Aspectos históricos da genética

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1 Aspectos históricos da genética Retrocedamos ao ano de 1900 (que na verdade é o último ano do século XIX), quando as leis de Mendel, originalmente publicadas em 1866, foram redescobertas. Três botânicos (Karl Correns da Alemanha, Hugo De Vries da Holanda e Erich von Tschermak-Seysenegg da Áustria), a partir de experimentos envolvendo cruzamentos com plantas, chegaram independentemente às mesmas conclusões que o monge austríaco havia chegado em 1866, ou seja, depois de 34 anos. O ano de 1900 costuma ser considerado como o marco da origem daquilo que se convencionou chamar de "Genética moderna". O intervalo de tempo entre a publicação das proposições de Mendel e de sua aceitação pela comunidade científica atesta que as idéias do pesquisador austríaco eram por demais avançadas para seu tempo. A grande novidade introduzida por Mendel nas suas interpretações dos resultados dos cruzamentos se refere ao emprego de um raciocínio matemático-probabilístico em Biologia, que não era de costume. A associação do raciocínio matemático com fenômenos biológicos acompanhou a Genética desde então. Esses pesquisadores concluíram que os caracteres que eram herdados de uma geração para outra o faziam por intermédio de fatores particulados que ocorriam aos pares. Embora as leis da hereditariedade sejam hoje consagradas, especialmente a primeira lei de Mendel, e são ministradas em todos os programas de ensino de Biologia ou Ciências, as conclusões desses geneticistas não foram aceitas imediata e completamente. No começo do século XX os conceitos de "mistura de sangue" para a explicação de fenômenos hereditários estavam amplamente arraigados. Para entendermos como esses conceitos têm sua força, basta atentarmos para alguns termos que são empregados até hoje, tais como "puro-sangue", "sangue azul", etc. Havia, no começo do século XX outras maneiras de se interpretar o fenômeno da hereditariedade, inclusive com a proposição de outras leis. O pesquisador britânico, Francis Galton, a partir de estudo com pares pais-filhos, propôs a "lei da regressão para a mediocridade". Vamos então aqui esquematizar a primeira lei de Mendel e a lei de Galton: 1 a Lei de Mendel: Nessa figura está representada a interpretação dada por Mendel a partir dos resultados obtidos a partir de cruzamentos realizados entre "linhagens puras", ou seja, linhagens que apresentavam apenas ervilhas com a cor verde ou apenas com a cor amarela. Na primeira geração (F 1 ), as plantas descendentes dos cruzamentos apresentavam a cor de apenas um dos progenitores, sendo essa denominada "dominante" e a outra de "recessiva". Quando as plantas F 1 eram cruzadas entre si, reaparecia a característica recessiva, em 1/4 dos descendentes. Esse fenômeno repetiu-se para mais seis outras características analisadas por Mendel. A interpretação, apresentada no esquema ao lado era a de que haveria dois fatores para cada característica. Lei da regressão para a mediocridade de Galton: No gráfico ao lado está representada a relação entre pais e filhos de uma variável métrica (por exemplo, altura). A linha azul representa o esperado se os filhos tivessem exatamente o valor da média dos pais. Note que pais que apresentam valores maiores da característica têm descendência com um valor médio da característica menor que a média observada daquela medida entre os pais. Por outro lado, os pais que tem o valor menor da característica têm os filhos com valores maiores que aquele da média entre os pais. Por isso a lei foi chamada de "regressão para a média". Como curiosidade, o método estatístico de ajuste de linhas pelo método dos mínimos quadrados é até hoje chamado de "regressão linear" por um dos seguidores de Galton, Pearson. O índice r que mostra quão bem os pontos experimentais se ajustam a uma reta é o coeficiente de regressão linear de Pearson.

