 75 dias, respectivamente. Esses resultados diferem do encontrado anteriormente para uma colônia da mesma espécie, na qual a média de sobrevivência foi de 70,02 ± 14,97, com longevidade máxima de 86 dias (ROSELINO, A. C.; HRNCIR, M. & ZUCCH, 2006). Em outras espécies de Meliponinae foram encontradas as seguintes longevidades: Friesella schrottky Friese, 30.1 dias (CAMILLO-ATIQUE, 1977), F. languida, 33.3 dias (RIBEIRO, 1989), M. bicolor bicolor, 44.0 dias (BEGO, 1983), Scaptotrigona postica para três colônias estudadas, 26.3 dias, 39.5 dias e 32.9 dias (SIMÕES; BEGO, 1991) e M. favosa, 40.0 dias (SOMMEIJER, Essa variação encontrada, tanto para a espécie em estudo quanto para as demais citadas, pode ser explicada pelo fato de o tamanho e a estrutura da população de operárias de uma colônia mudar ao longo do tempo e essa mudança estar associada a fase de desenvolvimento da colônia, época do ano, disponibilidade de comida, pressão de predação e condições climáticas (OSTER; WILSON, 1978). O presente estudo mostrou que há uma relação entre o tipo de atividade desempenhada e a idade do indivíduo, apesar de da sobreposição temporal na realização das mesmas. Segundo Giannini (1997), a sobreposição de tarefas é um ponto importante de ser ressaltado e seria resultado da capacidade da operária em realizar mais de uma tarefa em uma mesma idade. Essa capacidade foi apresentada em Melipona rufiventris flavolineata na estação quente do ano, evidenciando também uma capacidade adaptativa da alocação de tarefas às condições climáticas (CECCATO, 1970). 44

46 Discussão A manipulação de cerume é a primeira atividade realizada por Melipona scutellaris, fato que está de acordo com o encontrado em outras espécies de abelhas sem ferrão como Scaptotrigona xanthotricha (HEBLING et al., 1964), Melipona bicolor (BEGO, 1983), Scaptotrigona postica (SIMÕES, BEGO, 1991), Plebeia remota (van BENTHEM, IMPERATRIZ-FONSECA, VELTHUIS, 1995) Trigona (Tetragonula) minangkabau (INOUE; SALMAH; SAKAGAMI, 1996) e Melipona compressipes fasciculata (GIANNINI, 1997). A distribuição temporal da atividade de adição de cera ao depósito na colônia 1 não pode ser inferida devido ao seu número reduzido de registros. Na colônia 2, a tarefa foi realizada por indivíduos com idade média de 18,14 ± 8,99 dias de idade, comparável à idade média de produção de cera (11,70 ± 7,61 dias). O dado referente à produção de cera não foi apresentado nos resultados pelo fato dessa não ser aqui considerada uma atividade e sim um estado fisiológico das abelhas. Em Apis mellifera e nos meliponíneos, a produção de cera ocorre aproximadamente na mesma idade, a qual coincide com a fase na qual as operárias são cuidadoras (HEBLING; KERR; KERR, 1964). Resultados para quatro espécie de Meliponini mostraram que essas glândulas apresentaram máximo desenvolvimento, principalmente, quando as operárias trabalhavam na area de cria, construindo e aprovisionando células de cria (CAVALCANTE, OLIVEIRA; CRUZ-LANDIM, 2000). As atividades de reprodução do ninho, a saber, aprovisionamento de células de cria, construção de célula e operculação de célula se sobrepõem completamente, sendo realizadas por abelhas entre 3 e 20 dias de vida adulta. Operárias de Melipona favosa também fizeram parte de uma estreita faixa etária, a qual foi de 5 a pouco mais de 20 dias (SOMMEIJER, 1984). Estudo anterior, com a mesma espécie, revelou que os indivíduos mais ativos na construção de células são também os mais importantes aprovisionadores destas 45

