TÉCNICAS CITOPATOLÓGICAS

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1 TÉCNICAS CITOPATOLÓGICAS Tracy L. Raber & Leigh Buckner, III INTRODUÇÃO Desde as últimas décadas a citologia vem se tornado amplamente aceita, sendo hoje um componente integral da Patologia. É rotineiramente praticada, mesmo nos pequenos laboratórios, onde o citotecnologista e, ou citopatologista podem contar com o auxílio do laboratório de histologia. Este capítulo pretende ser um guia introdutório de técnicas em citopatologia para histotecnologistas, e outros técnicos, que atuam como auxiliares num laboratório de citologia. Assim, apresentamos uma versão abreviada dos métodos em citologia, não voltada diretamente para os citotecnologistas. A citologia compreende o estudo da estrutura, função, multiplicação, história da vida, e alterações patológicas das células. A citopatologia estuda as alterações celulares na doença, sendo as amostras citológicas examinadas quanto aos detalhes nucleares e citoplasmáticos celulares. As alterações nos padrões celulares auxiliam na separação entre as células normais e anormais. Os preparados citológicos podem, contudo, ser diagnósticos finais ou auxiliar no diagnóstico das doenças. As amostras celulares podem ser coletadas de várias maneiras. A pessoa que manipula os espécimens citológicos deve estar ciente de que o espécimen citológico varia, dependendo do tipo do mesmo e do método de coleta. O material ginecológico (esfregaços de Papanicolaou) e as aspirações por agulha fina são distendidos em lâminas e fixados antes de chegarem no laboratório de citologia. São fixados com fixador de base alcoólica, em spray, ou com etanol a 95%. Os espécimens aquosos, ou com células esparsamente distribuidas, tais como a urina, o fluido cérebroespinhal, e os líquidos das cavidades corporais, devem ser colocados em filtros ou concentrados para se ter uma ótima amostragem celular. A citocentrifugação concentra as células em um sedimento (pellet) a partir do qual esfregaços ou blocos celulares podem ser feitos. A citocentrifugação também pode concentrar as células numa pequena área da lâmina de vidro na preparações cytospin. A rápida fixação e a ótima preservação das células são de grande importância para a interpretação diagnóstica do material. O fixador líquido mais comum, para os espécimens citológicos, é o etanol a 95%. Os materiais fixados em etanol a 95% são corados pela técnica de Papanicolaou modificada. Os espécimens podem também ser fixados a seco (ao ar) e corados pelos métodos Diff- Quik ou de Romanovsky. Se fluidos forem coletados após as horas de funcionamento do laboratório, eles devem ser colocados no refrigerador. Para auxiliar na preservação destes espécimens, etanol a 50% pode ser adicionado. Para evitar-se a formação de coágulo, a heparina deve ser acrescentada nos espécimens hemorrágicos. ROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. 1

2 FIXAÇÃO DOS ESFREGAÇOS Os principais propósitos de um fixador citológico são penetrar rapidamente nas células e a manutenção da integridade morfológica das mesmas. Hoje, o fixador usado mais comum é o etanol a 95%, o qual pode ser substituido por outros álcoois que dão resultados equivalentes, como o metanol a 100%, álcool desnaturado a 95%, isopropanol a 80%, e vários fixadores em spray disponíveis comercialmente. A fixação imediata, enquanto o espécimen ainda está úmido, é essencial para uma ótima preservação, pois mesmo uma mínima dessecação ao ar, de uma amostra, irá alterar os aspectos celulares. O tempo de fixação mínimo é de 15 minutos, porém uma fixação prolongada, de vários dias, não alterará a aparência do esfregaço. Os fixadores em spray consistem de uma base alcoólica e de uma substância cerácea que cobre a lâmina. Uma pequena quantidade de cêra, tal como Carbowax (polietilenoglicol) é acrescentada ao fixador alcoólico para prover uma cobertura protetora e evitar artefato por dessecação ao ar. Este deve ser removido antes da coloração. Dois banhos em etanol a 95%, de 10 a 15 minutos cada, são, usualmente, o suficiente para remover a substância cerácea. O carbowax é acrescentado ao fixador de Saccomanno, de modo que as preparações de Saccomanno também devem passar pelo etanol a 95%, por 10 a 20 minutos, antes do processamento através das colorações. Os espécimens não-fixados, para serem processados mais tarde, podem ter etanol a 50% adicionado à amostra, como preservativo, ou este pode ser usado como um fluido de coleta. Os espécimens deixados para o processamento no dia seguinte devem ser coletados em etanol a 50% e mantidos no refrigerador durante a noite. Concentrações maiores que 50% da solução préfixadora endurecem a amostra e dificultam a realização de esfregaços. A heparina deve ser adicionada às amostras sanguinolentas para prevenir a formação de coágulo. As amostras citológicas fixadas, como é de regra, são coradas pelo método de Papanicolaou. Os blocos celulares são fixados em formalina, e as secções coradas pelo método da hematoxilina e eosina, ou outras colorações especiais, que possam auxiliar no diagnóstico. Algumas preparações citológicas são, por escolha, deixadas secar ao ar e não fixadas. Tais preparações são, a seguir, coradas pelo método de Romanovsky, que contém metanol. A coloração, em si, age como um fixador. 2

