PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS. Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde. Departamento de Medicina Veterinária

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1 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Departamento de Medicina Veterinária Curso de Medicina Veterinária em Betim Patrícia Karen da Silva Cunha Sara Paulino de Oliveira Principais patógenos isolados nas glândulas mamárias das vacas da Fazenda Experimental da PUC Minas e sua correlação com a produção diária de leite e contagem de células somáticas Betim 2013

2 Patrícia Karen da Silva Cunha Sara Paulino de Oliveira Principais patógenos isolados nas glândulas mamárias das vacas da Fazenda Experimental da PUC Minas e sua correlação com a produção diária de leite e contagem de células somáticas Monografia apresentada ao Curso de Medicina Veterinária em Betim da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária. Orientador: Hudson Nunes da Costa Betim 2013

3 Betim, 18 de julho de LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Mudança na composição do leite associada com elevada contagem de células somáticas 09 TABELA 2 - Frequência de microrganismos causadores de mastite encontrados no cultivo do rebanho e média da CCS e total de amostras analisadas, dentro de cada grupo analisado. 18 TABELA 3 - TABELA 4 - Distinção de vacas saudáveis e não saudáveis de acordo com o valor da CCS e cultura negativa. Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e estimativa de perda de produção diária (kg) sobre a CCS transformada (log 10 ) baseados nos testes semanais de pesagem de leite e CCS das vacas negativas na microbiologia (CCS>=100 mil), vacas positivas (CCS <100 mil), vacas positivas (CCS >= 100 mil) em relação às vacas negativas na microbiologia (CCS <100 mil; n=21), média e mediana da CCS (x 10 3 ) TABELA 5 - Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e estimativa de perda de produção diária (kg) sobre a CCS transformada (log 10 ) baseados nos testes semanais de pesagem de leite e CCS das vacas negativas na microbiologia (CCS>=100 mil), vacas positivas (CCS <100 mil), vacas positivas (CCS >= 100 mil) em relação às vacas negativas na microbiologia (CCS <100 mil; n=21), média e mediana da CCS (x 10 3 ) 22

4 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 01 2 REVISÃO DA LITERATURA MASTITE Sistema Imune da Glândula Mámaria Contagem de Células somática Bactérias 11 3 OBJETIVO 16 4 MATERIAL E MÉTODOS Caracterização da fazenda Coleta de amostras Delineamento e análise estatística 18 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 18

5 6. CONCLUSÃO REFERÊNCIAS 24

6 RESUMO Com o objetivo de identificar os principais patógenos causadores de mastite em sistema Freestall de criação de vacas leiteiras e sua relação com a produção de leite, foi realizado uma pesquisa em uma fazenda no município de Esmeraldas, Minas Gerais. As amostras de leite foram obtidas durante a ordenha, semanalmente e durante três meses. Durante a pesquisa, foi coletado leite para realização de contagem de células somáticas (CCS), para relacionar bactérias isoladas em laboratório com os níveis de CCS encontrados no rebanho. Pode-se observar que em 21,1% das amostras, não houve crescimento bacteriano (NHC); 79,2% foram de amostras de leite que apresentaram crescimento bacteriano, sendo isolados os seguintes patógenos: 4,6% para coliformes, 42% de Staphylococcus spp., e 32,3 % de Streptococcus spp. Na analise da CCS os coliformes tiveram a CCS mais alta quando comparada com os outros patógenos. A maior perda diária de leite observada foi por Streptococcus spp, de -4,4kg/dia de leite. Palavras-chave: patógenos, mastite, contagem de células somáticas (CCS), microbiologia. ABSTRACT In order to identify the major mastitis pathogens in freestall system of dairy cows and its relationship with milk production, a survey was conducted on a farm located in Esmeraldas, Minas Gerais. The milk samples were obtained during milking, once a week during a three months period. During the research, milk was collected to somatic cell count (SCC) analysis, to relate laboratory isolated bacteria with SCC levels found in the herd. In 21.1% of the samples, no bacterial growth (NHC); 79.2% of the milk samples that showed bacterial growth were isolated with the following pathogens: Coliforms: 4.6%; Staphylococcus spp. 42%, and 32.3% of Streptococcus spp. CCS Analysis of coliforms had higher level when compared to other pathogens. The greatest daily milk loss was caused by Streptococcus spp, -4.4 kg /day milk. Keywords: pathogens, mastitis, somatic cell count (SCC), microbiology.

7 1 1. INTRODUÇÃO É cada vez mais importante a obtenção de leite de boa qualidade, sendo uma exigência do mercado consumidor, uma necessidade da indústriade laticínios e uma garantia de permanência no mercado para os produtores leiteiros (MULLER,2002). Economicamente, a mastite é a mais importante enfermidade do gado leiteiro, apresentando alta prevalência em todo o mundo, acometendo não só os bovinos, como também os caprinos e bubalinos e podendo se manifestar clinicamente com evolução super-aguda, aguda e crônica (COSTA et al,2008; MULLER, 2002). Agravando o problema, a enfermidade se apresenta também sob a forma subclínica. Esta é a mais prejudicial pela falta de sinais ou sintomas, determinando, porém, perdas econômicas maiores devido à freqüência e persistência do processo (MACKLE et al, 1999). A alta contagem de células somáticas do leite indica processo infeccioso da glândula mamária, o que traz perdas consideráveis para os produtores de leite e para a indústria. (RINALDI, 2010). Como esta é uma medida indireta do processo infeccioso, o uso da microbiologia na triagem de microrganismos é de extrema relevância para melhor avaliação da ocorrência de patógenos no rebanho, bem como para a criação de estratégias de controle para redução da carga bacteriana (SOUZA, 2009). O objetivo do presente trabalho foi a identificação dos patógenos que causam mastite subclínica e a dinâmica de infecção dos patógenos associado à contagem de células somática e perdas de produção. 2. MASTITE A mastite caracteriza-se por processo inflamatório da glândula mamária. É uma das mais complexas e dispendiosas doenças da indústria leiteira, devido à sua alta prevalência e aos prejuízos que acarreta (RINALDI et al, 2010; KANDASAMY et al, 2011). Além disso, seu efeito é notado, principalmente, pela redução na produção e as alterações na composição físico químicas do leite onde as alterações mais comuns observadas são

