UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU ESTUDOS BIOLÓGICOS E MOLECULARES DE BEGOMOVÍRUS INFECTANDO PIMENTÃO (Capsicum annuum) NO ESTADO DE SÃO PAULO. DENISE NAKADA NOZAKI Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). BOTUCATU-SP Janeiro 2007

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU ESTUDOS BIOLÓGICOS E MOLECULARES DE BEGOMOVÍRUS INFECTANDO PIMENTÃO (Capsicum annuum) NO ESTADO DE SÃO PAULO. DENISE NAKADA NOZAKI Orientador: Prof. Dr. Marcelo Agenor Pavan Co -Orientadora: Profa Dra. Renate Krause Sakate Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). BOTUCATU-SP Janeiro 2007

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATA- MENTO DA INFORMAÇÃO SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) N961e Nozaki, Denise Nakada - Estudos biológicos e moleculares de begomovirus infectando pimentão (Capsicum annuuum) no Estado de São Paulo / Denise Nakada Nozaki. Botucatu: [s.n.], xiii, 94f. : il. color., tabs. Tese (Doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2007 Orientador: Marcelo Agenor Pavan Co-orientador: Renate Krause Sakate Inclui bibliografia 1. Pimentão. 2. Vírus Transmissão. 3. Biologia molecular. 4. Begomovirus. 5. Microscopia eletrônica. I. Pavan, Marcelo Agenor. II. Sakate, Renate Krause. III. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Campus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronômicas. IV. Título.

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5 II Ao admirarmos a mais bela construção sabemos que ela não teria sido efetuada senão apartir do primeiro tijolo e com a ajuda de uma equipe de trabalhadores. Portanto o mundo de paz, harmonia e amor com que tanto sonhamos só será construído apartir de pequenos gestos de compreensão, solidariedade, respeito, ternura e perdão de cada um, no dia-a-dia. Ninguém sozinho conseguirá mudar o mundo, no entanto podemos fazer parte de uma pequena parcela que poderá se ampliar. Tentar vale a pena!

6 III Aos meus pais Hiroyuki Nozaki e Auria Nakada Nozaki pela educação, amor, e que sempre me apoiaram e fizeram de tudo em sua vida para tornar esta empreitada possível. Dedico inteiramente este trabalho. OFEREÇO A coisa mais graciosa e fofa surgiu neste período, que é a minha sobrinha Letícia e as minhas irmãs Gisele, Cristiane e Priscila pela existência em minha vida,

7 IV AGRADECIMENTOS compreendidas; A Deus, pelas concessões nem sempre percebidas e/ou apoio e ensinamentos; Ao Prof. Dr. Marcelo Agenor Pavan pela orientação, confiança, À Profa. Dra. Renate Krause-Sakate pela orientação, apoio, paciência, ensinamentos, e principalmente pela sua amizade; de Doutorado; À CAPES, pelo auxílio financeiro, através de concessão de bolsa A FAPESP, pela concessão do Auxílio Projeto; Ao Dr. Valdir Atsushi Yuki, pelos ensinamentos, amizade e auxílio na transmissão de vírus por mosca-branca; Ao Prof. Dr. Francisco Murilo Zerbini Júnior, pela amizade e auxílio em diversas etapas no andamento do projeto; pimentão; À Sakata Seed América, pela concessão das sementes de Aos amigos Fabio Augusto Manetti, Jorge Massaki Hasegawa,

8 V Pedro Henrique Dziuba e Nobuyoshi Narita, pela amizade e colaboração nas coletas; bombardeamento de plantas em Viçosa. Ao colega Alison Talis Martins Lima, que me ajudou com o Aos funcionários deste departamento Paulo Roberto Rodrigues, Domingues Paulossi e Norberto Vaz de Carvalho, pela ajuda no preparo de materiais e na conduta deste trabalho; Ao professor Antônio Carlos Maringoni, pela paciência como coordenador de curso no período do trabalho e pela amizade; Aos professores e funcionários do Departamento de Produção Vegetal da FCA UNESP, pelos ensinamentos e colaboração; A todos os alunos do laboratório de Virologia Vegetal da Universidade Federal de Viçosa que foram todos muitos legais e receptivos quando fui realizar meu trabalho; Aos meus amigos e colegas Ana Carolina, Simone Takahashi, Viviane, Adriana, Nádia, Alniusa, Márcio, Renan, Gerson, Kelly, Júlio, Mônica, D. Margarida e D. Elza pela diversão, companheirismo, ensinamentos e amizade; As funcionárias Marlene, Jaqueline e Marilena da Seção de Pós- Graduação, pela simpatia e paciência com os alunos; A todos os funcionários da Biblioteca desta Faculdade, pela ajuda em busca de literatura, pela paciência, simpatia e amizade.

9 VI oportunidades concedidas; À Faculdade de Ciências Agronômicas UNESP, pela formação e deste trabalho. A todos que direta e indiretamente colaboraram na realização

10 VII SUMÁRIO Página LISTA DE TABELAS......IX LISTA DE FIGURAS...X 1. RESUMO SUMMARY INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Taxonomia e etiologia do gênero Begomovirus Organização do genoma e replicação do gênero Begomovirus Importância epidemiológica dos begomovírus Modalidade de transmissão do vírus Modificação citológica no hospedeiro MATERIAL E MÉTODOS Local do experimento Coleta de material vegetal e preservação Extração de DNA total e detecção viral Sequenciamento e análise do DNA-A Clonagem do DNA-A e DNA-B do isolado de ToSRV[PJU] coletado de pimentão em Pirajú, São Paulo DNA-A DNA-B Caracterização biológica Transmissão por extrato vegetal Transmissão por enxertia... 30

11 VIII Transmissão com seringa Transmissão por mosca-branca Transmissão por biobalística Análise citológica RESULTADOS E DISCUSSÃO Detecção viral e análise da diversidade genética Caracterização do genoma viral Caracterização biológica Transmissão por extrato vegetal Transmissão por enxertia Transmissão com seringa utilizando o DNA amplificado por Templi Phi Transmissão por biobalística Transmissão por mosca branca Caracterização citológica CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE...74

12 IX LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Relação das amostras coletadas, localidade e histórico da área Tabela 2. Seqüências dos oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR e para as reações de sequenciamento dos isolados de begomovírus Tabela 3. Lista de oligonucleotídeos utilizados para sequenciamento do componente A e B do ToSRV[PJU] Tabela 4. Presença de begomovirus em pimentão diagnosticado por PCR Tabela 5. Porcentagem de identidade entre as seqüências de nucleotídeos parciais do gene cp de begomovírus e os 18 isolados coletados de pimentão no estado de São Paulo, obtido através de Clustal W Tabela 6. Comparação da porcentagem de identidade das seqüências de nucleotídeos dos genes do componente A do genoma de diferentes espécies de begomovírus Tabela 7. Porcentagem de identidade de nucleotídeos das ORFs BC1 e BV1 presente no DNA-B de diferentes espécies de begomovírus Tabela 8. Relação de plantas hospedeiras utilizadas para avaliação e sintomas observados do isolado ToSRV[PJU] transmitidos por mosca-branca... 57