47 Discussão (SOMMEIJER, BEUVENS, VERBEEK, 1982). Essa pode ser uma explicação para o fato de, em Melipona scutellaris, ter sido observado que alguns indivíduos construtores de célula nunca realizaram aprovisionamento. Situação similar foi encontrada em Trigona pallens (SILVA, 2008). O trabalho com lixo foi realizado por indivíduos com idade intermediária, compreendendo o intervalo entre 16 e 48 dias, exceto para alguns indivíduos da colônia 2 que estiveram engajados nessa atividade quando ainda bem jovens. Esses resultados diferem, parcialmente, do encontrado em Trigona pellucida, cujos indivíduos jovens também estiveram envolvidos nessa atividade (MATEUS, ZUCCHI, 2008). Em Trigona pallens, indivíduos jovens também realizaram manipulação do lixo, contudo os de idade intermediária estiveram mais envolvidos (SILVA, 2008). Os resultados para Melipona scutellaris são comparáveis aos encontrados por Ferreira-Caliman (2010). As atividades de recepção e desidratação de néctar são realizadas por indivíduos a partir dos 20 dias de vida, um pouco antes de ser iniciada a tarefa de forrageio. Esse padrão difere, parcialmente, ao encontrado em Melipona compressipes fasciculata, espécie na qual a recepção de néctar começa quando as abelhas são ainda jovens (GIANNINI, 1997). A atividade de forrageamento foi realizada por indivíduos mais velhos, corroborando com o processo de maturação comportamental, no qual indivíduos jovens realizam atividades dentro do ninho e quando mais velhos realizam atividades fora dele (HUANG, PLETTNER, ROBINSON, 1998; ROBINSON, 1992). Essa dicotomia etária da execução de tarefas também pode ser associada aos riscos envolvidos com sua realização, sendo que as desempenhadas dentro do ninho são mais seguras do que as realizadas fora dele (SAKAGAMI, FUKUDA, 1968; WINSTON, KATZ, 1981). 46

48 Discussão Na formiga Ponera pennsylvannica, foi observada uma grosseira divisão de trabalho entre cuidadoras da cria e forrageiras, na qual os indivíduos jovens permaneceram no ninho cuidando da cria e os mais velhos saíam para o forrageamento. Esse polietismo temporal esteve associado à demografia das colônias, sendo exibido apenas naquelas em que tinham maior produção de indivíduos e, portanto, maior demanda de tinham ninhadas relativamente grandes quando as primeiras operárias jovens emergiam (PRATT; CARLIN; CALABI, 1994). Quanto à composição química cuticular, operárias de M. scutellaris apresentaram grande diversidade de hidrocarbonetos com cadeias carbônicas que variaram entre 19 e 33 átomos. Os compostos compreenderam alcanos, alcenos, alcadienos e metil alcanos, freqüentemente, com número ímpar de carbonos. As duas colônias estudadas são muito similares quanto à composição cuticular das operárias, sendo caracterizadas, principalmente, por não compartilharem alguns alcenos, alcadienos e metil alcanos. Os compostos identificados bem como suas concentrações relativas, principalmente a grande abundância de alcanos lineares como Pentacosano e Heptacosano, corroboram resultados para outras espécies de abelhas sem ferrão (ABDALLA et al., 2003, PIANARO et al., 2007, NUNES et al, 2009, FERREIRA-CALIMAN et at., 2010), além de grupos relacionados (formigas WAGNER, TISSOT, GORDON, 2001, vespas DANI et al., 2004, térmites KLOCHKOV, KOZLOVSKII, BELYAEVA, 2005) O presente estudo revelou o Nonadecano, composto com 19 átomos de carbono, encontrado pela primeira vez em abelhas sem ferrão por Nunes et al., (2009a). A pesar de não muito comum, hidrocarbonetos de cadeias pequenas tem sido identificados em grupos de insetos sociais, como vespas, abelhas melíferas e abelhas sem ferrão (SINGER, 1998; FRÖHLICH, TAUTZ, RIEDERER, 2000, FERREIRA-CALIMAN, 2010). Anteriormente, também em Melipona scutellaris, o Eicosano apresentou-se como composto exclusivo de 47