8 2 alteração de coloração, aparecimento de coágulos e presença de grande número de leucócitos (MULLER,2002). A principal ocorrência da mastite está relacionada, principalmente, com a infecção por microrganismos invasivos, como bactérias e, possivelmente, fungos, leveduras e vírus.(radostits et al., 2002). Dentre as bactérias, um número limitado dos gêneros Staphylococcus, Streptococcus e do grupo dos coliformes causam a maior parte das infecções. (SCHVARZ et al, 2012). As infecções da glândula mamária podem apresentar-se sob duas formas: a clínica e a subclínica, sendo a mastite subclínica a forma mais importante, pois ocorre com maior frequência, não apresenta sintomas aparentes e normalmente antecede a clínica.( VIANA, 2000; AULDIST E HUBBLE 1998 apud PINTO et al. 2009). Os microrganismos que comumente causam mastite podem ser divididos em dois grupos, baseando-se na sua origem: patógenos contagiosos e patógenos ambientais. Os patógenos contagiosos são aqueles adaptados à sobrevivência no interior da glândula mamária. Em contraste, os patógenos ambientais são melhores descritos como invasores oportunistas do úbere, não adaptados a sobreviver no seu interior (WATTS, 1988). Os principais patógenos contagiosos são Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiaee Corynebacterium bovis. Dentre os patógenos ambientais destacam-se a Escherichia coli, Streptococcus uberis e outros estreptococos, coliformes e enterobactérias,. (MENDONÇA et al.,1999; COSTA, 1998). No grupo dos coliformes ambientais encontram-se as bactérias gram-negativas como a Escherichia coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp, Enterobacter spp., Enterococcus faecalise, Enterococcus faecium. (RADOSTITS et al., 2002). As mastites contagiosas são caracterizadas como infecções de longa duração, onde sua transmissão se dá de vaca para vaca no momento da ordenha. Os patógenos contagiosos que se destacam são Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus. As infecções de curta duração ocorrem nas mastites subclínicas por patógenos ambientais, os principais são Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, coliformes; e a transmissão acontece entre as ordenhas.(chaneton et al 2008; ANDREWS, 2008)

9 3 Fontes de patógenos ambientais incluem esterco, cama, alimentos, poeira, sujeira, lama e água (HOGAN, 1989). O esfíncter do teto leva cerca de 30 minutos para fechar após a ordenha (WOLFE, 1997); portanto, ocorre constante exposição das pontas dos tetos aos microrganismos ambientais, sendo fonte significativa para a entrada dos patógenos ambientais. O diagnóstico da mastite clínica pode ser feito por meio da sintomatologia, como inflamação do úbere, edema, hipertermia, endurecimento da glândula mamária, dor na região da glândula mamária, secreção láctea com grumos, sangue e pus entre outras secreções patológicas (SCHVARZ,2012; PELEJA,L. et al, 2006). A forma subclínica se caracteriza por alterações na composição do leite, porém não evidentes. Entre as principais alterações destaca-se o aumento da contagem de células somáticas, o aumento dos teores de Cl-, Na+, proteínas séricas e diminuição do percentual de caseína, gordura, sólido total e lactose do leite (PELEJA,L. et al, 2006). Entretanto, para diagnosticar a mastite subclínica é necessária a utilização de exames complementares baseados no conteúdo celular do leite. Além disso, existe a necessidade da cultura e isolamento dos agentes etiológicos envolvidos para a implantação de métodos de tratamento e estratégias de controle e profilaxia adequados (DIAS, 2007). O desenvolvimento da mastite pode ser caracterizado em três estágios: invasão, infecção e inflamação. A invasão é o estágio em que os patógenos passam do meio externo para as secreções ou leite presente no canal lactífero (RADOSTITS et al., 2002). A infecção é o estágio onde o microrganismo se fixa no tecido mamário e inicia sua reprodução e proliferação por todo parênquima mamário ( PRESTES,2002). A multiplicação de certos microrganismos, como os coliformes, pode resultar na liberação de endotoxinas, que desencadeiam graves efeitos sistêmicos, como febre, anorexia e perda de peso, com poucas alterações inflamatórias. O estágio de inflamação é onde se observam as alterações anormais na glândula mamária e vários efeitos sistêmicos no animal (RADOSTITS et al,2002).

10 4 2.1 SISTEMA IMUNE DA GLÂNDULA MAMÁRIA A glândula mamária saudável é protegida por uma variedade de mecanismos de defesa naturais. Os mecanismos de defesa do sistema imune (SI) incluem barreiras físicas como o esfíncter do teto, barreiras químicas, como a queratina do canal do teto e a lactoferrina e componentes celulares do SI como Macrófagos, Células Dendríticas, Mastócitos, Neutrófilos, Eosinófilos e Célula Natural Killer (NK) (SCHUKKEN, 2011). A principal porta de entrada da bactéria é pelo esfíncter do teto. Se essa estrutura for mantida íntegra, dificilmente ocorrerá crescimento bacteriano (SCHVARZ, 2012). Normalmente o canal do teto é fechado pelos músculos do esfíncter do teto prevenindo a entrada de patógenos. Esta invasão progride do canal do teto para a cisterna da glândula e depois para as extremidades dorsais da glândula mamária (RINALDI et al, 2010). Um mecanismo adicional de defesa do teto é o seu revestimento por uma camada de queratina (composta por células epiteliais descamadas, ácidos graxos e proteínas catiônicas) (PRESTES et al,2002). Associada à queratina há o ácido graxo que obstrui a migração da bactéria e contém agente antimicrobiano como carboidratos de cadeia longa que ajudam a combater a infecção (VIGUIER et al, 2009; PRESTES et al,2002). No entanto, a eficiência da queratina é restrita por fatores que afetam a integridade dessa camada, tornando o teto susceptível às infecções intramamárias (IIM). A dilatação do canal do teto e a saída do leite são fatores que diminuem a eficiência da queratina, pois a mesma é removida quando ocorre a distensão do canal do teto (VIGUIER et al, 2009; PRESTES et al,2002 ). Perceber a presença do patógeno é o primeiro passo na defesa imunológica. Receptores trans-membrana percebem a presença do patógeno devido a seus componentes moleculares pelo processo de quimiotaxia (SCHUKKEN, 2011). As regiões da cisterna do teto e cisterna da glândula são mais responsivas às infecções após 12 horas de infecção, enquanto a região dos lóbulos alveolares é a região com maior resposta imune após 24 horas de infecção bacteriana (RINALDI et al, 2010). Isto sugere que há uma sequência na resposta da inflamação que difere de acordo com a região do úbere e que isso ocorre devido a interação da bactéria com a células de defesa do hospedeiro. Em uma pesquisa realizada por SCHWARZ et al (2011), as porcentagens de leucócitos secretados pelos quartos mamários saudáveis consistiram de: 58,2% de linfócitos;