13 X LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Organização típica do genoma de begomovírus bipartido, Bean golden mosaic virus, composto de aproximadamente de 2,6 kb... 9 Figura 2. Mapa representativo dos locais de coleta das amostras de pimentão no Estado de São Paulo Figura 3. Localização dos oligonucleotídeos no componente A de begomovírus. As ORFs representadas pelas setas pretas, com suas respectivas denominações. Na figura: V representa o sentido viral e C o sentido complementar Figura 4. Localização dos oligonucleotídeos utilizados para sequenciamento do DNA-B do ToSRV[PJU]. As ORFs são representadas pela setas pretas, com suas respectivas denominações. Na figura V representa o sentido viral e C o sentido. complementar Figura 5. A) Gaiola de garrafa plástica, utilizada no experimento de transmissão de begomovirus. B) Plantas testes em gaiola de vidro com mosca branca para. adquirir o vírus Figura 6. A) Foto de parte do equipamento, câmara formadora de vácuo, onde coloca-se a planta para ser bombardeada.; B) Membrana carreadora, com partículas de. tugstênio envolto com DNA viral; C) Plantas de tomates e pimentão (no fundo) para serem bombardeadas, com o primeiro par de folhas formada Figura 7. PCR com os oligonucleotídeos universais PALIv1978/PAR1c496 para detecção de begomovírus. M= marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen).. Amostras 4, 5, 6, 7, 8, 11 e 13= plantas positivas; 14= planta sadia, 15= controle. positivo e 16= água Figura 8. PCR para detecção de begomovírus com os oligonucleotídeos PrV324 e PrC889. M= marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen). Amostras 1 a 7= isolados; 8 = água e 9 = controle positivo

14 XI Figura 9. Árvore filogenética baseada na sequencia parcial de nucleotídeos do gene que codifica a proteína capsidial obtida pelo programa MEGA v3.1 utilizando-se método de neighbor-joining, com valor de "bootstrap" Figura 10. Clivagem do DNA genômico do ToSRV amplificado com a enzima Templi Phi. M = marcador de comprimento (1kb DNA ladder), 1= BamH I, 2= Xho I, 3=. Kpn I, 4= Pst I, 5= EcoR I, 6= Hpa II, 7= Sph I, 8= Xba I, 9= Hind III Figura 11. Clivagem do possível clone recombinante com enzimas de restrição. M: marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen), 1= DNA plasmidial do. clone 190p clivado com Xba I, 2= DNA plasmidial do clone 190p clivado com. Hind III e 3= DNA plasmidial do clone 190p clivado com Hind III e Xba I Figura 12. Clivagem com Hind III e Xba I dos clones positivos por PCR (amostra 1 a 5), M: marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen) Figura 13. Representação esquemática do clone recombinante correspondente ao DNA-A completo do isolado 190p, clonado no vetor pks+. Os sítios de clivagem das. enzimas BamH I, Xba I e Hind III estão indicados, assim como os comprimentos. dos fragmentos gerados após a clivagem com essas enzimas Figura 14. PCR com oligonucleotídeos desenhados para complementar a seqüência genômica do DNA-A de ToSRV. M= marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen); HML= marcador de peso (High mass ladder, Invitrogen); 1= amplificação com GemiA1081/2422; 2= amplificação com GemiA1664/297; 3= amplificação com GemiA1876/1202 e 4= amplificação com GemiA2146/ Figura 15. Representação esquemática dos fragmentos seqüenciados com oligonucleotídeos especificados, formando o consenso correspondente ao genoma completo do DNA-A do ToSRV[PJU] Figura 16. PCR do componente B de ToSRV. M= marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen); HML= marcador de peso (High mass ladder, Invitrogen); 1= amplificação com oligonucleotídeos universais PPBL1v2040 e PCRc1 e 2= amplificação com os oligonucleotídeos GemiBa2 e GemiBs Figura 17. PCR com oligonucleotídeos desenhados para complementar a seqüência genômica do DNA-A de ToSRV. M= marcador de comprimento (1 kb DNA

15 XII ladder, Invitrogen); 1= amplificação com GemiB369s/1163a; 2= amplificação com GemiB182s/1024a; 3= amplificação com GemiB1559a/Bs1 e 4= amplificação com GemiB1665a/Ba Figura 18. Alinhamento das sequências de nucleotídeos de parte da Região Comum de ToSRV[PJU]-A e ToSRV[PJU]-B e de outros begomovirus. Os elementos conservados (iterons) implicados na replicação, estão indicados sob o alinhamento Figura 19. Representação esquemática dos fragmentos seqüenciados com oligonucleotídeos especificados, formando o consenso correspondente ao genoma completo do DNA-B do ToSRV-B[PJU] Figura 20. Nicandra physaloides inoculada via extrato vegetal apartir de Nicotiana benthamiana apresentando A) mosaico internerval e B) drástica redução do tamanho (observar planta sadia ao lado de infectada) Figura 21. Foto A e B, mostrando a combinação de planta enxertado (enxerto + porta enxerto) com sintomas de distorção foliar, nervuras rendilhadas, tortuosas e enrolamento das folhas Figura 22. PCR com os oligonucleotídeos universais PALIv1978/PAR1c496 para begomovírus para diagnose de enxertos e porta enxertos. M= marcador de comprimento (1 kb DNA ladder, Invitrogen), A= água; E1= enxerto da planta 1; C1= porta-enxerto da planta 1; E2= enxerto da planta 2; C2= porta-enxerto da planta 2; E3= enxerto da planta 3; C3= porta-enxerto da planta Figura 23. A) N. benthamiana inoculada por biobalística com RF apresenta enrugamento foliar e redução no tamanho da planta B) Tomate Rutgers quando inoculado por biobalística com Templi Phi do ToSRV[PJU], apresentou amarelecimento foliar e mosaico Figura 24. Observação de sintomas 30 dias após a transmissão de vírus com moscabranca virulíferas. A) Chenopodium amaranthicolor, pontos cloróticos; B) Physalis floridana, clareamento de nervura e enrugamento foliar e C) Nicandra physaloides, mosaico e enrugamento foliar