3 PREPARO DE LÂMINAS COM AMOSTRAS CITOLÓGICAS As amostras ginecológicas (esfregaços de Papanicolaou), e as obtidas por aspiração com agulha fina, chegam ao laboratório já fixadas e prontas para serem coradas. Outras amostras, algumas das quais coletadas em fluido preservativo, usualmente o etanol a 50%, são preparadas no laboratório. O método de preparação depende do tipo e da quantidade da amostra. As amostras esparsamente celulares podem ser processadas em filtros ou colocadas na lâmina com uma citocentrífuga, a qual concentra as células numa área muito pequena (cytospins). O método de preparação celular preferido, entretanto, é o esfregaço direto da amostra sobre uma lâmina de vidro. As amostras escassas podem ser concentradas por centrifugação e, a seguir, serem feitos os esfregaços nas lâminas. O material de sobra pode fornecer blocos celulares. As secções dos blocos celulares podem ser coradas por técnicas especiais, importantes auxiliares no diagnóstico. BIOSSEGURANÇA: É importante ter ciência de que os espécimens frescos, não-fixados, podem ser infecciosos. Sempre use um jaleco e luvas, e manipule as amostras com cuidado, preferencialmente em uma capela com fluxo laminar. Esfregue, no lado de fora do frasco do espécimen, solução de isopropanol a 70% ou de Clorox a 10% [solução aquosa de hipoclorito de sódio a 10%]. Descontamine todos os equipamentos usados no preparo das amostras, tais como microscópio, centrífuga, misturadores Vortex, esfregando neles álcool ou solução de Clorox. 3

4 FILTROS DE MEMBRANA PRINCÍPIOS As preparações com filtro são usadas no processamento de espécimens esparsamente celulares, e servem como substitutos da citocentrifugação (cytospin). Os fluidos cérebroespinhais, a urina, os lavados brônquicos e os transudatos são espécimens que se encaixam bem neste tipo de processamento. Para se determinar a celularidade de uma amostra executa-se o teste com o azul de toluidina. Para os espécimens esparsamente celulares ou de pequeno volume, os filtros oferecem a potencialidade de se recuperar todas as células. O processamento com filtros é o mesmo para todos os espécimens, devendo as suas diretrizes serem seguidas fielmente, ou as preparações resultantes serão insatisfatórias. Três tipos de filtros (discutidos abaixo) podem ser usados nas preparações citológicas. MATERIAIS E SOLUÇÕES Filtro Suporte do filtro Grampos para filtro Pinças para filtro Seringas descartáveis de 10 mililitros Lâminas de vidro Etanol a 95% Método de coloração de Papanicolaou PROCEDIMENTO Figuras 1 e 2, no final do capítulo de técnicas citopatológicas. 1. Remova o filtro da caixa usando uma pinça e coloque-o no suporte. 2. Expanda o filtro injetando no suporte várias gotas de etanol a 95%. 3. Injete o espécimen dentro do suporte usando uma seringa de 10 mililitros. 4. Adicione 1 mililitro de etanol a 95% usando a seringa de 10 mililitros. 5. Remova o filtro do suporte, utilizando uma pinça, e corte-o para caber na lâmina. (Se utilizar um filtro grande corte-o em duas metades e use duas lâminas). 6. Prenda, com um grampo, cada metade do filtro em uma lâmina, e mergulhe as lâminas em uma jarra de coloração contendo etanol a 95%. 7. Core pelo método de Papanicolaou (veja adiante). 8. Monte em lâminas de vidro, com meio resinoso, mantendo as células voltadas para cima, e tomando o cuidado de não deixar bolhas entre a lâmina, o filtro e a lamínula. OBSERVAÇÕES: Há três tipos de filtro que podem ser usados na preparação de espécimens citológicos, a saber, Millipore, Gelman, e Nucleopore. A principal diferença entre eles é o tipo de material de que são feitos e o tamanho dos seus poros. Todos os três requerem um método de coloração de Papanicolaou modificado. Os filtros Millipore são filtros plásticos, contendo ésteres mistos de celulose, e poros grandes. Tais filtros devem ser expandidos com etanol a 95%, para que não se retraiam, quando expostos aos espécimens citológicos. Durante a coloração, os tempos suficientes nas soluções corantes, associados com os enxágues em etanol, permitem que os corantes sejam absorvidos pelas células e não pelo filtro em si. Precauções especiais devem ser tomadas durante a montagem da lâmina com os filtros Millipore. Eles se tornam transparentes somente quando montados em um meio com índice de refração semelhante ao dos filtros. Um meio de montagem usual é o Permount (Fisher Scientific). Uma quantidade apropriada de meio de montagem deve ser usada, pois o xileno não se mantém nos poros do filtro e, ao evaporar-se após alguns dias, levará à dessecação do filtro, apesar deste estar 4