11 5 23,06% de macrófagos e 18,74% de polimorfonucleares (PMN). Analise estatística indicou significante correlação negativa entre as porcentagens de linfócitos e CCS. Linfócitos e PMN seguiram em direções contrárias quando a CCS elevava. Neutrófilos aumentaram de 30% com CCS menor do que cel/ml para 63.65% com CCS de cel/ml. PMN foram as células predominantes (85,27% cel/ml) da população de leucócitos das glândulas mamárias com mastite. Os neutrófilos são as células de defesa predominante (> 90%) durante a mastite. Eles possuem a capacidade de matar a bactéria através da produção de radicais de oxigênios, proteínas bactericidas e lise através da fagocitose (RINALDI et al, 2010). A principal função do PMN é a defesa contra a bactéria invasora no começo do processo inflamatório agudo. Não somente o número de PMN eleva substancialmente como também suas respostas de defesa também aumentam e há significante correlação positiva entre porcentagem de PMN e contagem de células somáticas (CCS) (PAAPER et al, 2003). A elevada proporção de PMN pode ser evidência da fase inicial da inflamação. É possível que PMN sejam capazes de defender patógenos com sucesso e prevenir a mastite (SCHWARZ et al, 2011). O reconhecimento e a resposta imune do animal contra o patógeno são fatores cruciais para estabelecimento, persistência e gravidade da infecção. Existem diferenças importantes na resposta às IIM, dependendo da espécie bacteriana. De acordo com ELAZAR (2010), a resposta do sistema imune inato é significantemente diferente entre bactérias gram-negativas e gram-positivas (neste caso foram analisadas gram-negativa:e. coli; gram-positiva : Streptococcus uberis). Em resposta a uma infecção intramamária por E. coli, os macrófagos não foram capazes de estabelecer uma resposta imune ao lipopolissacarídeo (LPS) da bactéria gramnegativa. O estudo sugere que os neutrófilos promovem uma defesa essencial contra E. coli, onde os macrófagos alveolares tem o papel de sinalizar a invasão para os neutrófilos (ELAZAR, 2009). Os receptores do tipo Toll (TLR: Toll Like Receptors) são os responsáveis pelo reconhecimento de várias vias de padrões de reconhecimento de patógenos, os PAMPs - pathogen-associated molecular patterns. O TLR4 é o receptor que reconhece o PAMP da E. coli através de sua camada de lipopolissacarídeo (LPS). (ABBAS, 2003).

12 6 Entre os moduladores imunes secretados pela glândula mamária, as citocinas merecem atenção especial (RIOLLET et al., 2000), pois a glândula mamária bovina responde aos agentes patogênicos estimulando a produção de citocinas e outros mediadores pró inflamatórios (CORL et al, 2008) As principais citocinas do tipo Interleucina (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12) e o Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) são considerados como marcadores das defesas da glândula mamária (CARNEIRO et al, 2009). As citocinas pró- inflamatórias IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-12, e TNFa são produzidas principalmente pelas células epiteliais e pelos neutrófilos. Elas desencadeiam o processo inflamatório por alteração da permeabilidade vascular, e além de promover recrutamento de leucócitos, estimula as células endoteliais locais a expressarem adesinas aos neutrófilos, induzindo-os a infiltrarem-se no tecido mamário (SORDILHO et al 1997). Além disso, ativam a capacidade fagocítica dos neutrófilos (BANNERMMAN et al 2004). Uma resposta inflamatória local, exagerada ou aguda, pode causar extensa necrose do parênquima mamário e perda de produção de leite (CORL et al, 2010).Como os níveis de citocinas sofrem variações frente ao processo infeccioso, elas são consideradas promissoras no diagnóstico e na avaliação do prognóstico da saúde do úbere (ALLUWAIMI, 2004). A resposta inflamatória pode estar presente mesmo que o microrganismo já tenha sido eliminado de forma natural pelos processos de cura espontânea, resultando assim em culturas negativas e CCS elevadas e perdas de produção de leite (RIBEIRO et al,2003; COSTA, 2012). 2.2 CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS X COMPOSIÇÃO DO LEITE E PRODUÇÃO As células somáticas são todas as células presentes no leite, que incluem as células originárias da corrente sangüínea como leucócitos, macrófagos, polimorfonucleares e células de descamação do epitélio glandular secretor. No leite do animal sadio, as células epiteliais representam de 0 a 7%, mas, de acordo com alguns autores, podem

13 7 corresponder a até 20% do número total de células, dependendo do estágio de lactação. Em casos de processo inflamatório do úbere há aumento da CCS no leite. As células somáticas são, portanto, um reflexo da resposta inflamatória da glândula mamaria. Contagem de células somáticas é frequentemente usada para distinguir entre quartos mamários infectados e não infectados (MULLER, 2002; PILLAI et al, 2001;BRITO,et al 2007; CASAS, et al, 2012). BRITO et al (2007), relata que células somáticas estão geralmente presentes em pequeno número até ou mesmo por mililitro (ml) no úbere sadio, mas em presença da inflamação podem alcançar contagens elevadas por ml de leite. A CCS no leite de animais individuais ou de tanque é uma ferramenta valiosa na avaliação do nível de mastite subclínica no rebanho (MULLER,2002). As estimativas das perdas de produção podem variar de 10 a 30% da produção leiteira por lactação.(santos, 2011). HARMON (2001) afirma que considerando a vaca ou o quarto mamário, a CCS normal geralmente está abaixo de cels/ml, mas pode ser menor do que cels/ml (PELEGRINO et al, 2008). De acordo com SCHUKKEN (2011), contagens normais de células do sistema imune (CCS) em quartos mamários saudáveis variam entre a cel/ml de leite. Entretanto, um elevado número de patógenos causadores de mastite foi encontrado em CCS 100 mil cel/ml. Em alguns casos, patógenos foram detectados em amostra de leite de vacas com CCS de 1000 cel/ml. Baseado nessas informações, os processos inflamatórios podem ocorrer na glândula mamária mesmo com valor de CCS de glândulas mamárias classificadas como saudáveis de acordo com as definições atuais (HARMON, 1994). Em 11 de 65 úberes com CCS menor do que cel/ml, bactéria foi encontrada, sinalizando mastite latente nesses quartos. Interessantemente, todas essas bactérias foram Staphylococcus coagulase negativa (SCN) detectados numa faixa de CCS entre 7 mil 59 mil cel/ml (SCHWARZ et al, 2011). Entretanto para DOHOO e LESLIE (1991) e RUEGG (2003) o ponto de corte para definir se o animal é infectado é acima de 200 mil células, sendo este parâmetro utilizado atualmente. Além do aumento do número de células, a mastite provoca alterações nos três principais componentes do leite: gordura, proteína e lactose. (MULLER,2002).A extensão do aumento da CCS e as mudanças na composição do leite estão diretamente relacionadas