16 XIII Figura 25. Eletrofotomicrografia de células associadas ao tecido vascular de pimentão Lilac sadio. Seta indica nucléolo em célula sadia. Aumento X Figura 26. Eletrofotomicrografia de células associadas ao tecido vascular de pimentão Lilac infectado pelo ToSRV[PJU]. A-segregação do nucléolo (N) em célula infectada. B-seta indica a formação de pequeno anel fibrilar e nucléolo e estágio mais avançado de segregação. Aumento X e X, respectivamente Figura 27. Eletrofotomicrografia de células associadas ao tecido vascular de pimentão Lilac infectado pelo ToSRV[PJU]. A) Anel fibrilar formado apartir do nucléolo segregado em célula infectada e B) setas indicam o anel fibrilar maior e e pequenos anéis. Aumento X e X, respectivamente Figura 28. Eletrofotomicrografia de nervura foliar de Pimentão Lilac infectada por ToSRV [PJU]. Observação de grânulos no interior da mitocôndria. Aumento X Figura 29. Setas indicando os grânulos de cristais observados em células de plantas sadia (A) e em células de planta infectada por ToSRV[PJU]. Aumento 7750X e 23000X respectivamente Figura 30. Seqüência completo de ToSRV-A [PJU], indicando os genes e a tradução em proteína. A disposição do formato é semelhante ao encontrado no NCBI. Em vermelho e grifado representa o nanonucleotídeo conservado e em azul grifado o tata Box Figura 31. Alinhamento das seqüências completas de ToSRV-A [PJU], com outras 2 sequencias de ToSRVe uma de ToRMV isolados brasileiros encontradas no GenBank. Em negrito mostra o TATA Box e o nanonucleotídeo Figura 32. Seqüência completa de ToSRV-B [PJU], indicando os genes e a tradução em proteína. A disposição do formato é semelhante ao encontrado no NCBI. Em vermelho e grifado representa o nanonucleotídeo conservado e em azul grifado o tata Box Figura 33. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos do ToSRV-B [PJU], ToRMV (AF291706) e sequencia parcial de ToSRV AY Os elementos relevantes para a replicação do DNA viral estão indicados

17 1 1. RESUMO Os vírus pertencentes ao gênero Begomovirus da família Geminiviridae são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci Gennadius, atualmente constituem um dos problemas fitossanitários mais sérios em diversas culturas. A mosca-branca encontra-se disseminada em todas as principais regiões produtoras de hortaliças do Brasil. No estado de São Paulo, em 2005, plantas de pimentão mostrando sintomas de deformação dos frutos, folhas e mosaico foliar, apresentaram-se infectadas por begomovírus. Até então, no Brasil, a infecção de pimentão por vírus deste gênero havia sido verificada apenas nos estados de Pernambuco e Bahia, no ano de Amostras de plantas de pimentão foram coletadas nos campos de produção localizados nos municípios de Paranapanema, Piraju, Alvinlândia, Ubirajara, Elias Fausto, Mogi Guaçu, Paulínia e Botucatu, no período de novembro de 2004 a maio de 2006, com finalidade de detecção e verificar a variabilidade genética dos begomovírus infectando esta cultura. A detecção de begomovírus foi realizada por meio de PCR com oligonucleotídeos universais e seqüenciamento de parte da região codificadora para a proteína capsidial. Do total de 228 plantas coletadas, foram encontradas 30 amostras positivas de begomovírus, sendo que

18 2 seqüências de 23 isolados apresentaram uma identidade de nucleotídeos de 98 a 100% com o Tomato severe rugose virus (ToSRV) e dois isolados, um proveniente da região de Alvinlândia e outro de Mogi Guaçu, apresentaram maior identidade (98 e 95% respectivamente) com a provável espécie Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). O DNA-A do isolado ToSRV[PJU] coletado de pimentão Lilac da região de Pirajú apresentou identidade de nucleotídeos de 99% com outro isolado de ToSRV (DQ207749) proveniente de pimenta e 97% com um isolado de ToSRV (AY029750) proveniente de tomate. A seqüência do DNA-B do ToSRV[PJU] apresentou identidade de 98% com o DNA-B do ToRMV (AF291706) do Triângulo Mineiro, Minas Gerais e 95% com ToSRV (AY029751). Foi verificada transmissão via extrato vegetal tamponado para Nicandra physaloides e pimentão Magda utilizando-se somente como fonte de inóculo Nicotiana benthamiana. Pela mosca branca, o vírus foi transmitido para as espécies Lycopersicum esculentum Santa Clara ; Capsicum annuum cv Magali R, Magda, Rubia R, Martha, Bruna, Paloma, Impacto, Italiano amarelo, Doce comprido-tipo americana ; Capsicum frutescens; Nicotiana rustica; Nicotiana clevelandii; Physalis floridana; Nicandra physaloides; Petunia hybrida; Chenopodium amaranthicolor; Phaseolus vulgaris cv. Pérola e Vigna unguiculata. O isolado ToSRV[PJU] foi transmitido via biobalística para N. benthamiana, tomate Rutgers e pimentão Casca Dura Ikeda. A análise citológica sob microscópio eletrônico de transmissão possibilitou a visualização de anéis formados a partir do nucléolo, nucléolos com segregação parcial de seu conteúdo e inclusões presentes no interior das mitocôndrias. Palavra-chave: Begomovírus, caracterização molecular, biológica e citológica, Capsicum annuum.

19 3 MOLECULAR AND BIOLOGICAL ANALYSIS OF BEGOMOVIRUS INFECTING PEPPER (Capsicum annuum) IN SÃO PAULO STATE. BOTUCATU, p. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteção de Plantas) Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Author: DENISE NAKADA NOZAKI Adviser: MARCELO AGENOR PAVAN Co-adviser: RENATE KRAUSE SAKATE 2. SUMMARY The viruses belonging to the genus Begomovirus, of the family Geminiviridae, are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci Gennadius, and considered one of the most important fitossanitary problems for several crops. The whitefly is disseminated throughout the country. In São Paulo State, 2005, pepper plants showing fruits deformations, and mosaic on the leaves were infected by begomovirus. Until then in Brazil, the infection of begomovirus in pepper was only reported in 1997, in Pernambuco and Bahia States.

