CONCEITOS DE BIOLOGIA MOLECULAR. Jorge Mondego

Transcrição

1 CONCEITOS DE BIOLOGIA MOLECULAR Jorge Mondego

2 Biologia Molecular

3 Genome Transcriptome The OME -Era Proteome Metabolome

4 - Entendimento da fisiologia e reprodução de microorganismos - Entendimento dos mecanismos de replicação, transcrição e tradução - Enzimas de restrição - Plasmídeos - Purificação de proteínas e Enzimologia - Polymerase Chain Reaction (PCR) - Transcriptase reversa e RT-PCR - Sequenciamento - Fluoróforos - Automação

5 Plasmídeos Cromossomo bacteriano Plasmídeos DNA extracromossômico capaz de se replicar independentemente da replicação cromossomal - Resistência a antibióticos - Produção de toxinas - Conjugação (transmissão de material genético entre as bactérias) - Origem de replicação própria

6

7 Transferência horizontal de genes Conjugação Transmissão de material genético entre as bactérias Transferência de material genético entre reinos Agrobacterium tumefaciens

8 Transformação Competência Habilidade de uma célula receber DNA extracelular vindo do meio ambiente. -Natural: Bactérias adquirem DNA do meio para nutrição, reprodução e reparo de seu DNA, através de mecanismo de transporte membranar. - Artificial: Uso de procedimentos de laboratório que tornam as células passíveis de serem transformadas.

9 Transdução Fagos vírus que infectam bactérias

10 Enzimas de restrição (endonucleases) Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton Smith Sistema de modificação - restrição - Enzimas bacterianas que reconhecem e clivam DNA invasor - Reconhecimento de seqüência palindrômica de DNA exógeno - Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas Seqüência palindrômica 5'-GTATAC-3' 3'-CATATG-5'

11 Pontas coesivas Cohesive ends Pontas cegas Blunt ends

12 Manipulação dos plasmídeos e a tecnologia do DNA recombinante Sítio de clonagem Resistência a antibióticos Origem de replicação

13 Clonagem em vetores -Plasmídeo é digerido com enzimas -Gene específico é ligado no plasmídeo, replicado em diversas cópias

14 Transformação Choque térmico Choque osmótico

15

16 Shuttle vectors Plasmídeos que se propagam em duas espécies -Transformação de plantas, leveduras, fungos filamentosos e células animais

17 Fagos como vetor Bacteriófagos

18 Vetores Tamanho do inserto Plasmídeos de alta cópia Bacteriófago λ (inserção) Bacteriophage λ (substituição) Cosmídeos Bacteriófago P1 BAC (cromossomos artificiais de bactérias) YAC (cromossomos artificiais de leveduras) 0 10 kb 0 10 kb 9 23 kb kb kb até 300 kb Mb

19 PCR - A REVOLUÇÃO DA TAQ Kari Mullis 1985 Premio Nobel de química -1993

20 PCR 1

21 PCR 2 95 C Tm 72 C n Ciclos de PCR

22 PCR Otimização da reação - Concentração dos reagentes Tris-HCl ph 8,8 (20 mm) KCl (10-50 mm) MgCl 2 (1 a 4 mm) Menos Mg mais especificidade Glicerol (menos que 5%) dntps (200 a 10 µm Menos dntp - mais especificidade) Taq (1 unidade) -Condições dos ciclos Etapa de denaturação inicial (1-3 min a 95 C) Etapa de denaturação (30 seg a 2 min a 95 C) Etapa de anelamento Etapa de extensão (30 seg a 1min e 30 seg a C) - Desenhos dos primers

23 Características desejáveis em um Primer Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 ºC a 65 ºC. Tamanho de 15 a 28 pares de bases Ausência da capacidade de dimerização. Ausência significativa da formação de grampos (>3 bp) Inexistência de sítios secundários de anelamento dos primers. Temperaturas de anelamento de primers formando um par devem ser próximas

24 Comprimento - Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que maiores serão as temperaturas de melting e anelamento. - De uma forma geral, o comprimento do primer não deve ser inferior a 15 bases para assegurar a unicidade. - A existência desta faixa está baseada no fato de se buscar unique primers que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada.