14 8 com a superfície do tecido mamário atingido pela reação inflamatória. Portanto há uma relação direta entre a CCS e a concentração dos componentes do leite (SCHÄELLIBAUM, 2000; MULLER, 2002). Quando CCS eleva > 100 mil cel/ml a perda de produção é elevada (HALASA et al, 2009). Entre os componentes do leite, as proteínas são as que apresentam a maior variação em animais com mastite. Pode haver decréscimo significativo nos teores de caseína total e elevação das proteínas do soro, incluindo grande elevação nas imunoglobulinas. A proteína total do leite tem pouca variação, mas a concentração de cada tipo de proteína varia acentuadamente (MULLER, 2002 ; BUENO et al, 2005 ; PELEGRINO et al, 2008). A caseína corresponde a, aproximadamente, 80% das proteínas do leite sintetizadas inteiramente no interior da glândula mamária e consideradas financeiramente entre as mais importantes devido à sua relação com a produção de queijos (MACKLE et al., 1999; ZAFALON et al, 2009). Existe uma redução das proteínas sintetizadas na glândula mamária (α e β caseína, α- lactoalbumina e β-lactoglobulina (MULLER, 2002; ZAFALON et al, 2009; FONSECA; SANTOS, 2000). Segundo HARMON, 1994; PELEGRINO et al, 2008, ocorre aumento das proteínas plasmáticas no leite, devido ao aumento da permeabilidade vascular em decorrência ao processo inflamatório (KITCHEN, 1981; MULLER, 2002). Dessa forma, a porcentagem de proteína total no leite com elevada CCS reduz apenas 1%, em relação à concentração encontrada no leite de vacas sem mastite. Na mastite subclínica ocorre um aumento do conteúdo de proteína total do leite pelo aumento da lactoferrina, de imunoglobulinas e da soroalbumina bovina, proteínas associadas com respostas inflamatórias da glândula mamária (URECH et al., 1999; ZAFALON et al, 2009). Normalmente existe tendência de queda na concentração de gordura à medida que aumenta a CCS. Nos casos em que a produção de leite diminuiu em uma proporção maior que a síntese da gordura, a percentagem de gordura aumenta em animais com altas CCS em função do efeito da concentração (KITCHEN, 1981). A mastite, acompanhada de altas CCS, está associada à diminuição da concentração de lactose no leite, isso acontece porque alguns microrganismos utilizam a lactose como fonte de energia. O potássio, mineral predominante no leite, decresce devido ao dano celular, enquanto há uma elevação nos níveis de sódio e cloro que passam do sangue para o leite (HARMON, 1994; SCHÄELLIBAUM, 2000; SCHUKKEN, 2011).

15 9 Na tabela apresentada por SCHAELLIBAUM (2000), observa- se as mudanças que acontecem na composição do leite à medida que há aumento na contagem de células somáticas. Tabela 1. Mudanças na composição do leite associadas com elevada contagem de células somáticas. Uma das principais formas de estimar as perdas de produção de leite é pelo uso da CCS (contagem de células somáticas). Segundo RENEAU (1986), o único fator mais importante a afetar a contagem de células somáticas é o estado de infecção da glândula mamária. As respostas específicas dos patógenos podem ser reconhecidas na CCS do leite relativa à infecção intramamária, além de notáveis perdas na produção leiteira, risco de descarte e morte dos animais (SCHUKKEN, 2011). A mastite subclínica afeta qualidade e quantidade do leite causando alta perda econômica para os produtores (VIGUIER et al, 2009). Infecções intra-mamárias próximas ao parto, seja clínica ou subclínica, levará a consideráveis perdas econômicas para o produtor, e deveriam ser evitadas. Pouca higiene na área de parto está associada à elevação e prevalência de elevada CCS em novilhas (DE VLIEGHER, 2004).

16 10 Segundo estudo canadense de DOHOO et al (1984), para cada incremento de mudança no nível de CCS acima de 200 mil células, houve perda no rebanho de 1.44kg por vaca. Em vaca primípara e multípara com CCS de 200 mil células por ml houve perda de 0.31 e 0.58 kg de leite por dia, respectivamente, quando o efeito de diluição não é considerado (HALASA et al, 2009). Em um estudo realizado com grupos de diferentes rebanhos de Nova York, foi determinado que os agentes que causaram maiores perdas de produção em primíparasforam:s. aureus, E. coli, Klebsiella spp. Já nas multíparas foram Streptococcus spp. Staphylococcus aureus, Arcanobacteruim pyogenes, Escherichia coli, e Klebsiella spp. As vacas de primeira lactação que tiveram mastite clínica causada por Streptococcus spp. apresentaram uma pequena redução na produção após o início do caso e na primeira semana atingiram perdas de 2,5 kg/dia (SANTOS,2011). VIGUIER et al (2009) realizou um estudo em vários países onde analisaram os custos financeiros causados pela mastite dados de Nos EUA, as perdas anuais projetadas gerada pela mastite são US$2 bilhões.no Reino Unido, mastites causam uma perda anual de aproximadamente 300 milhões para produtores de leite. Na Irlanda do Norte, o valor total anual de infecções por mastite é de 14 milhões. Na Holanda o custo médio por vaca infectada varia entre s164 e s235. Segundo LOPES et al (2012), quando a CCS está elevada, o número de patógenos de mastite por ml de amostra de leite foi alto.quanto maior a intensidade do processo inflamatório, maior será a liberação de bactérias causadoras de mastite pela glândula mamária. Desta forma, CCS é um bom indicador de liberação de bactérias pelas glândulas mamárias, entretanto estas correlações não são suficientes para acessar as diferenças entre patógenos de mastite com a mesma elevação de CCS. O agente microbiano pode ainda já ter sido eliminado de forma natural pelos processos de auto cura, resultando em cultura negativa. (RIBEIRO et al,2003). O exame microbiológico é considerado o método padrão para determinação da saúde do úbere e para o diagnostico da mastite bovina. Análises microbiológicas são complementares e indispensáveis em um programa de controle desta enfermidade, por possibilitarem o isolamento e a identificação do seu agente etiológico causadores de doença no rebanho (BUENO et al., 2003; MARTINS et al, 2010; SCHVARZ et al, 2012).