20 4 Pepper plants were collected in Paranapanema, Piraju, Alvinlândia, Ubirajara, Elias Fausto, Mogi Guaçu, Paulínia and Botucatu, in the period of November of 2004 to May of 2006, with the aim to study the genetic variability of the begomovirus infecting this culture. The begomovirus were detected by PCR using universal oligonucleotídeos and the coat protein region was sequenced. On the total of 228 samples, they were found 30 positive samples of begomovírus, and sequences of 23 isolated presented nucleotides identies of 98 to 100% with Tomato severe rugose virus (ToSRV), while two isolates, one of Alvinlândia and another of Mogi Guaçu, showed identity highest nucleotide (98 and 95% respectively) with the tentative species Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). The nucleotide sequence of the DNA-A of ToSRV[PJU] from pepper cv. Lilac of Pirajú has 99% nucleotide identies with other isolate of ToSRV (DQ207749) collected from pepper and 97% with an isolate of ToSRV (AY029750) from tomato. The sequence of the DNA-B revealed identity of 98% with the DNA-B of ToRMV (AF291706) from Triângulo Mineiro, Minas Gerais and 95% with ToSRV (AY029751). Sap-transmission was verified for Nicandra physaloides and pepper Magda' using infected N. benthamiana as source. By whitefly the virus was transmitted to Lycopersicum esculentum Santa Clara ; Capsicum annuum cv Magali R, 'Magda, 'Rubia R, 'Martha, 'Bruna, 'Paloma, 'Impacto, Italiano amarelo, Doce comprido ; Capsicum frutescens; Nicotiana rustica; Nicotiana clevelandii; Physalis floridana; Nicandra physaloides; Petunia; Chenopodium amaranthicolor; Phaseolus vulgaris cv. Pérola' and Vigna unguiculata. The ToSRV[PJU] was transmitted by biobalistic to N. benthamiana, tomato cv. Rutgers ' and pepper Ikeda Casca Dura'. The cytological analysis under electronic microscope of transmission made possible the visualization of fibrillar rings formed of the nucleolus, nucleolus with partial segregation and inclusions inside the mitochondria. Keywords: Begomovirus, molecular, biological and cytological caracterization, Capsicum annuum.

21 5 3. INTRODUÇÃO O pimentão, por ser uma hortaliça muito apreciada no Brasil, possui grande importância comercial. No Estado de São Paulo, em 2004, foram cultivados aproximadamente 2,6 mil hectares, com uma produção de aproximadamente 68 mil toneladas gerando um rendimento médio de 26 t/ha (IEA, 2005). Em 2005, nos seis primeiros meses a exportação brasileira de pimenta e pimentão atingiu 120 toneladas (Agrianual, 2006). A intensificação no uso de estufas tem favorecido o aumento da produção da hortaliça, pois possibilita a extensão do tempo de colheita e cultivo em épocas de clima adverso, como chuvas intermitentes e temperaturas extremas. O cultivo, a comercialização e o processamento deste produto são atividades de grande importância social, pois funcionam como fonte geradora de empregos diretos e indiretos. Durante o desenvolvimento e produção, a cultura de pimentão é afetada por doenças de origens bióticas e abióticas. O sucesso na produção depende, em grande parte, de cuidados dispensados ao controle de doenças, insetos e nematóides. O nível de produtividade e qualidade dos frutos será tanto melhor quanto menor for a incidência desses problemas. Nos últimos anos, os problemas fitossanitários associados a insetos do

22 6 gênero Bemisia (Homoptera:Aleyrodidae) tornaram-se cada vez mais freqüentes em tomateiros e pimentões cultivados em todo o mundo (Naranjo & Ellsworth, 2001). Uma das principais conseqüências do aumento populacional desse inseto, popularmente denominado mosca-branca, tem sido o aumento na incidência de vírus pertencentes à família Geminiviridae, gênero Begomovirus (Polston & Anderson, 1997; Ribeiro et al., 1998; Moriones & Navas-Castillo, 2000; Morales & Anderson, 2001). A mosca branca B. tabaci é considerada uma das principais pragas do século 20. Desde os anos de 1950, B. tabaci causou perdas significativas nas regiões agrícolas tropicais e subtropicais nos cinco continentes do mundo (Morales, 2001). As condições climáticas da maior parte do território do Brasil permitem o cultivo de várias espécies de plantas durante o ano todo, ou apenas uma única espécie vegetal pode ser cultivada em qualquer época do ano, desde que haja suprimento de água. Tais condições favorecem a multiplicação contínua da mosca-branca (Faria et al., 2000). Segundo Morales & Jones (2004), a área favorável à sobrevivência e ao aumento populacional de mosca-branca apresenta uma temperatura ótima que flutua entre 15-33ºC e extenso período de tempo sem chuva abundante, o que inclue o estado de São Paulo dentro desta área. Relatos de begomovírus infectando tomateiro vem sendo divulgados desde a década de 90 (Zerbini et al., 1996; Faria et al., 1997; Ribeiro et al., 1998; Ambrozevicius et al., 2002). Em pimentão, infecção por begomovírus foi observada em amostras coletadas no ano de 1997 nos estados da Bahia e Pernambuco (Lima et al., 2001) e em 2005 no estado de São Paulo (Nozaki et al., 2006). Devido às poucas informações sobre as espécies ocorrendo em pimentão, iniciou-se uma análise da variabilidade genética dos isolados coletados em diferentes regiões produtoras no estado de São Paulo e a caracterização biológica, molecular e citológica de um dos isolados (ToSRV[PJU]) proveniente de Pirajú, São Paulo. Esses estudos servirão como base para um trabalho de melhoramento genético do pimentão visando a obtenção de plantas resistentes a begomovírus.

23 7 4. REVISÃO DE LITERATURA 4.1 Taxonomia e etiologia do gênero Begomovirus Os vírus pertencentes à família Geminiviridae são caracterizados pela morfologia de partículas icosaédricas geminadas e genoma composto por DNA de fita simples circular (Hanley-Bowdoin et al., 1999; Stanley et al., 2005). A família é dividida nos gêneros Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus e Begomovirus, com base no número de componentes do genoma, tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros e relacionamento filogenético (Stanley et al., 2005). No gênero Begomovirus são incluídas as espécies com dois componentes genômicos, transmitidas pela mosca-branca, Bemisia tabaci para plantas dicotiledôneas, sendo o membro tipo o Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV). Desde a constatação deste gênero, mais de 100 espécies distintas foram relatadas (Stanley et al., 2005). Os begomovírus podem ser divididos em dois grandes grupos, os originados do Novo Mundo (Américas- Hemisfério Ocidental) e os do Velho Mundo (Europa, Ásia e África Hemisfério Oriental) (Faria & Zerbini, 2000). Alguns isolados de Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV),