25 Temperatura de Melting (TM) - É a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice. - Tm é dependente da composição do DNA, de modo que aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior número de ligações de H. Temperatura de Anelamento É a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm. T anneal = Tm_primer 4 C

26 Estringência no Anelamento do Primer - A estringência determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado. - T anneal é o fator mais significante que afeta a estringência no anelamento do primer. -T anneal : Muito baixa = menor estringência = primer pareia em qualquer lugar. muito alta = maior estringência = primer pode não parear.

27 Estrutura interna do primer - Evitar essas estruturas.....pode-se utilizar primers com estas estruturas se estas forem formadas a uma temperatura em torno de 30 C menor que a Tm

28 atgatagaggctctcgaagctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaa M I E A L E A E V T R R T L E F D T C K gtcgtcgctctcccaatggtataa V V A L P M V * Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) 5 - atgatagaggctctcgaagctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaagtcgtcgctctcccaatg 3 - tactatctccgagagcttcgactccactggtcctcttgcgagctcaaactgtgcacatttcagcagcgagagggttac gtataa 3 catatt atgatagaggctctcgaag ttataccattgggagagcg 3

29 TRANSCRIPTASE REVERSA e A QUEBRA DO PARADIGMA DNA RNA Proteína Quebra do paradigma

30 RT REVOLUTION PRIMERS UTILIZADOS Oligo(dT) Somente mrna Hexâmeros randômicos - Anelamento em regiões aleatórias Primer específico do gene - Amplificação somente do gene alvo

31 Bibliotecas

32 Expressed Sequence Tags (ESTs) Extrair RNA de diferentes tecidos/condições cdna 5 EST 3 EST Clonar em vetor Bibliotecas

33 Full-Lenght cdna

34 Controle Tratado Northern Eletrônico Extração de RNA e síntese de cdna sequenciamento sequenciamento clusterização Sequência consenso tratado controle = 2x

35 Biblioteca subtrativa RNA Pools Control Treated 1-cDNA synthesis Driver Tester 2-cDNA digestion with 4 cutter enzyme Driver Driver and Tester Tester Adaptors 3-Adaptor ligation to tester sample 4-Tester/ driver hybridization No amplificated Linear Amplification Exponential Amplification 5-PCR with primers that anneal specifically to adaptor previously ligated to tester sample Eliminated Eliminated Enriched Tester 6-Enrichment of cdna library in genes preferentially expressed in tester sample

36 Fluoróforos e molecular beacons Cianinas Emissão fluorescente nm (região do verde do espectro de luz) Emissão fluorescente nm (região do verde do espectro de luz) Emissão fluorescente nm (região do verde do espectro de luz) SYBR GREEN

37 molecular beacons Loop complementar a seqüência alvo

38 PCR Quantidade X Qualidade Análise Qualitativa Visa detectar a presença ou não do gene Análise Quantitativa Visa detectar a quantidade (expressão) do gene na amostra Difícil diferenciar 10 cópias de 50 cópias em gel de agarose

39 Detecção do Real Time PCR Detecção do PCR tradicional

40 SYBR green assay SYBR se liga a DNA dupla fita e fluoresce. Durante o processo de amplificação, a fluorescência vai aumentando, tornando mais fácil a quantificação de DNA

41 Taq Man Sonda anela no gene alvo Polimerase desloca repórter liberação de fluorescência verde Polimerase desloca quencher

42 Desenho de primers real time Junção éxon - íntron TTGTTCGAAGACTGGAAaCAACAGGTCGTCAGGCAGCAT AACGAGTACAGGGCCCGTTATGGTGCACCCAACCTGTCC TGGAGCGATGCTCTGTACCCGGATACTGCTCGATATGCC GGACAGTGCAAGTTCcAACACAGGTATGACACGTCGTTG GTTCGTCGACATGTAAGGGTACTGACGACACATTCAAAG CAACAGTGGCGGCAAGTACGGCGAAAACTTGGCTGCTG GTACTGGAAACGCCTATGGTTTCTCGAGCGGCTTGAAGT CGTGGATGGATGAAGCTTGTATGTCTAC

43

44 Clonagem de genomas DNA genômico Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun) reads clonar em vetor sequenciamento