49 Discussão rainha (KERR, JUNGNICKEL, MORGAN, 2004). Isto pode relacionar-se ao fato de que as operárias analisadas eram forrageiras, via de regra, indivíduos mais velhos, os quais, como evidenciado nos resultados do presente trabalho, não possuem esse hidrocarboneto. A química cuticular de Melipona scutellaris, em estudo anterior (KERR, JUNGNICKEL, MORGAN, 2004), apresentou diversidade de compostos substancialmente menor em proporção do que aquela encontrada no presente estudo. Muito embora, o resultados para os compostos mais abundantes presentes na cutícula das operárias sejam congruentes. No referido trabalho, os autores utilizaram metodologia distinta (MORGAN, 1990) para caracterizar o perfil químico cuticular de machos, operárias e rainhas dessa espécie. Tal método não foi aqui utilizado por se tratar de um método destrutivo, comprometendo, assim, o bom andamento das análises comportamentais. A análise discriminante mostrou que, quanto aos hidrocarbonetos cuticulares, as operárias recém emergidas são as que mais se distanciam dos outros grupos. Em abelhas melíferas, os adultos emergem com um blank slate, o qual é caracterizado por um perfil cuticular muito menos rico quando comparado ao de indivíduos mais velhos (BREED et al., 1995). Nesse contexto, a exposição à cera dos favos é um meio de as abelhas incorporarem compostos à cutícula (ex. alcenos e ácidos graxos) (BREED et al., 2004a,b). O perfil de hidrocarbonetos das abelhas recém emergidas de Melipona scutellaris é caracterizado pela ausência de alguns compostos. Entretanto, a riqueza desses compostos encontrada no perfil de hidrocarbonetos das operárias recém emergidas é comparável ao dos outros grupos; as alterações nesse perfil ocorrem nas proporções relativas desses compostos. Portanto, diferente de abelhas melíferas, em M. scutellaris, a diferença encontrada entre os grupos resulta da diferença de proporções relativas e não da riqueza de compostos. 48

50 Discussão A análise canônica não ilustra a diferença entre os grupos etários analisados (Figs. 6 e 7). Contudo, as distâncias entre os grupos evidenciada pela análise discriminante (Tabelas 4 e 6) e pela da correta alocação de pelo menos 60% dos indivíduos nos referidos grupos permite dizer que há diferença química significativa entre os indivíduos nas diferentes idades. O fato de a análise canônica não evidenciar tal diferença pode ser resultado das grandes distâncias que separam o grupo das recém emergidas das demais operárias, havendo uma tendência de agrupamento entre os outros grupos menos distantes entre si. Embora essa possa ser uma assertiva, a grande flexibilidade na alocação de tarefas evidenciada pelos dados comportamentais não demonstra uma relação direta entre perfis de hidrocarbonetos e a tarefa desempenhada pelas operárias. Estudos demonstram que os indivíduos que pertencem a um grupo específico de tarefa possuem um perfil cuticular característico (HOWARD ET AL., 1982; BONAVITACOUGOURDAN et al., 1993; WAGNER ET AL., 1998; SEVALA et al., 2000; NUNES et al., 2009a,b; KARTHER, DRIJFHOUT, MARTIN, 2011). Kaib et al. (2000) mostraram que, independente da idade, operárias de Myrmicaria eumenoides que desempenham atividades no ninho não mudam seus perfis de hidrocarbonetos. Os autores afirmam que a variação da química cuticular é pouco correlacionada com a idade, mas muito correlacionada com a alocação de tarefa de cada indivíduo. As diferenças podem ser influenciadas pelo contato diferencial dos indivíduos com compostos como cera, feromônios de rainha e alimentos. Além disso, indivíduos engajados em atividades de forrageio são suscetíveis à mudanças de perfil cuticular devido à volatilização de compostos e maior contato com os recursos trazidos à colônia. 49