5 coberto com a lamínula. Entretanto, muito meio de montagem pode dificultar o exame microscópico em grande aumento, a seco. Os filtros Gelman têm propriedades físicas e ópticas semelhantes às dos filtros Millipore, e são feitos de triacetato de celulose, um polímero mais resistente ao etanol. Em comparação com os filtros Millipore, expandem-se menos quando expostos ao etanol. A captura de corante por este filtro é marcantemente reduzida, o que permite as células coradas sobressaírem-se em relação com o fundo da lâmina. Os filtros Gelman têm um índice de refração de 1,47 a 1,48 e, para uma boa imagem microscópica, eles precisam ser montados em um meio com índice de refração igual ou semelhante ao deles. O meio Permount (Fisher Scientific) pode ser usado. Os filtros Nucleopore são feitos de policarbonato, o qual não é afetado pela maioria dos solventes. Por isso, não é necessário pré-expandi-los com etanol a 95%. Eles não se coram e, desse modo, dão um fundo claro à lâmina; entretanto, eles têm dois índices de refração e são birrefringentes, tornando impossível eliminar a imagem dos poros com o meio de montagem. Deve-se também chamar a atenção que se eles forem expostos ao xileno por mais de 15 minutos, eles ficarão ondulados. Isto tornará difícil a montagem com lamínula e o exame ao microscópio. Os filtros Nucleopore, entretanto, podem ser dissolvidos em clorofórmio ou em cloreto de etileno, o que elimina a ondulação e a imagem distorcida dos poros. Contudo, a eliminação do filtro quimicamente pode produzir vários artefatos, que podem causar problemas na avaliação do espécimen. 5

6 TESTE COM O AZUL DE TOLUIDINA PRINCÍPIOS Os espécimens celulares, não-ginecológicos, (i.é., fluidos de cavidades corporais) têm um alto potencial de contaminação cruzada e devem ser corados separadamente (regulação CLIA - 88). Para determinar a celularidade de uma amostra o teste do azul de toluidina deve ser feito. As amostras celulares coradas pelo azul de toluidina mostram claramente se o espécimen contém grande número de células e de grupamentos celulares. Os grupamentos celulares indicam que o fluido é anormal e que deve ser processado separadamente. MATERIAIS E SOLUÇÕES Azul de toluidina (C.I )...0,5 grama. Etanol a 95%...20 mililitros. Água destilada...80 mililitros. Dissolva o azul de toluidina no etanol. Acrescente água destilada até o volume final de 100 mililitros. Filtre antes de usar. PROCEDIMENTO 1. Coloque uma gota de azul de toluidina sobre uma lâmina limpa. 2. Coloque uma gota do fluido da amostra próximo ao corante, e deixe o contato se fazer. 3. Coloque uma pequena lamínula sobre o espécimen. 4. Avalie a celularidade da amostra sob o microscópio. 5. Processe, separadamente, as amostras com elevada celularidade e muitos grupamentos de células. A figura 3, ao final do capítulo de técnicas citopatológicas, ilustra uma amostra com grupamentos de células. 6