2 Galtonistas X Mendelistas Os resultados e suas interpretações aparentemente antagônicas originaram uma disputa de natureza científica que durou as primeiras décadas do século XX. Essa disputa teve importância na discussão a respeito do processo de evolução biológica, pois Charles Darwin, um dos criadores da teoria da evolução por seleção natural junto com Alfred Russell Wallace, também inglês, acreditava que a evolução por seleção natural era um processo que ocorria sobre a variação genética de natureza contínua sendo, portanto, um processo gradual. Hugo De Vries foi um dos proponentes da teoria alternativa de "evolução por saltos", através de mutações de grande efeito, onde o processo não seria gradual. Havia ainda outros fatores envolvidos na disputa. De Vries, Wilhelm Johannsen e Wiliam Bateson são conhecidos como os "mendelistas de primeira hora", envolvidos com a divulgação da herança particulada. Galton era inglês e primo de Charles Darwin, fundou a escola biométrica com cientistas do porte de Karl Pearson, que desenvolveu métodos estatísticos usados até hoje, tornando a Inglaterra um reduto daqueles que estudavam herança de caracteres métricos. Os geneticistas mais ativos nos experimentos que dissecavam as leis de Mendel eram liderados principalmente pelo americano Thomas Hunt Morgan (originariamente embriologista). Essa diferença em termos da localização dos centros de pesquisa adicionava um sabor de regionalismo na disputa. Além do aspecto de regionalismo, Francis Galton esteve ativamente envolvido na prática da eugenia (um termo por ele cunhado, literalmente "genes bons"), que propunha o melhoramento genético da espécie humana. A eugenia chegou a se tornar uma prática popular nas primeiras décadas do século, inclusive com a publicação especializada, "Journal of Eugenics", fundada por Galton. Os exageros das práticas eugênicas (por exemplo, as práticas adotadas pelos nazistas na Alemanha e as esterilizações em massa nos Estados Unidos) ocasionaram o abandono desse tipo de prática, que é mal vista até os dias de hoje. Uma área atual dos procedimentos eugênicos é bastante ativa e severamente combatida principalmente com relação às iniciativas de empresas de seguro que buscam, através da análise de genes dos segurados, calcular o potencial de risco de doenças com componente hereditário com maior previsibilidade. Mas a disputa não era essencialmente regional ou política, envolvia um grande embate no campo científico. A seleção natural ou artificial em caracteres de natureza contínua foi posta à prova através de experimentos por diversas vezes. O grande geneticista dinamarquês, Wilhelm Johannsen, que cunhou os termos "gene", "genótipo" e "fenótipo" verificou experimentalmente a falta de resposta à seleção através de tentativas de seleção em plantas previamente endocruzadas sem ter se apercebido que estas não apresentam obviamente variabilidade genética. O termo "fenótipo" foi cunhado por Johannsen devido ao reconhecimento da importância do ambiente nas características que apresentam variação contínua. Morgan chegou a afirmar em 1932 que "A implicação da teoria de seleção natural de que selecionando-se os indivíduos mais extremos da população, a próxima geração mover-se-á na direção selecionada, é agora reconhecida como errada". Esse tipo de afirmação que contrariava a observação talvez milenar da prática do melhoramento genético de plantas e animais ilustra bem o abismo conceitual que existia entre aquilo que atualmente se chama de genética quantitativa e a genética mendeliana. A síntese Em 1866, no mesmo trabalho em que propôs suas leis, Mendel já havia percebido que, nos resultados do cruzamento entre duas espécies de Phaseolus, poderia haver a contribuição de dois fatores diferentes para a mesma característica, no caso a cor das pétalas e das sementes. O próprio Bateson chegou a reconhecer a existência de muitos genes para uma mesma característica como sendo uma das possíveis resoluções do conflito a respeito da natureza da variação contínua. Entretanto, a primeira demonstração experimental de que os caracteres mendelianos poderiam estar envolvidos na variação contínua foi feita pelo botânico sueco Nilsson-Ehle com cruzamentos envolvendo trigo, entre 1908 e Outros pesquisadores chegaram independentemente à mesma conclusão em 1910, através do estudo de variação contínua em milho (Edward East, um químico americano) e através do estudo da cor da pele humana (Charles Davenport, um eugenista americano). Em 1908, dois pesquisadores chegaram, independentemente, à conclusão de que não haveria necessidade de que uma população mantivesse as proporções 3:1 no caso de características mendelianas, como chegou a ser proposto na época. Godfrey Harold Hardy, o mais importante matemático inglês deste século publicou um artigo demonstrando que as freqüências dos genótipos não se alterariam ao longo das gerações pelo simples fato de que apresentavam herança mendeliana.

