Efeito do Etileno na Abcisão Foliar

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1 Relatório de Trabalho Prático da Disciplina de Fisiologia Vegetal 2011/20112 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Efeito do Etileno na Abcisão Foliar Ana Raquel Ferreira Martins, Gabriel António Monteiro Pinto, Sara Moniz Rosas Introdução A abcisão foliar é o processo que leva à queda de folhas, semelhante ao que acontece também com frutos e flores. Ao nível celular, há células específicas no pecíolo que se diferenciam morfológica e bioquimicamente e formam uma camada de abcisão, separando o órgão senescente da planta. Este processo depende da ação de enzimas que hidrolisam a parede celular, como a celulase e a poligalacturonase. Os protoplastos libertados expandem, afastando as células xilémicas e facilitando a separação do órgão (neste caso, folha) da planta. O etileno, por sua vez, é uma hormona gasosa que regula a abcisão foliar, e o seu efeito é reprimido pela hormona auxina. No entanto, concentrações mais elevadas de auxina revelaram experimentalmente que promovem a queda das folhas porque estimulam a produção de etileno. Isto acontece porque a auxina estimula a atividade da ACC sintetase, enzima com um papel predominante na síntese do etileno. A auxina, por sua vez, é inibida pela luminosidade. O controlo hormonal da abcisão divide-se em três fases: durante a fase de manutenção, antes de ser recebido qualquer sinal que promova a abcisão, a auxina tem um gradiente de concentração em toda a área foliar, prevenindo o seu degradamento; na fase indutiva, os níveis de auxina na folha diminuem, e o etileno torna-se significativo na zona de abcisão, agora sensível ao seu efeito; por fim, as células da zona de abcisão começam a produzir as enzimas hidrolíticas, levando à queda da folha. Pode-se concluir que a auxina é o principal inibidor do efeito do etileno durante a abcisão. No entanto existem outros fatores que inibem ou promovem esse

2 efeito, desde condições ambientais, stresses físicos e químicos a outras hormonas. Existem ainda inibidores específicos da síntese do etileno, como aminoetoxivinilglicina e ácido aminoxiacético e iões cobalto, como também inibidiores da ação do etileno, como o catião prata e o dióxido de carbono atmosférico em determinadas concentrações. O objetivo principal deste trabalho experimental é verificar o efeito da auxina e do etileno na abcisão foliar em folhas de Jacaranda sp. Para tal recorremos uma solução de Ethrel, ou ácido 2-cloroetil-fosfónico, um composto libertador de etileno, já que é difícil manusear o último na sua forma gasosa por se difundir rapidamente. Usamos ainda ácido naftaleno acético (NAA) que é uma hormona sintética (não ocorre naturalmente) da família das auxinas. O tiossulfato de prata será o dador do catião prata, um inibidor da ação do etileno. Por último, este trabalho experimental tem também como objetivo permitir a apreciação do papel da síntese proteica no processo da abcisão foliar. Recorremos assim à cicloheximida, que inibe a síntese proteíca em ribossomas de eucariontes, mas não em procariontes, mitocôndrias ou cloroplastos. Material e Métodos Material utilizado para a realização da experiência: - folhas de Jacaranda sp. - NAA (ácido naflalenoacético) 1% em lanolina - Cicloheximida - Solução Tampão Fosfato 0,005 M ph 7,5 - Ethrel (ácido 2-cloroetil-fosfónico) - Tiossulfato de prata

3 Métodos 1- Remover da placa de Petri uma porção de agar (um rectângulo) para que se possam colocar as porções de pínulas. 2- Da folha de Jacaranda sp. devem-se retirar várias porções de pínulas, sendo que estas devem ser agrupadas em quatro pínulas por porção. Após esta seleção estar feita, deve-se cortar 1/3 do limbo das pínulas. 3- Coloca-se 6 porções de pínulas em cada placa de Petri com Agar, com uma pinça esterilizada. É necessário ter cuidado ao colocar as pínulas na placa de Petri, estas não devem ficar em contacto com as paredes da placa, devem ficar suspensas. Este procedimento utiliza-se para todos os tratamentos, excepto para o tratamento C e E; nestes após a retirada do agar deve colocar-se papel de filtro. 4- Uma vez colocados as porções de Jacaranda sp., as placas de Petri são vedadas com parafilme, e colocadas em condições de obscuridade à temperatura ambiente. 5- Todos os dias, deve ser feito o registo do número do pínulas que caí, durante uma semana. Se necessário, bater levemente na placa de Petri de modo a que as folhas que estão soltas, caiam. Tratamentos que devem ser realizados em cada Placa de Petri A B C D E F Sem tratamento (controlo) Aplicar NAA 1% em lanolina, directamente sobre a zona da abcisão foliar. Deitar 1 ml da solução de Ethrel sobre o papel de filtro, adicionar 1 ml da solução tampão Colocar cicloheximida em lanolina sobre a zona de abcisão Aplicar cicloheximida em lanolina sobre a zona de abcisão e Ethrel mais solução tampão no papel de filtro Estes explantes a usar dever ter sido previamente mergulhados na solução de tiossulfato de prata (30-60 min, em condições de obscuridade)