51 Considerações finais 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS As atividades desempenhadas por operárias de Melipona scutellaris se sobrepuseram ao longo do tempo, evidenciando uma relação entre o tipo de atividade que o indivíduo realiza e a idade do mesmo. Além disso, a seqüência temporal de realização dessas tarefas está de acordo ao encontrado para outras espécies de abelhas sem ferrão. Quanto à química cuticular da espécie estudada, o presente estudo levantou informações inéditas sobre a dinâmica dos hidrocarbonetos de cutícula ao longo da idade das operárias. Diferente do encontrado em abelhas do gênero Apis, a riqueza de compostos encontrada na cutícula de operárias recém-emergidas é similar a apresentada por indivíduos mais velhos. Sendo, portanto, as proporções relativas dos compostos a fonte da diferença entre esses grupos de indivíduos. Além disso, a grande flexibilidade na alocação de tarefas evidenciada pelos dados comportamentais não demonstra uma relação direta entre perfis de hidrocarbonetos e a tarefa desempenhada pelas operárias. 50

52 Referências 5.REFERÊNCIAS 2 ABDALLA, F. C.; JONES, G. R.; MORGAN, E. D. & CRUZ-LANDIM, C. Comparative study of the cuticular hydrocarbon composition of Melipona bicolor Lepeletier, 1836 (Hymenoptera, Meliponini) workers and queens. Genetics and Molecular Research, v. 2, p , AITCHISON, J. The Statistical Analysis of Compositional Data. Chapman and Hall, London, 416 p., ALTMANN, J. Observation study of behavior: sampling methods. Behavior, v. 49, p , ATKINS, M. D. Introduction to insect behaviour. Macmillan Publi., New York, BEGO, L. R. On some aspects of in Melipona bicolor bicolor Lepeletier (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae). Revista Brasileira de Entomologia, v. 27, p , BILLEN, J. Signal variety and communication in social insects. Proceedings of the Netherlands Entomological Society Meetings, v. 17, p. 9-25, BLOMQUIST, G. J.; TILLMAN, J. A.; MPURU, S. & SEYBOLD, S. J. The cuticle and cuticular hydrocarbons of insects: structure, function, and biochemistry. In: VANDER MEER, R. K.; BREED, M. D.; WINSTON, M.L. & ESPELIE, K.E. (Eds.), Pheromone Communication in Social Insect. Westview Press, Boulder, pp , BONAVITACOUGOURDAN, A., CLEMENT, J. L., & LANGE, C. Functional subcaste discrimination (foragers and brood-tenders) in the ant Camponotus-vagus scop Polymorphism of cuticular hydrocarbon patterns. Journal of Chemichal Ecology, v. 19, p , De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas. NBR

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61 Referências WILLIAMS, I. H.; BALL, B. V.; TOMKINS, P. W. & CARRECK, N. L. Rothamsted: cradle of agricultural and apicultural research. Bee World, v. 74, p , WILSON, E. Pheromones. Scientific American, v. 208, p , WILSON, E. O. The Insect Societies. Belknap/Harvard University Press, Cambridge, MA. 548 p., WILSON, E. O. The sociogenesis of insects colonies. Science, v. 228, n. 4707, p , WINSTON, M. L. & KATZ, S. J. Foraging differences between cross-fostered honeybee workers (Apis mellifera) of European and Africanized races. Behavioral Ecology and Sociobiology, v. 10, n. 2, p ,

62 Anexos ANEXOS 61

63 Anexos ANEXO A Figura 1. Diferentes áreas da colônia de Melipona scutellaris. A - região de cria; B - área de estoque de alimento; C - região de acúmulo de lixo; D - caixa de entrada. 62

64 Anexos ANEXO B Figura 1. Alguns comportamentos realizados pelas operárias de Melipona scutellaris. A construção de célula de cria; B trabalho no invólucro; C adição de cera ao depósito; D fechamento de frestas entre o vidro e a caixa de observação; E manipulação de lixo; F trofalaxia; G desidratação de néctar; H forrageamento. 63