17 BACTÉRIAS Os patógenos maiores, ditos mais freqüentes, são: Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus agalactiae, coliformes e Streptococcus spp. Eles causam a maior elevação de CCS. Os patógenos menores como Corynebacterium bovis (CB) e Staphylococcus coagulase negativa (SCN), geralmente causam moderada elevação na CCS (SOUZA, 2009). Dependendo do agente etiológico da mastite e de modificações patológicas da glândula mamária, ocorrerá variações na CCS (LOPES et al, 2012). Segundo SCHUKKEN (2011), a adaptação ao hospedeiro por algumas espécies de bactérias, resultaria em infecções persistentes associadas a um padrão clínico da doença com menor severidade e maior oportunidade de persistência de infecção subclínica e transmissão de cepas de espécies bacterianas dominantes no rebanho. Em experimento realizado por LOPES et al (2012), os patógenos isolados dos quartos mamários foram S. aureus (10.8%), SCN (10%), Streptococcus agalactiae (7.1%), outros Streptococcus spp (6.1%); e a média da CCS de acordo com resultados microbiológicos cresceu nesta ordem: sem crescimento microbiológico, SCN, outros Streptococcus spp, S. aureus e Streptococcus agalactiae. LONGO et al (1994), estudando a mastite subclínica em quatro rebanhos, compostos por 118 vacas leiteiras e 468 quartos mamários, verificaram que o S. aureus, foi isolado de 44,7% dos casos, SCN de 31,6% e Streptococcus spp de 11,4%, sendo o S. aureus o agente etiológico mais freqüente nas mastites subclínicas. HARROP et al. (1975), estudando a incidência da mastite bovina em 866 vacas procedentes do Agreste Meridional de Pernambuco encontraram 338 vacas reagentes ao CMT (39,0%) e 275 animais (31,2%) estavam com infecções no úbere detectadas pelo exame bacteriológico, sendo, S. aureus e Streptococcus spp. as bactérias mais frequentes. Em um experimento realizado por BARBALHO et al (2001) demonstrou que as bactérias do gênero Staphylococcus spp foram isoladas de 50 amostras, correspondendo a 38,76% do total dos agentes isolados. Estes agentes foram isolados com maior frequência em vacas com mastite subclínica.

18 12 Segundo estudos de (SOUZA et al, 2009), observou que (30,3%) amostras não apresentaram crescimento bacteriano e em (69,7%) foi identificada a presença de pelo menos um patógeno da mastite. Entre as amostras de leite que apresentaram crescimento bacteriano, foram 826 (31,6%) para Corynebacterium spp.; 790 (30,2%) para S. aureus; 551 (21,1%) Streptococcus agalactiae; 466 (17,8%) SCN; e 351 (13,4%) Streptococcus spp. que não S. agalactiae Staphylococus spp Staphylococcus coagulase negativa (SCN) são patógenos comuns em rebanhos leiteiros e estão principalmente associados aos casos subclínicos de mastite, e à presença de células somáticas no leite, com CCS próximas a 300 a 400 cels/ml de leite. Os SCN constituem um grupo bastante heterogêneo de microrganismos associados a infecções da glândula mamária de bovinos, sendo comumente encontrados no ambiente dos estabelecimentos de ordenha, em equipamentos de ordenha e na pele dos quartos mamários (SANTOS et al,2011). A presença desses microrganismos é maior em propriedades que reduziram o número de infecções causadas por outros patógenos, sendo mais frequentes em animais de primeira lactação (SOUZA, 2009; LAFFRANCHI et al, 2001 ; SANTOS et al, 2011). Apesar de serem considerados menos patogênicos que os S. aureus, as infecções causadas por SCN têm sido associadas com perdas consideráveis de leite por lactação, tendem a persistir durante todo o período da produção, com CCS próximas a cels/ml de leite e os índices de curas espontâneas das infecções causadas são considerados baixos (HOOGAN, 2003). Staphylococcus aureus (S. aureus) é importante causa de infecção intramamária no rebanho leiteiro. A sua transmissão é de vaca a vaca, por animais infectados no rebanho. No entanto, outras cepas não-contagiosas de S. aureus presentes no ambiente foram descritos coexistindo com cepas contagiosas de S. aureus (ZADOKS et al, 2002). A prevalência de S. aureus como causador de mastite bovina pode estar relacionada aos mecanismos de resistência, tais como a presença do biofilme nos equipamentos de ordenha, redução da susceptibilidade a antimicrobianos, ao baixo percentual de cura

19 13 durante a lactação e a presença deles tanto no ambiente (fômites) quanto nos animais e no homem (MELO, 2008). S.aureus está tipicamente associado à infecção persistente e duradoura. A contagem bacteriana é bem menor em comparação a infecções intramamárias causadas por Escherichia coli e Streptococcus uberis (SCHUKKEN, 2011). A maioria de suas infecções são subclínicas, geralmente não detectadas. A eficácia dos Programas de Controle difere bastante entre rebanhos, provavelmente por consequência da patogênese multifatorial da mastite gerada pelo S. aureus (PICCININI et al, 2012). O microrganismo entra na glândula mamaria via canal do teto, multiplica-se dentro da cisterna onde ocorre adesão às células epiteliais, o que representa importante passo no processo de infecção (PICCININI et al, 2012; DEGO, 2002). As bactérias também podem estar fagocitadas pelos leucócitos durante a estocagem do leite e antibioticoterapia pode ter ocorrido antes da coleta da amostra de leite. No ato do exame os patógenos podem estar fagocitados ou sobrevivendo intracelularmente no hospedeiro (ALLORE, 1998; SCHWARZ et al, 2011). Amostras de Staphylococcus aureus foram encontradas em macrófagos e em células alveolares isolada do leite de vacas com infecção crônica. S. aureus produz vários fatores de virulência, como proteínas que promovem adesão ao tecido mamário, toxinas que podem gerar danos ao parênquima e enterotoxinas que interferem na resposta imunológica do úbere (PICCININI et al, 2012). De acordo com pesquisa feita por SEARS et al (1990), tanto em vacas infectadas naturalmente como experimentalmente por S. aureus, foi observado alto e baixo ciclo de liberação de bactérias. O ciclo de baixa liberação de bactérias foi estabelecido em < 1000 UFC/ml de leite, e o ciclo de alta liberação de bactérias foi definido em >2000 UFC/ ml de leite. Foram utilizados 21 quartos mamários de sete vacas sadias, e foram coletadas 991 amostras de leite para exame bacteriológico para S aureus. Destarte, para mastite por S. aureus, pode ser estabelecido um padrão cíclico de liberação desse patógeno no leite.