24 8 possuem apenas um componente genômico, mas encontram-se no gênero Begomovirus devido a similaridade na organização do genoma e serem transmitidos por mosca-branca. Pequenos DNAs satélites de fita simples e circulares, conhecidos como DNA-ß com tamanho de aproximadamente 1,3 kb são associados a diversos begomovírus monopartidos do Velho Mundo (Stanley et al., 2005). As espécies que ocorrem no continente americano possuem tipicamente genoma dividido em dois componentes de DNA, com tamanho variando entre 2,5 a 2,8 kb cada. Cada um dos componentes (DNA-A e DNA-B) é responsável por etapas distintas do processo de infecção, sendo o DNA-A envolvido na replicação viral, transcrição e formação da capa protéica, e o DNA-B responsável pelo movimento (célula-a-célula e longa distância) do vírus na planta (Faria & Zerbini, 2000; Rojas et al., 2005; Stanley et al., 2005). Ambo os componentes são essenciais para a infecção sistêmica eficiente do vírus na planta. Os critérios para estabelecimento de uma nova nova espécie no gênero Begomovirus incluem o número de componentes (com presença ou ausência do componente B); a organização do genoma (presença ou ausência da ORF AV2); identidade da seqüência de nucleotídeos completa (quando esta for menor que 89% considera-se uma nova espécie, porém levando-se em conta também as propriedades biológicas do isolado, devido a alta freqüência de recombinação entre begomovírus); formação de pseudorecombinantes viáveis; características da proteína capsidial (identidade menor que 90% nesta região e propriedades sorológicas diferentes podem ser indicativo de uma nova espécie); a gama de hospedeiro natural e sintomas observados (Stanley et al., 2005) Organização do genoma e replicação do gênero Begomovirus O DNA-A e DNA-B de begomovírus não apresentam identidade de seqüências, com exceção da região comum (RC), conhecida também como região intergênica (IR), que apresenta cerca de 200 nucleotídeos com identidade superior a 90% entre os componentes. Dentro da região comum, localiza-se uma seqüência conservada de nove nucleotídeos (5 TAATATTAC 3 ) que está presente em todos os begomovírus, contendo o

25 9 domínio funcional da origem de replicação, além dos promotores de síntese dos mrnas virais. A transcrição do genoma dos begomovírus é bidirecional nos dois componentes (A e B). Os noves nucleotídeos mencionados anteriormente se encontram dentro de um contexto de 29 a 32 seqüências de nucleotídeos capazes de formar uma estrutura em forma de grampo ou stem loop, sendo considerado um elemento conservado estruturalmente e essencial para replicação denominado SCE (structurally-conserved element). Estas seqüências variam entre espécies de begomovírus, no entanto a estrutura está sempre presente (Lazarowitz et al., 1992; Faria & Zerbini, 2000; Stanley et al., 2005). Como representado na Figura 1, no componente A as ORFs ( opean reading frames ) AV1 (CP) e AV2 são transcritas no sentido viral, enquanto as ORFs AC1 (Rep), AC2 (TrAP), AC3 (REn) e AC4 no sentido complementar. A ORF AV2 não encontrase presente nos begomovírus bipartidos do Novo Mundo. No componente B a ORF BV1 (NSP) é transcrita no sentido viral e a ORF BC1 (MP) no sentido complementar (Faria et al., 2000; Rojas et al., 2005; Stanley et al., 2005). Figura 1. Organização típica do genoma de begomovírus bipartido, Bean golden mosaic virus, composto de aproximadamente de 2,6 kb (Figura extraída de Rojas et al., 2005).

26 10 A ORF AV1 codifica a proteína capsidial dos begomovírus que pode estar envolvida no movimento sistêmico do vírus dependendo do hospedeiro (Azzan et al., 1994). A ORF AC1 codifica a proteína Rep (replication-associated protein) que liga-se aos sítios de iniciação de replicação dentro da região comum e introduz um corte na seqüência conservada TAATATTAC. A Rep se liga a iterons com seqüência altamente específica e determina a formação ou não de pseudorecombinantes viáveis, não sendo considerada uma replicase e sim uma enzima associada a replicação, já que a atividade de DNA polimerase é realizada por enzimas do hospedeiro. A ORF AC2 codifica a proteína transativadora da transcrição TrAP (transactivation protein) influenciando a transcrição e subsequente expressão dos genes CP e NSP no sentido viral dos componentes A e B, respectivamente (Hanley-Bowdoin et al., 1999). Além disto a proteína age como supressora do silenciamento gênico (Voinnet et al., 1999). A ORF AC3 codifica a proteína REn (replication enhancer protein) que é requerida para replicação eficiente do DNA viral, possivelmente por interagir com Rep no reconhecimento da origem de replicação (Settlage et al., 1996). O produto da ORF AC4 estimula a proliferação celular (Rojas et al., 2005). O movimento dos begomovírus no interior de uma planta é mediado pelas proteínas codificadas pelos genes presentes no DNA-B. A ORF BV1 codifica a proteína NSP (nuclear shuttle protein) necessária para o tráfico intracelular pelo núcleo e a ORF BC1 codifica a proteína MP (moviment protein) envolvida no movimento célula-célula, via plasmodesmas (Noueiry et al., 1994; Sanderfoot et al., 1996). Ainda não está claro a forma e a natureza do complexo de DNA que trafega pelos plasmodesmas, porém evidência direta por meio de ensaios de microinjeção indica que NSP (BV1) entra no núcleo e media o transporte de DNAs de fita simples e dupla pelo poro nuclear (Noueiry et al., 1994). Após a introdução de partículas virais na célula vegetal pela moscabranca e em seguida ao desencapsulamento da partícula, o processo de replicação dos begomovírus ocorre no núcleo, onde o DNA de fita simples (ssdna) é convertido em DNA de fita dupla (dsdna) intermediário (denominado de forma replicativa, RF). Esta etapa inicial depende totalmente do sistema enzimático do hospedeiro, responsável pela síntese da proteína viral REP e posterior replicação e formação dos RFs e de novas fitas ssdna no sentido viral. O sítio de início da replicação viral está localizado na região comum (razão da conservação da seqüência de nucleotídeos entre os dois componentes do genoma viral). Em seguida ocorre a

27 11 síntese de uma molécula de ssdna linear de sentido viral, contendo várias unidades do genoma (multímero ou concatômero), utilizando como molde a fita complementar do RF. O concatômero é clivado, formando monômeros e estes re-ligados, gerando moléculas circulares de ssdna, correspondendo ao genoma viral. A clivagem é realizada pela proteína Rep e ocorre na seqüência conservada de nove nucleotídeos da região comum, sendo o ponto de corte sempre no mesmo local (TAATATT AC) (revisado por Faria & Zerbini, 2000; Stanley et al..; 2005). A REP não cliva o DNA sem a presença da estrutura SCE, daí ela estar presente em todos os begomovírus (Faria & Zerbini, 2000). A replicação ocorre da mesma forma para o DNA B. Mutações nos genes Rep, TrAP, NSP e MP podem bloquear a infectividade viral (Hanley-Bowdoin, 1999) Importância epidemiológica dos begomovírus O primeiro relato de uma doença comprovadamente causada por begomovírus no Brasil foi feito por Costa (1965) em feijão comum (Phaseolus vulgaris L.). O vírus foi denominado Bean golden mosaic virus (BGMV). Na época, o mosaico dourado do feijoeiro causado pelo BGMV foi considerado uma doença de importância econômica secundária, mas hoje vem causando grandes perdas em pelo menos 12 países da América Latina (Faria et al., 2000; Gilbertson et al., 1991). O aumento populacional de Bemisia tabaci durante a década de 70 foi determinante para a disseminação do BGMV e foi atribuída ao acréscimo em área plantada com soja, uma excelente hospedeira da praga (Costa, 1975). No Estado de São Paulo, a partir de 1992, observou-se a presença de um novo biótipo (biótipo B) da mosca-branca, possivelmente introduzida da Europa ou EUA, pela importação de plantas ornamentais (Melo, 1992). O biótipo B de B. tabaci (também conhecido como B. argentifolii), quando comparado ao biótipo A (o único até verificado no Brasil) apresenta uma gama de hospedeiros mais ampla, incluindo várias solanáceas, e um maior grau de adaptação climática e dispersão (Bedford et al., 1994, Morales & Jones, 2004). Em solanáceas, especificamente o tomateiro, o primeiro relato de infecção por begomovírus foi feito por Matyis et al. (1975). Esta cultura é altamente suscetível