3 Wilhelm Weinberg ( ), um médico alemão preocupado com a herança do potencial de gerar filhos gêmeos em humanos, também chegou às mesmas conclusões. Os modelos desses dois pesquisadores resultaram naquilo que se conhece hoje como equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em 1918, o geneticista inglês Ronald Alymer Fisher, que prestava assessoria estatística (tendo inventado muitos procedimentos fundamentais para essa área da matemática, tal como o teste exato de Fisher e a análise de variância) para uma estação experimental de agricultura, publica um trabalho que é considerado como a formalização da síntese entre o mendelismo e a biometria. Fisher, junto com o geneticista americano Sewall Wrigth e o inglês John Burdon Sanderson Haldane construíram os pilares da Genética de populações. Essa área da Ciência, nascida no século XX, além de fornecer subsídios sólidos para toda a genética do melhoramento animal ou vegetal, também forma a base da teoria sintética da evolução. Os locos de caracteres quantitativos Embora seja um campo de pesquisa muito ativo na atualidade, a tentativa de identificar locos com efeito sobre caracteres quantitativos remonta quase ao princípio da Genética clássica. O que existe hoje é devido à enorme disponibilidade de marcadores moleculares, associado a um grande conhecimento do papel de locos individuais em muitos fenótipos. Os locos de caracteres quantitativos, que podem ser localizados graças à ligação genética com os marcadores têm a sigla QTL, do inglês Quantitative Trait Loci. Esta metodologia pode ser considerada como o coroamento da síntese entre a genética mendeliana e a genética quantitativa. Marcadores moleculares Para que se possa empreender um estudo de QTLs, é fundamental que se disponha de um conjunto de marcadores genéticos. No caso da estratégia dos locos candidatos, além do conhecimento prévio da função dos genes envolvidos na característica fenotípica que se deseja estudar, é fundamental que se disponha de meios para a caracterização dos alelos desses locos que estejam segregando na população ou linhagens estudadas. Atualmente se dispõe de um grande arsenal de métodos para a análise de marcadores moleculares, entretanto, falaremos apenas sobre aqueles que são mais empregados. A maioria dos métodos de detecção de polimorfismos moleculares emprega a técnica de eletroforese, cujos princípios estão ilustrados na figura ao lado: Na figura ao lado estão representadas as diferentes propriedades das macromoléculas e como estas influem na migração sob um campo elétrico em um meio gelatinoso ou poroso. Diferenças de tamanho, carga elétrica ou forma podem ser responsáveis por diferenças em migração.

4 Polimorfismos protéicos As proteínas podem apresentar variações alélicas em populações. Um caso bastante clássico de um polimorfismo protéico é aquele que é apresentado pelas hemoglobinas na espécie humana. Existe a hemoglobina A, também chamada de hemoglobina normal e a hemoglobina S, em que indivíduos homozigotos para essa forma apresentam a anemia falciforme (em inglês, sickle cell anemia, daí o S). A eletroforese permite distinguir as duas formas e a identificação é imediata, pois a hemoglobina é muito abundante no sangue e tem coloração avermelhada. As duas formas diferem em um aminoácido que apresenta carga elétrica diferente, o que resulta, como mostrado acima, em taxas de migração diferentes sob um campo elétrico. Em geral a aplicação desse método é restrita aos casos em que as diferentes formas sejam detectáveis por eletroforese (substituição de aminoácidos com a mesma propriedade podem resultar em diferenças críticas, ou seja, em diferenças que não podem ser detectadas). Outra restrição diz respeito ao método de detecção, pois os tecidos geralmente têm muitas proteínas diferentes. Esses podem ser diretos (como no caso da hemoglobina ou do citocromo) ou indiretos, através de colorações específicas empregando, por exemplo, associações de anticorpos específicos com corantes. O resultado de um experimento de eletroforese, assim como sua interpretação em termos de genótipo, aparece como na figura abaixo: Na figura ao lado há evidências de segregação de três alelos distinguíveis pela migração. Polimorfismos de isozimas As isozimas são formas diferentes de enzimas. Existem várias origens diferentes para as isozimas, mas a que pode ser empregada para estudos de segregação são aquelas originadas por diferentes formas alélicas. As isozimas dessa classe podem também ser denominadas pelo nome alozimas. Como as enzimas apresentam a propriedade de catalisar uma determinada reação química, isso propicia uma maneira de detectar a presença da própria enzima. Na figura abaixo está esquematizado um método de detecção de enzima que produz uma substância colorida: Depois de ocorrida a eletroforese, o gel é tratado com o substrato específico da enzima e uma substância que reage com o produto da reação com a formação de uma substância colorida. A vantagem de se analisar polimorfismos de enzimas é que estas têm seu papel fisiológico em geral conhecido podendo participar da composição do fenótipo que se deseja estudar. Entretanto, como no caso das proteínas, as enzimas (que também são proteínas) apresentam polimorfismos críticos.