20 Bactérias gram-negativa: coliformes As bactérias gram-negativas causadoras de mastite e sua patogenicidade têm sido estudadas recentemente através de seu principal representante, o coliforme Escherichia coli (E. coli). A E. coli expressa uma variedade de fatores de virulência, entretanto ainda não está definida a relação entre a severidade da doença e fatores específicos de virulência (SCHUKKEN, 2011). Os coliformes não se aderem aos ductos e alvéolos no úbere, em vez disso, eles se multiplicam rapidamente no leite e produzem toxinas que são absorvidas na corrente sanguínea. Como resultado, infecções por coliformes levam à mastite aguda ou super aguda (QUINN et al, 2005). A Escherichia coli habita o trato gastrointestinal das vacas leiteiras. É classificada como patógeno ambiental da mastite, pois sua infecção é primariamente dependente da exposição ao ambiente (QUINN et al, 2005). Bactérias gram-negativas utilizam a lactose como fonte de energia através do leite para crescimento e multiplicação (SCHUKKEN, 2011). A CCS mais elevada identificada entre os patógenos causadores de mastite foi gerado pela E. coli (DJABRI, 2002). A infecções por essa bactéria são tipicamente caracterizadas por sintomas agudos seguido de cura espontânea. No entanto, dentre os casos onde a mastite resultou em morte, aquelas causadas pela E.coli são mais prevalentes (RINALDI et al, 2010). A habilidade de crescer em secreções mamárias e de liberar lipopolissacarídeos (LPS) é crucial na patogênese da mastite causada por bactérias gram-negativas. Quanto mais rápido o numero de bactérias é elevado na glândula mamária, maior quantidade de LPS estará presente na glândula, e a resposta inflamatória e doença clínica ocorrerão mais rápido (MEHZRA et al, 2008). Segundo HOGAN (1989), infecções intramamárias por coliformes tendem a ser de curta duração, mais de 50% duram menos de 10 dias. Em um estudo realizado por RADOSTITS (2002) as infecções por coliformes ambientais em um rebanho geralmente fica em torno de 1% a 2%. Sua principal característica é a curta duração, persistindo por um período de sete dias.

21 15 Infecções causadas por E. coli são tipicamente, mas não exclusivamente, associadas a uma resposta imune mais rápida e intensa, onde infecções por S. uberis são caracterizadas por resposta lenta e menos intensa. Em contrapartida, S aureus é capaz de burlar a resposta do sistema imune e sua infecção é procedida de resposta moderada do hospedeiro (RINALDI et al, 2010) Streptococcus spp: Streptococcus uberis é uma causa comum de mastite clinica e subclínica; são geralmente considerados de natureza ambiental, no entanto comportamento contagioso (vaca a vaca) é frequentemente observado (ZADOKS et al, 2002). Trato gastrointestinal, pele, solo e material de cama são reservatórios naturais do S. uberis. As moléculas bacterianas secretadas pelo S. uberis são capazes de inibir a função bactericida dos neutrófilos, por gerarem falha na produção de pseudópodes, sendo assim a bactéria permanecerá por mais tempo na glândula mamária (SCHUKKEN, 2011). Streptococcus dysgalactiae (S. dysgalactiae) parece ocupar uma posição intermediária dos grupos dos patógenos contagiosos e ambientais da mastite, com amostras adaptadas aos animais e ao ambiente (AARESTRUP e JENSEN, 1996; CALVINHO et al, 1998). Como a bactéria pode persistir na glândula mamária, a transmissão pode ocorrer durante a ordenha e, conseqüentemente, o controle pode ser realizado pela adoção de procedimentos higiênicos corretos no momento da ordenha (BRAMLEY e DODD, 1984). Injúrias nas extremidades dos quartos mamários e procedimentos inadequados de ordenha promovem a disseminação da bactéria dentro do rebanho (CALVINHO et al, 1998). Entretanto, o S. dysgalactiae pode ser encontrado fora da glândula mamária como no ambiente, tonsilas, boca e vagina das vacas e causa mastite aguda (BRAMLEY e DODD, 1984). Streptococcus. agalactiae (S. agalactiae) é patógeno contagioso, localiza-se somente na glândula mamária, com sobrevivência restrita fora do úbere e, é altamente sensível à penicilina. Devido a estas características S. agalactiae tem sido erradicado de rebanhos e até mesmo de alguns países (KEEFE et al, 1997)

22 16 O curso da infecção do S. agalactiae é semelhante ao da infecção crônica subclínica causada por Staphylococcus. aureus, com ciclos de liberação de bactérias acompanhados de altas CCS (KEEFE, 1997) 3 OBJETIVO O objetivo do trabalho foi identificar os patógenos causadores de mastite subclínica no rebanho da fazenda experimental PUC Minas, analisar a dinâmica de infecção desses patógenos, calcular a perda de produção de leite que cada patógeno ocasiona e analisar a contagem de células somáticas. Com a analise microbiológica junto com a contagem de células somáticas pode determinar se tinha processo bactéria ou se a bactéria já tinha sido fagocitada e o que prevalecia era o processo inflamatório. 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Caracterização da fazenda O experimento foi conduzido na Fazenda experimental da PUC Minas, que fica na zona rural de Esmeraldas. O período experimental ocorreu nos meses de Dezembro de 2012 a Fevereiro de 2013, estação de verão tipicamente brasileiro: época de elevada umidade e temperatura. A composição do rebanho era de gado leiteiro mestiço, com graus de sangue de 3/4 holandês-zebu, 7/8 holandês-zebu e holandês pura origem (PO). A média diária de produção de leite durante o período experimental foi de 23kg/dia. A quantidade de vacas em lactação no período foi em média 40 cabeças. O sistema de criação dos animais é o Freestall onde os animais ficavam confinados durante o ano inteiro e recebiam dieta balanceada de acordo com a produção de leite. Os animais deitavam em camas de areia a qual era reposta três vezes na semana. Eram realizadas duas ordenhas diárias, sendo a primeira às seis horas da manhã e a segunda às três horas da tarde. O equipamento de ordenha era duplo-tres com extração automática, da marca DeLaval.