28 12 à colonização pelo biótipo B e nos últimos anos uma alta incidência vem sendo relatada simultaneamente em diferentes Estados brasileiros como São Paulo, Bahia, Pernambuco e Distrito Federal, acarretando em perdas de 40 a 100% na produção de tomate (Ribeiro et al., 1994, 1996, 1998; Zerbini et al., 1996; Bezerra et al., 1997; Faria et al., 1997). A caracterização molecular parcial do genoma dos begomovírus presentes nas regiões Sudeste e Nordeste indicou a presença de sete novas espécies até 2003 (Ribeiro et al., 2003). Ambrozevicius et al. (2002) observaram três espécies distintas em tomateiro nos Estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e Espírito Santo. A hipótese mais aceita para essa rápida emergência de begomovírus em tomateiro é baseada na presença de vírus nativos infectando plantas silvestres e daninhas, tendo a mosca-branca permitido que esses vírus infectassem a cultura. Por meio de ensaios de recombinação e pseudo-recombinação, esses vírus teriam evoluído rapidamente e gerado novas espécies mais adaptadas ao novo hospedeiro (Hou et al., 1992; Ribeiro et al., 2003; Fernandes et al., 2006). Infecção por begomovírus em pimentão foi observada primeiramente nos Estados Unidos por Stenger et al. (1990). Tratava-se do Texas pepper virus (TPV ou TPGV) hoje considerado uma estirpe do Pepper golden mosaic virus (PepGMV) (Fauquet & Stanley, 2005). Da mesma forma, o Serrano golden mosaic virus (Brown & Poulos, 1990), considerado atualmente como uma estirpe do PepGMV, foi identificado na Costa Rica em pimentas Tabasco e Habanero, por Lotrakul et al. (2000) e está amplamente distribuído no sul dos Estados Unidos e México (Brown & Poulos, 1990). Em 1989, foi relatada infecção de pimentão, no norte do México, pelo Pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV) e pelo Sinaloa tomato leaf curl virus, considerado como uma espécie tentativa (Garzon-Tiznado et al., 1993; Idris et al., 1993; Stanley et al., 2005). O PHYVV, em 1996, foi detectado em todo território mexicano (Torres-Pacheco et al., 1996). O Pepper leaf curl virus (PepLCV) foi encontrado e caracterizado na Indonésia (Tsai et al., 2006). O Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), agente etiológico de uma das mais drásticas doenças de tomate no mundo, que devasta anualmente grandes áreas de produção de tomate na Europa e Oriente Médio (Morales, 2001), também foi verificado constatado em pimentão, na República Dominicana (Salati et al., 2002). No Brasil, ainda não foi verificada ocorrência desta espécie de begomovírus. Em nosso país, o primeiro relato de begomovírus na cultura de

29 13 pimentão foi feito por Lima et al. (2001), que verificou 43,8% de infecção do total de amostras da cultivar S-59 e o híbrido Tango coletadas nos municípios de Curaçá (Bahia) e Petrolina (Pernambuco), no Submédio do Vale São Francisco, causando em média 20% de perda na produção (Lima et al., 2001). Bezerra et al. (2006) observaram em Petrolina de Goiás (Estado de Goiás) sintomas de mosaico amarelo e distorção de folha em pimenta dedo-de-moça, tendo sido verificada a espécie ToSRV (AY029750). No Estado de São Paulo foi verificada a mesma espécie ocorrendo em pimentão, no ano de 2005 (Nozaki et al., 2006). Os begomovírus são freqüentemente encontrados em infecções mistas. Paplomatas et al. (1992), ao amplificar um fragmento do componente A do Chino del tomato virus (CdTV) a partir de plantas de tomate e pimentão coletadas no México, observaram a presença de um segundo vírus com seqüência de nucleotídeos completamente divergente do CdTV. Outro relato de infecção mista em pimentão foi feito por Garzón-Tiznado et al. (1993), ao estudar a ocorrência da espécie tentativa Pepper mild tigre virus (PMTV) em pimentão em Tamaulipas, norte do México, sendo o sintoma relatado para a doença denominado rizado amarillo (encarquilhamento amarelo). A análise filogenética baseada em seqüências parciais dos componentes A e B e análise por hibridização, revelou a presença de possivelmente dois begomovírus diferentes, o PHYVV e um outro não caracterizado. Plantas inoculadas apenas com o PHYVV apresentaram somente amarelecimento internerval. A infecção simultânea de uma planta por duas ou mais espécies de begomovírus permite a troca de componentes genômicos (pseudo-recombinação) ou de porções de um mesmo componente (recombinação). Esses eventos são comuns entre begomovírus e resultam na grande diversidade genética observada entre as espécies do gênero e entre estirpes da mesma espécie (Gilbertson et al., 1993; Faria & Zerbini, 2000). O primeiro relato de pseudo-recombinação entre duas espécies distintas foi realizado por Gilbertson et al. (1993), que verificaram que o Tomato mottle virus (ToMoV) apresentava seqüências muito próxima a Bean dwarf mosaic virus (BDMV) e a Abutilon mosaic virus (AbMV). Um pseudorecombinate pode gerar begomovírus com capacidades de se adaptar a novos hospedeiro (Gilbertson et al., 1993). No Brasil foram relatados vários casos de begomovírus recombinantes. Foi identificado que o DNA-A do Tomato chlorotic mottle virus (ToCMV- [MG-Bt1] possui um genoma híbrido, com o módulo de replicação (AC1 e origem de