4 Resultados A B C D E F 1º Dia 0% 0% 0% 0% 0% 0% 2º Dia 0% 0% 50% 0% 0% 0% 3º Dia 14% 0% 75% 5% 42% 17% 4º Dia 28% 5% 83% 17% 50% 19% 5º Dia 84% 14% 100% 28% 56% 22% 6º Dia 100% 28% 100% 50% 75% 25% 7º Dia 100% 42% 100% 50% 100% 50% Tabela 1: Tabela Representativa do número de pínulas caídas ao longo de 7 dias. Gráfico Representativo da percentagem de pínulas caídas ao longo de 7 dias, de acordo com o seu tratamento 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% A B C D E F 10% 0% 1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia 5º Dia 6º Dia 7º Dia Discussão de Resultados No tratamento A, o padrão dos resultados, onde não foi aplicado nenhum composto, o corte da folha leva a um relativamente rápido desaparecimento do gradiente de auxina, levando a uma senescência progressiva quase linear, quando enquadrada sobre o tempo. Acaba no 6º dia onde todas as pínulas estão caídas. Denota-se então dois aspetos importantes neste padrão, úteis para comparação futura: 1. Só se verificaram as primeiras folhas caídas no 3º dia; 2. Ao sexto dia as folhas estão sem pínulas restantes.

5 O tratamento B exibe um mais que evidente atraso da abcissão foliar. Nos sete dias de observação, o número de pínulas caídas é muito inferior ao número do controlo; uma razão que se pode aproximar como. Tem a peculiaridade de ser o único tratamento que consegue manter ao quarto dia todas as pínulas intactas. Este efeito deve-se à aplicação do NAA (ácido 1-naftalenoacético), visto que este é uma auxina sintética e portanto, interferirá no gradiente de auxinas, mantendo-o por mais tempo e tornando as células da camada de abcisão insensíveis ao etileno, fazendo com que a abcisão foliar seja retardada. Já na caixa de Petri C as porções de folhas tratadas com a solução de Ethrel evidenciam uma abcisão muito mais rápida que em A, estando já no 5º dia 100% das folhas caídas. Quebra-se aqui novamente a característica 1. do padrão, obtendo-se abcisão (e em porções muito significativas - 50%) em imediato no 2º dia. Novamente, este resultado vai de encontro ao esperado pois o Ethrel é um libertador de etileno. Este torna a folha mais sensível ao etileno, iniciando a síntese das enzimas hidrolíticas muito mais rapidamente, levando à abcisão foliar. O uso de cicloheximida, correspondente ao processo D, nas plantas inibe a síntese proteica, o que leva a uma menor produção das enzimas que degradam a parede celular, e consequentemente uma menor taxa de abcisão. Os resultados vão de encontro ao esperado, mostrando um abrandamento da senescência, este não é tão eficaz quanto o NAA, mas notável na mesma, acabando no 7º dia com apenas 50% das pínulas caídas, precisamente metade do controlo. No processo E o uso conjunto do Ethrel e da cicloheximida, dois reguladores de crescimento: um que garante uma maior produção de etileno e outro que facilita o movimento das auxinas, usados conjuntamente garante uma guerra de vontades. O vencedor será, após verificação experimental, o Ethrel que mantém a queda de folhas constante ao longo da experiência, garantindo que todas as pínulas fossem separadas no fim desta. Uma explicação são as diferentes velocidades de ação dos compostos: o etileno é um gás, logo é de rápida ação (como visto em C) mas a cicloheximida demora mais tempo para penetrar ao longo da camada de abcisão.

6 Como tal há uma produção suficiente de enzimas para negar o efeito posterior da cicloheximida na experiência. Na execução F, onde se aplicou uma solução de tiossulfato de prata, verifica-se uma diminuição do número de pínulas caídas. Está então concordante com a teoria que aponta para a prata, sob a forma de STS (tiossulfato de prata), como um bom inibidor da ação do etileno, moderando a produção de enzimas hidrolíticas. Termina ao 7º dia com apenas abcisão em 50%. Bibliografia (Maio 2012) Bin G. Kang et. all, Mechanism of Auxin-induced Ethylene Production, Plant Physiology, 1971, Vol.47, pp Yi Li & Daniel C. Walton, Effects of Cycloheximide on Abscisic Acid Biosynthesis and Stomatal Aperture in Bean Leaves, Plant Physiology, 1990, Vol. 93, pp HARTMANN, H. T. et. all, Journal of the American Society of Horticultural Science, 1970, Vol. 95 pp Page W. Morgan, Stimulation of Ethylene Evolution and Abscission in Cotton by 2- Cloroethanephosponic Acid, 1968, Plant Physiology, Vol. 44 pp Elmo M. Bayer, Abscission : The Initial Effect of Ethylene Is in the Leaf Blade, 1975, Plant Physiology, Vol. 55, pp Page W. Morgan & James I. Durham, Leaf Age and Ethylene-induced Abscission, 1973, Plant Physiology, Vol.52, pp B. Rubinstein & A.C. Leopold, Effect of Amino Acids on Bean Leaf Abscission, 1962, Plant Physiology, Vol. 37, pp ALBERTS, Bruce; et al. Molecular Biology of The Cell. 5th ed.. New York : Garland Science, pp. 354, , 1254 TAIZ, Lincoln; ZEIGER, Eduardo. Plant Physiology. 5th ed. Sinauer Associates 2010