23 Coleta de amostras No momento da coleta de amostras, os três primeiros jatos foram utilizados para realização do teste da caneca de fundo escuro para visualização de grumos no leite que ocorrem em casos de mastite clínica. Se o animal estivesse com muita matéria orgânica acumulada na região do teto, era feita a lavagem dessa região. Foi realizada a antissepsia dos tetos com solução pré dipping com cloro a 2% e após trinta segundos de ação dessa solução, os respectivos quartos mamários eram enxugados com papel-toalha. No momento da coleta, foi realizada antissepsia do esfíncter do teto, utilizando se algodão umedecido com álcool a 70%. Esse procedimento era realizado primeiramente nos tetos mais afastados do ordenhador, e em seguida nos tetos mais próximos ao ordenhador. Os jatos foram retirados de cada teto individualmente, seguindo a sequência de primeiramente, tetos mais próximos do ordenhador, e em seguida, tetos mais afastados ao ordenhador, formando uma amostra composta de aproximadamente 80 ml, acondicionados em frascos estéreis e resfriados em caixas térmicas com gelo reciclável. A temperatura média dentro da caixa térmica era de 5 C, não ultrapassando 7 C até as amostras serem acondicionadas em freezer para o congelamento e depois serem enviadas para o laboratório. As amostras para CCS foram coletadas dos medidores de leite durante a ordenha, acondicionadas em frasco estéril de 80ml, com conservante Bronopol, refrigeradas em caixas térmicas com gelo reciclável. A temperatura média dentro da caixa térmica era de 5 C, não ultrapassando 7 C e posteriormente enviadas ao Laboratório de Análise da Qualidade do Leite da UFMG, utilizando-se equipamento eletrônico BENTLEY Os cultivos foram realizados em 40 vacas em lactação. Para caracterizar melhor a dinâmica de infecção dos patógenos envolvidos na contagem de células somáticas das vacas em produção, foram feitos 12 cultivos de cada vaca, com intervalo de sete dias. O total de amostras para cultura microbiológica foi de 480 amostras (40x 12).

24 18 Os cultivos foram feitos segundo o padrão proposto pelo Laboratory Handbook on Bovine Mastitis pelo NMC National Mastitis Council -, de As análises foram realizadas no Laboratório de microbiologia da PUC Minas Betim, onde o leite foi descongelado à temperatura ambiente e a semeadura foi realizada dentro Capela de Fluxo Laminar. Para todos os cultivos, o meio de cultura utilizado foi o Ágar Sangue. Após a semeadura, todas as placas devidamente identificadas eram levadas para estufa à 37 C durante 48 horas. Depois analisadas a olho nu para observação de crescimento bacteriano e inicial identificação de bactérias através do aspecto da colônia. Foi realizado o teste da Catalase, KOH e CAMP dentro da Capela de Fluxo Laminar. O primeiro teste realizado foi o de Catalase para distinção de Staphylococcus spp de Streptococcus. spp. Se a Catalase desse positiva, Staphylococcus spp identificado. Catalase negativa, realizava-se o teste do KOH. O teste do KOH serve para determinar se a bactéria é Gram-negativa ou Gram-positiva. Este teste serviu para separarmos bactérias gram-negativas (coliformes) de grampositivas (estreptococos). Resultados positivos de KOH: bactérias gram-negativas (coliformes). Diante desses resultados, determinamos os coliformes. Resultados negativos de KOH: bactérias gram-positivas (estreptococos). Com os resultados negativos de KOH, os estreptococos foram isolados para realização do teste de CAMP, visto que os estafilococos já haviam sido identificados pelo teste da Catalase. O teste CAMP resulta em positivo para o patógeno Streptococcus agalactiae, em negativo para o Streptococcus dysgalactiae, e para o Streptococcus uberis, pode ser tanto negativo quanto positivo. O teste que sanaria a dúvida para o Streptococcus uberis seria o CAMP-Esculina. Infelizmente o teste CAMP-Esculina não pode ser executado neste projeto de pesquisa. 4.3 Delineamento e análise estatística Para CCS foi feito teste de Tukey para nível de significância de 5%. Coeficiente de regressão para estimar a perda de produção de leite foram obtidas através de regressões, utilizou o Excel para estas análises.

25 19 RESULTADOS E DISCUSSÃO As tabelas foram montadas para estabelecer parâmetros de freqüência de patógenos, distinção de vacas saudáveis e vacas com infecção intramamária; coeficientes de regressão da produção diária de leite, estimativa de perda de produção diária, baseados nos dados de CCS e isolamento bacteriano. Na tabela 2, estão apresentados os resultados do cultivo microbiológico do rebanho em lactação. Pode-se observar que em 21,1% das amostras, não houve crescimento bacteriano (NHC); 79,2% foram de amostras de leite que apresentaram crescimento bacteriano, sendo isolados os seguintes patógenos: 4,6% para coliformes, 42% de Staphylococcus spp., e 32,3 % de Streptococcus spp. Estudo feito em propriedades rurais de Teresina, PI, em período de verão também observou maior prevalência para o gênero Staphylococcus ssp, isolado em 74,60% das culturas e o gênero Streptococcus spp apareceu na seqüência de ordem de importância. Tabela 2: Frequência de microrganismos causadores de mastite encontrados no cultivo do rebanho e média da CCS e total de amostras analisadas, dentro de cada grupo analisado no rebanho leiteiro da fazenda PUC Minas em Esmeraldas-MG, durante os meses de dezembro de 2012 a fevereiro de % CCS Amostras Analisadas NHC 21, Coliformes 4, Staphylococcus Streptococcus 32, Média 811,8 Total de Amostras 393 Total de Amostras 399 Na literatura está relatado que os principais patógenos da mastite são Staphylococcus spp e Streptococcus spp (BARBALHO, et al, 2001). O mesmo foi encontrado neste experimento, onde o Staphylococcus spp foi encontrado em primeiro lugar, Streptococcus