5 Com o emprego de gel de amido para uma única eletroforese, podemos estudar diferentes enzimas, pois esse tipo de gel permite seu fatiamento como abaixo: Polimorfismos de DNA Com o advento da tecnologia do DNA recombinante e da amplificação enzimática de DNA por PCR, existe agora uma série de métodos que permitem a caracterização de polimorfismos moleculares com a utilização de DNA. A novidade mais importante para a área é que os marcadores obtidos com tecnologia de DNA tendem a ser muito mais polimórficos que os marcadores protéicos. Com isso, o potencial do uso de marcadores é atualmente ilimitado. A técnica de PCR A técnica de PCR (do inglês Polimerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase) consiste numa reação em que uma pequena e específica região do genoma é amplificada por síntese pela Polimerase do DNA. A PCR ocorre em vários ciclos, onde, em cada um deles, a cadeia específica teoricamente dobra de tamanho. Atenção: a frase "reação de PCR" é redundante, significa reação de reação em cadeia da polimerase! Abaixo está representado um ciclo de uma PCR, onde a polimerase do DNA é uma esfera verde, a cadeia "antiga" é azul, um primer é azul claro e o outro é verde, os nucleotídeos são vermelhos, assim como a cadeia sintetizada no presente ciclo:

6 Abaixo, está representada uma PCR nos seus primeiros ciclos: Microssatélites Após a PCR, os produtos da reação podem ser analisados por eletroforese, que aparece como acima. Note que nessa eletroforese aparecem diferenças em cada uma das linhas verticais, podendo haver detecção de um polimorfismo em um loco específico. Microssatélites, também conhecidos como polimorfismos VNTR (do inglês Variable Number of Tandem Repeats, número variável de repetições em tandem) do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats, repetições pequenas em tandem) são os marcadores moleculares mais empregados em estudos de QTLs pois são fáceis de se estudar por PCR e existem em vários organismos de interesse para melhoramento genético. Apresentam um nome esquisito por razões históricas. Quando se fazia a análise de DNA por ultracentrifugação em gradiente de Cloreto de Césio (que separa o DNA por sua densidade) apareciam bandas que ficavam ao lado da banda principal. A essas bandas foi atribuído o nome de DNA satélite, pois pareciam pequenos satélites ao lado de um planeta. Mais tarde esse DNA foi caracterizado como constituído de DNA repetitivo. Depois se descobriu que as repetições podiam ser longas (satélites), curtas (minissatélites) ou muito curtas (microssatélites). Apesar de serem fáceis de se analisar, o procedimento para podermos conseguir uma série de marcadores de microssatélites para uma espécie onde isso não tenha sido feito é muito trabalhoso. Vamos mostrar as etapas através das ilustrações a seguir:

7 Normalmente aparecem "sombras" tal como na autorradiografia esquematizada acima, já que a polimerase "erra" às vezes, pois "escorrega" em regiões repetitivas. Mas o mais importante dos microssatélites é que, após feitos os procedimentos para obter primers adequados, e se estes estiverem publicados, um laboratório modestamente equipado pode proceder com estudos de variação genética.