45 Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos (clusterização) reads Sequência consenso (DNA original) A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos

46 Shotgun de pedaços do genoma DNA genômico Quebrar em pedaços aleatoriamente desde 50Kpb até 300Kpb Clonar em BAC s e sequenciar apenas as pontas de cada fragmento ~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaços de 2000pb clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

47 Primer Walking Vector Clone to sequence Primer Sequence New Primer Sequence Repeat Sempre desenhar o primer de forma que a sequência amplificada tenha sobreposição com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposição)

48

49

50

51 denaturação anelamento dos primers

52

53 TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC O programa PHRED lê o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequência :

54 - A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal - A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do background

55 Analisando o cromatograma Região de qualidade alta Picos bem definidos e grandes. Linha de base boa. Distância entre picos anterior e posterior constante.

56 Região de qualidade média poucas ambigüidades Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio. Linha de base boa a razoável. Distância entre picos anterior e posterior razoável.

57 Região de qualidade baixa baixa confiabilidade Picos mal definidos e de tamanho pequeno. Linha de base confusa. Distância entre picos anterior e posterior inconstante.

58 Pirosequenciamento Roche (454) GS FLX sequencer

59 Fita simples Reação de degradação Câmera de CCD

60 Shotgun do genoma inteiro DNA genômico Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun) Ligação do adaptador e separação em fita simples

61 - O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulos minúsculos (diâmetro de 28 mm). Apenas um DNA é ligado em cada grânulo - Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo que contêm todos os reagentes necessários para amplificar o DNA - Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para evitar contaminação e consegue produzir 10 milhões de cópias numa reação de pirosequenciamento - Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento produz moléculas de ATP gerando mais de 10 9 fótons, num comprimento de onda de 560 nm, e num período de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma câmera de CCD

62

63

64 O sequenciador 454 Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas (1,6 milhões/slide) Câmera de CCD Bombeamento de fluídos Computador

65 Pirograma Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt

66 Illumina/Solexa Genome Analyzer Sequenciamento por síntese + clustering PCR

67 - O adaptador permite que o DNA se ligue a uma placa na superfície dos canais de fluxo - PCR em fase sólida permite que as moléculas resultantes de uma PCR fiquem próximas. Ciclo é repetido várias vezes - Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos, - Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos, marcados por fluoróforos, com o 3 OH inativado adição de um nucleotídeo por vez. Após incorporação, há a detecção do fluoróforo, reverte-se a inativação do 3 OH e e retira-se o fluoróforo. Ciclo se repete.

68

69

70 Applied Biosystems SOLiD TM Sequencer

71 - O adaptador ligado ao DNA e a grânulos magnéticos. Ocorre PCR em emulsão e as fitas de DNA são depositadas numa placa - Ligação de primer universal n ao adaptador e de óligos degenerados (7 bases) marcados contendo duas primeiras bases fixas. - Ocorre detecção do sinal, clivagem das duas últimas bases e adição de novos óligos - Ao fim de n rounds, a fita resultante é liberada e há a ligação de um novo primer universal, (agora n-1). Ciclo se repete mais três vezes (até n-4).

72

73

74

75

76 Sanger vs Novas tecnologias SANGER Depende de clonagem em bactéria (2 semanas de trabalho) 1 milhão de pb em 24 horas Novas tecnologias Não há clonagem Reads de ~700 bp Reads de 200 a 25 pb Clones de fita dupla permitem seqüenciamento em ambas direções (facilita orientação e montagem) 6 meses de sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo Milhões de bp em menos de 4 horas Fragmentos fita simples não permitem seqüenciamento em ambas direções. Aplicação da técnica de paired-end 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo Conclusão : a união faz a força

77 Novas Tecnologias Sequencing chemistry Amplification approach Paired ends/separation 454 Solexa SoliD Pyrosequencing Polymerase-based sequencingby-synthesis Ligation-based sequencing Emulsion PCR Bridge amplification Emulsion PCR Yes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb Mb/run 100 Mb 1300 Mb 3000 Mb Time/run (paired ends) 7 h 4 days 5 days Read length 250 bp bp 35 bp Cost per run (total direct a ) $8439 $8950 $ Cost per Mb $84.39 $5.97 $5.81