26 20 spp em segundo, NHC em terceiro e coliformes em quarto lugar; esse dado é semelhante ao encontrado por LOPES, Os Staphylococcus spp estão presente em maior número, 42%, mas a CCS é a menor (693 x 10³) quando comparada ao Streptococcus spp e aos coliformes. Isso pode ter ocorrido por alguns motivos, dos quais: a bactéria pode não ter chegado ainda nas extremidades mais dorsais da glândula mamária, estando localizada na cisterna do teto (RINALDI et al, 2010); a bactéria possui mecanismos de resistência que burla o Sistema Imune (SI) do hospedeiro (MELO, 2008). Para tanto, os mecanismos de defesa da glândula mamária não detectarão a bactéria, logo, não terá aumento da CCS. Já os estreptococos possuem CCS de 863 x 10³, pois são identificados com facilidade pelo SI da glândula. Dentre a amostra de coliformes apresenta na tabela 2, consta que a prevalência é baixa mas a CCS é alta (1032 x 10³). Como já foi citado por QUINN(et al 2005), esse fato se justifica pois os coliformes são eliminados de forma rápida, mostrando que a infecção é de curta duração, todavia não houve cura da glândula, existindo o processo inflamatório que vai causar também o aumento das CCS (ALLUWAIMI, 2004). Nas tabelas 2 e 3, ao analisar as amostras NHC, não há o crescimento bacteriológico, mas o nível de CCS está elevando. Os resultados de CCS das amostras NHC estavam elevados (659 x 10³), como mostra a tabela 2, por isso, na tabela 3 as amostras de NHC foram divididas em dois grupos. As amostras NHC < 100 mil CCS são consideradas vacas sadias e as amostras NHC 100 mil CCS são vacas doentes (BRITO et al, 2007). Essa elevação da CCS, mesmo sem crescimento bacteriano é devido a resposta inflamatória da glândula mamária (ALLUWAIMI, 2004; RIBEIRO et al, 2003). As bactérias também podem estar fagocitadas nos leucócitos, não sendo detectadas na microbiologia (ALLORE, 1998; SCHWARZ et al, 2011). Tabela 3: Distinção de vacas saudáveis e não saudáveis de acordo com o valor da CCS e cultura negativa no rebanho leiteiro da fazenda PUC Minas em Esmeraldas-MG, durante os meses de dezembro de 2012 a fevereiro de % CCS Amostras Analisadas

27 21 NHC (< 100 MIL CCS) 5,3% 46 a 21 NHC (>= 100 MIL CCS) 15,5% 867 b 62 Positivas 79,2% 789 b 316 Média 811,8 Na tabela 4, temos que vacas positivas para o exame microbiológico e com elevada CCS (média de 943 x 10 3 ), são as que mais obtiveram perda diária de leite (-5,7kg/dia) com coeficiente de regressão de -4,35. Trata-se de vacas com infecção intra mamária, o que justifica o aumento elevado de CCS e a elevada perda de produção (RENEAU, 1986). Em HALASA et al (2009), as vacas do rebanho com CCS de 200 mil células por ml houve perda de 0.31 e 0.58kg, valor mais elevado do que o encontrado no atual estudo. Entretanto, na tabela 4, a perda de produção estimada para vacas com elevada CCS, porém negativas na microbiologia, está separada das positivas para exame microbiológico, e estas amostras também mostraram significante perda de produção diária, -2,1kg/dia, com coeficiente de regressão de -1,67. Esses animais negativos (sem crescimento microbiológico) com CCS 100 mil mostram que houve infecção anteriormente e ocorreu cura espontânea, visto que a CCS se encontra elevada (RIBEIRO et al, 2003). Pode-se estipular também que os possíveis patógenos que estavam presente nesta glândula mamária seriam coliformes, pois estes geram infecção de curta duração (HOGAN, 1989), e possuem muitos fatores de virulência, com resposta inflamatória mais rápida (MEHRZAD, 2010). Outra questão é que no ato do exame microbiológico, as bactérias podem estar fagocitadas ou sobrevivendo intracelularmente no ambiente do hospedeiro (ALLORE, 1998; SCHWARZ et al, 2011), resultando em cultura microbiológica. Já os animais com crescimento microbiano (positivas) e com CCS <100 mil, não obtiveram diferença estatística entre os demais grupos. Processos inflamatórios podem ocorrer em glândulas mamárias com valores de CCS de vacas saudáveis, sinalizando mastite latente e presença de bactérias (SCHWARZ et al, 2011). Ainda que na atual

28 22 pesquisa não fossem feitos testes para diagnosicar Staphylococcus coagulase negativa, sabemos da prevalência desse patógeno em rebanho leiteiros. O mesmo gera mastite branda e menor perda de leite (DE VLIEGHER, 2004); informações que vão de encontro ao resultado encontrado vacas positivas e CCS <100 mil. Tabela 4: Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e estimativa de perda de produção diária (kg) sobre a CCS transformada (log 10 ) baseados nos testes semanais de pesagem de leite e CCS das vacas negativas na microbiologia (CCS>=100 mil), vacas positivas (CCS <100 mil), vacas positivas (CCS >= 100 mil) em relação às vacas negativas na microbiologia (CCS <100 mil; n=21), média e mediana da CCS (x 10 3 ), no rebanho leiteiro da fazenda PUC Minas em Esmeraldas-MG, durante os meses de dezembro de 2012 a fevereiro de Negativas >= 100 mil CCS Positiva CCS < 100 mil Positiva >=100 mil Coeficiente de Regressão -1,67 ** 1,98-4,35 * Estimativa de Perda de Produção (kg/dia) -2,1** 0,8-5,7* N CCS x 10 3 Média Mediana *p <0,001; **p <0,10 Na tabela 5, estão apresentadas as estimativas de perda de leite de acordo com cada tipo de patógeno isolado nos cultivos microbiológicos. Os coliformes possuem a média de CCS mais elevada (1092 x 10 3 por ml de leite), seguida de Streptococcus spp (867 x 10 3 por ml de leite) e por último, Staphylococcus spp (706 x 10 3 por ml de leite). Tal resultado difere do encontrado por LOPES et al (2012), onde a média de CCS de Staphylococcus spp foi mais elevada que a de Streptococcus spp. Para as culturas negativas foi encontrado resultado considerável de CCS, o que pode ter acontecido processo de autocura na glândula mamária, entretanto ainda com processo inflamatório (RIBEIRO et al, 2003); ou a bactéria estava fagocitada por células de defesa, não sendo encontrada no exame microbiológico (ALLORE, 1998; SCHWARZ et al, 2011).