30 14 replicação) provavelmente doado pelo ToCMoV-[BA-Se1] e as demais seqüências do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), originando um isolado com propriedades biológicas distintas de seu antecessor (Galvão et al., 2003) A possibilidade de obter a pseudo-recombinação entre as espécies virais distintas é uma das formas de estudar o relacionamento evolutivo dos begomovirus. Devido ao Tomato yellow spot virus (ToYSV) induzir sintomas mais severos e precoces que o Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) em tomate e em N. benthamiana, Andrade et al. (2006) construíram dois clones recombinantes, ToYSV com genes mp e nsp de ToRMV, e o ToRMV com genes mp e nsp de ToYSV, no entanto o primeiro clone apresentou sintomas mais atenuado que o segundo, sugerindo que os genes mp e nsp estão envolvidos na adaptação do ToYSV a tomateiro e N. benthamiana Modalidade de transmissão do vírus A mosca-branca B. tabaci. Genn. (Homoptera: Aleyrodidae) é considerada uma praga de maior importância do século 20, sendo cosmopolita, polífaga e vetora de fitovírus. Até 2001, mais de 100 espécies diferentes de begomovírus foram transmitidos pela mosca-branca para plantas ornamentais, feijão comum, tomate, pimenta, pimentão, cucurbitáceas, mamão e outras culturas hortícolas (Morales, 2001; Morales & Jones, 2004). Atualmente, o complexo B. tabaci é constituído de aproximadamente 41 biótipos, sendo que apenas dois biótipos (biótipo A e B) deste complexo são encontrados no Brasil (Gaimari, 2005; Rabello et al., 2005). O biótipo Q é encontrado na região do Mediterrâneo (Espanha, Portugal e Itália), Israel, China e Japão e, em 2004, foi observado no Arizona (EUA). O biótipo Q é morfologicamente semelhante ao B sendo a diferença no período de desenvolvimento, preferência de hospedeiro, eficiência na transmissão de vírus e são altamente resistentes a produtos que controlam o biótipo B (Gaimari, 2005; Rabello et al., 2005). A mosca-branca pode produzir 15 gerações por ano, sendo que cada

31 15 fêmea, com período de vida de 3 a 6 semanas, que passam por 3 a 4 instares e pupa até emergir o adulto pode depositar 200 ovos em média. As moscas-brancas, além de atuarem como vetoras de vírus, podem causar danos diretos na planta como a redução dos nutrientes ao sugarem a seiva, alterações fisiológicas (amarelecimento da estruturas vegetais ou manchas cloróticas) e liberam excreções açucaradas que favorecem o crescimento de fumagina que interfere na de fotossíntese. São insetos polífagos com pelo menos 500 espécies de plantas hospedeiras em 74 famílias (Morales, 2001). A modalidade de transmissão de begomovírus por moscas brancas é do tipo circulativa não propagativa (Faria et al., 2000), porém também é dependente da espécie de begomovírus. Santos et al. (2003) estudaram o relacionamento de ToRMV com o biótipo B de mosca-branca em tomate Santa Clara e verificaram utilizando 5 insetos por planta, que com o período de aquisição de 15 minutos, a porcentagem de transmissão foi de 6%, sendo que com 24 horas de aquisição a eficiência de transmissão aumentou para 65%. O período de inoculação mínimo foi de 30 minutos, acarretando em 18% de transmissão e quando este era de 24 horas elevou-se para 67%. O término do período de latência foi observado a 16 horas após o vetor adquirir o vírus. Evidenciou-se a transmissão à progênie pela detecção do vírus em ovos, ninfas e adultos provenientes de fêmeas virulíferas, contudo, a transmissão do vírus pelos adultos não foi observada. Porém, em uma espécie de begomovírus, o TYLCV-Israel foi comprovada transmissão transovariana e entre indivíduos de sexos diferentes, ou seja, machos virulíferos para fêmeas sadias e de fêmeas virulíferas para machos sadios, e os insetos provenientes destes cruzamentos capazes de inocular o vírus em plantas de tomate, evidenciando o modo de transmissão circulativo-propagativo (Ghanim & Czonek, 2000). A temperatura é um dos fatores do meio ambiente que mais afeta a dinâmica populacional de B. tabaci. Nos trópicos a temperatura ótima flutua em torno de 28ºC, com a temperatura mínima e máxima respectivamente de 15-33ºC. Outros fatores que afetam são umidade relativa, chuvas fortes e freqüentes, correntes de ar com frentes frias e altitudes elevadas (1000 m acima do nível do mar) (Morales & Jones, 2004). Alguns begomovírus podem ser transmitidos por extrato vegetal infectado. Stenger et al. (1990) verificaram que o Texas pepper virus (TPGV), atualmente uma estirpe do PepGMV, ocorre dependendo da espécie hospedeira utilizada como fonte de inoculo e da espécie a ser inoculada. Quando o extrato vegetal provinha de pimentão ou N.

32 16 benthamiana, a transmissão para cultivares de pimentão era menor que 20%, sendo que a transmissão ocorria em % de N. benthamiana para N. benthamiana. Resultados similares foram observados por Fernandes et al. (2006), que verificaram o sucesso na transmissão via extrato vegetal do ToRMV só era possível quando ocorreu de tomate para N. benthamiana e deste para tomate, e nunca de tomate para tomate. A enxertia seria outro método de transmissão de fitovírus. Fernandes et al. (2006), utilizando tomates infectados com o ToRMV, obtiveram sucesso na transmissão por enxertia para Solanum tuberosum, Datura stramonium e para outros cultivares de tomate (Angela Hipper, Rutgers e Santa Clara) e para várias espécies de fumo (Nicotiana rustica, Nicotiana tabacum cultivares Havana 425, Sansum, TNN, Turkish, White Burley e Xanthi). A agroinoculação, que consiste na transferência do genoma viral ao interior da planta através da bactéria Agrobacterium tumefaciens, é altamente eficiente, uma vez obtido o clone infectivo, permite a inoculação de milhares de plantas em poucas horas. Elmer et al. (1987) inoculando o Tomato golden mosaic virus (TGMV), relataram que o método é o mais eficiente, comparado com outros métodos, obtendo-se até 100% de infecção. Por fim, a transmissão via biobalística ou bombardeamento de partículas virais é outro método altamente eficaz de transmissão, porém apresenta alto custo e depende de equipamentos específicos Modificação citológica no hospedeiro Os vírus infectam sistematicamente no hospedeiro, invadindo células distantes do local de inoculação. Os tipos específicos de células e tecidos que serão infectados definem uma propriedade do vírus chamada de tropismo de tecido. No caso de begomovírus, o BGMV exibe tropismo limitado ao floema enquanto que TGMV invade as células do mesófilo, quando analisados em Nicotiana benthamiana (Morra & Petty, 2000). Kim et al. (1978) observaram mudanças na estrutura do núcleo de células de P. vulgaris, quando infectadas com BGMV, sendo tais modificações diferentes das causadas por outros vírus de plantas. As mudanças observadas somente no núcleo de células

33 17 infectadas do floema, em ordem de ocorrência, eram: 1) hipertrofia do nucléolo podendo ocupar até 1/4 do volume nuclear; 2) segregação dos componentes do nucléolo em discretas porções fibrilares e granulares sendo tal processo similar ao induzido em células animais por alguns antibióticos ou produtos carcinogênicos; 3) aparecimento de anéis fibrilares condensados em vários números e tamanhos; 4) observação de partículas virais solitárias, agregadas e compactadas ou arranjadas em forma de cristais hexagonais, sendo estes mais numerosos aos 9 a 12 dias após a inoculação. Bass et al. (2000) observaram grandes inclusões no núcleo de células infectadas com TGMV e o aumento do tamanho do núcleo em até seis vezes após a infecção. Além disto, a maioria das células infectadas possuíam modificações na estrutura da cromatina.

34 18 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Local do experimento Os experimentos foram realizados no Departamento de Produção Vegetal, da Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu. Os ensaios de transmissão por mosca branca, foram realizados no Instituto Agronômico de Campinas Laboratório de Virologia e ensaios de biobalística foram realizados no Departamento de Fitopatologia/BIOAGRO da Universidade Federal de Viçosa Coleta de material vegetal e preservação Plantas de pimentão, apresentando sintomas de amarelecimento e distorção foliar, foram coletadas para verificar a presença de begomovírus, no período compreendido entre novembro de 2004 a maio de 2006, em 16 propriedades produtoras nas

35 19 oito regiões. Em campo de produção de pimentão em cultivo aberto foram coletadas 119 amostras de plantas de pimentão Magali R, Ikeda Casca Dura, P36R e Nathalie distribuídos nos municípios de Elias Fausto, Botucatu (distrito de Vitoriana), Paulínia e Mogi- Guaçu/Itaqui. Sob estufa foram coletadas 43 amostras de híbridos de pimentão P36, Lilac e Mandarin nos municípios de Paranapanema e Piraju, e 66 amostras de pimenta Dínamo e híbridos de pimentão Atlantic e Máximo na região de Marília, municípios de Alvilândia e Ubirajara (Figura 2). As localidades de coleta das amostras (Figura 2) e histórico relatando a presença ou ausência de mosca-branca está representada na Tabela 1. Figura 2. Mapa representativo dos locais de coleta das amostras de pimentão no Estado de São Paulo.

36 20 Tabela 1. Relação das amostras coletadas, localidade e histórico da área. Amostras Cultivar Localidade Sistema de População de Data de cultivo a Mosca-branca coleta 112 a 140 Magali R Elias Fausto Cca Ausente 10/11/ a 164 Ni Paulínia Cca Ausente 10/11/04 106, 107, 165 a Ikeda Casca Vitoriana/ Cca e Ce baixa 03/01/ Dura Botucatu 169 a 181 P36R Paranapanema Ce Alta 04/02/ a 200 Lilac Piraju Ce Alta 04/02/ a 211 Mandarin Piraju Ce Alta 04/02/ a 237; 253 a 273 Atlantic Alvinlândia Ce Baixa 02/06/ a 282 Pimenta Dínamo Alvinlândia Ce Baixa 02/06/ a 251 Máximo Ubirajara Ce baixa 02/06/ a 296 Pimenta Dínamo Ubirajara Ce Baixa 02/06/ a310 P36R Itaqui/ Cca Baixa 01/11/05 Mogi-Guaçu 311 a 314 Nathalie Itaqui/ Cca Baixa 23/02/06 Mogi-Guaçu 315 a 324 Magali R Elias Fausto Cca Alta 23/02/ a 345 P36R Itaqui/ Cca Alta 16/05/06 Mogi-Guaçu 347 a 358 Nathalie Itaqui/ Cca Alta 16/05/06 Mogi-Guaçu 359 a 371 Magali R Elias Fausto Cca Alta 16/05/06 a Cca= cultivo em campo aberto; Ce= cultivo em estufa e Ni= não identificada Todas as amostras coletadas com raiz foram transplantadas e mantidas em casa de vegetação, as estacas foram colocadas em areia umidecida, para fins de enraizamento e as folhas foram acondicionadas em sacos plásticos e armazenadas a 80ºC.

37 Extração de DNA total e detecção viral A detecção viral foi feita por PCR, após extração de DNA genômico total de todas as amostras, utilizando-se o método de Dellaporta et al. (1983). Pedaços de folhas das amostras coletadas (0,2g) foram colocados em tubos de microcentrífuga com capacidade de 1500 µl e macerados com 500 µl de tampão de extração (100 mm Tris-HCl ph8,0, 50 mm EDTA ph8,0, 500 mm NaCl, 10 mm β- mercaptoetanol). Adicionou-se 33 µl de SDS 20% e as amostras foram incubadas em banhomaria à 65ºC por 10 min, sob agitação. Adicionou-se 160 µl de acetato de potássio 5M às amostras e agitou-se por 2 minutos. As amostras foram centrifugadas a g durante 10 minutos. Após a centrifugação, foi retirado 550 µl do sobrenadante, a qual foi adicionado 0,5 volumes de isopropanol, para precipitação do DNA. Centrifugou-se novamente a g por 10 minutos. Logo após, retirou-se cuidadosamente o sobrenadante sem remover o pellet e lavou-se com 500 µl de etanol 70%, centrifugando-se por 5 minutos. As amostras foram secas a vácuo por 5 minutos. Após a secagem, o pellet foi ressuspendido em 150 µl de água ultrapura (Mili-Q). A qualidade e concentração do DNA foram verificadas colocando-se alíquotas de 4 µl de cada amostra de DNA, misturadas com 4 µl de tampão carregamento (0,25% de azul de bromofenol e 40% de sacarose) em gel de agarose a 1% em tampão TBE (0,1M Tris-HCl, 0,1M ácido bórico e 0,02 mm EDTA ph 8,3). O gel foi submetido a eletroforese por 5 V/cm, as bandas foram coradas com brometo de etídio (10 mg/ml) (Sambrook et al., 1989) e observadas através de transluminador UV. Todas as amostras de DNA extraídas foram mantidas a 20ºC. A reação de PCR foi realizada com os oligonucleotídeos universais PALIv1978/PAR1c496 (Tabela 2), que amplificam um fragmento com aproximadamente 1100 bp do DNA-A de begomovírus correspondente a parte da ORF AC1 (Rep), a região comum e parte da ORF AV1 (CP) (Rojas et al., 1993). Para a amplificação, realizou-se uma reação de 25 µl contendo 2,5 µl de tampão de reação 10X (Invitrogen), 3,5 mm de MgCl 2, 1mM de dntps, 1mM de cada oligonucleotídeo, 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 0,17% de triton X-100 e 5 µl de DNA viral. O termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) foi programado