7 ESFREGAÇOS DIRETOS PRINCÍPIOS O esfregaço direto da amostra de células sobre a lâmina é o método preferido no processamento citológico. Os espécimens ricos em células são usados diretamente e os espécimens menos celulares são concentrados através de centrifugação. Os escarros, preparados de acordo com o método de Saccomanno, são pré-fixados, misturados por meio de um misturador, e concentrados por centrifugação, antes de serem feitos os esfregaços sobre as lâminas. Os esfregaços diretos são preparados usando-se o método da tração de duas lâminas. Duas gotas da amostra são colocados sobre uma lâmina e, sobre esta, é colocada uma segunda lâmina, sendo as duas gentilmente tracionadas em sentido opostos de modo que, ao final, haverá dois esfregaços. MATERIAIS E SOLUÇÕES Centrífuga Tubos de 50 mililitros para centrífuga Misturador Vortex Pipetas de vidro Etanol a 50% Lâminas de vidro cobertas com poli-l-lisina. PROCEDIMENTO Figuras 4 e 5, ao final do capítulo de técnicas citopatológicas. 1. Concentre o espécime através de centrifugação, se necessário. 2. Decante a maior parte do sobrenadante e redissolva o sedimento misturando-o com o Vortex, por poucos segundos. 3. Transfira, com uma pipeta de vidro, uma pequena quantidade do sedimento para o centro de uma lâmina de vidro, coberta previamente com poli-l-lisina. Coloque uma outra lâmina sobre o sedimento e, gentilmente, movimente as lâminas para frente e para trás, de modo a dispersar as células em uma fina camada. A seguir, separe as lâminas, uma da outra, rapidamente. 4. Imerja as lâminas em etanol a 95% para a coloração pelo método de Papanicolaou, ou deixe-as secar ao ar para serem coradas pelo método Diff-Quik. OBSERVAÇÕES: Os escarros, os fluidos cavitários corporais, e os aspirados por agulha fina são os tipos de espécimens, a partir dos quais, podem ser feitos esfregaços diretos. Faça uma solução de 50 microgramas/mililitro de poli-l-lisina em água desionizada, autoclavada (esta solução pode ser utilizada por até 1 mês, se mantida a 4 o C). Sobre cada lâmina coloque, aproximadamente, 1 mililitro de solução de poli-l-lisina, e distribua uniformemente em cada uma das superfícies. Deixe as lâminas em repouso, à temperatura ambiente, por 30 minutos. Escorra o excesso da solução de poli-l-lisina e enxágue as lâminas, 3 vezes, em água desionizada. Deixe as lâminas secarem (as lâminas secas podem ser armazenadas por 1 semana à temperatura ambiente). 7

8 MÉTODO DE SACCOMANNO PARA O PREPARO DE ESCARRO PRINCÍPIOS A técnica de Saccomanno é um método alternativo para o processamento de escarro. Esta técnica remove os restos celulares (debris) e o material mucóide, que podem esconder as células diagnósticas. MATERIAIS E SOLUÇÕES Misturador pequeno Centrífuga Tubos de 50 mililitros para centrífuga Misturador Vortex Pipetas Lâminas de vidro cobertas com poli-l-lisina (veja acima). Fixador de Saccomanno Etanol a 95% mililitros. Água destilada mililitros. Carbowax (1540) (DuPont)...92 gramas. [N. do T.: Carbowax = poli(glicol etilênico) ou polietilenoglicol] Misture a água destilada e o etanol em um recipiente de 4 litros. Derreta o Carbowax em banho-maria a 37 o C. Adicione o Carbowax derretido à solução no recipiente e agite por 30 segundos. PROCEDIMENTO 1. Adicione o fixador de Saccomanno ao escarro, e despeje num recipiente de 250 mililitros de um misturador semi-micro. O volume total do fixador com o espécimen deve ser em torno de 100 mililitros. (Se o espécimen for escasso acrescente fixador até o volume de 30 mililitros). 2. Misture tudo em baixa velocidade por 2 segundos e em alta velocidade por 5 a 30 segundos. Macroscopicamente os filamentos finos do material não devem ser visíveis. Se forem visíveis, misture novamente por mais 15 a 20 segundos ou até que os filamentos desapareçam. 3. Divida a suspensão entre dois tubos de centrífuga, de modo equilibrado. 4. Centrifugue o espécimen, por 5 minutos, a rotações por minuto (rpm). 5. Decante o sobrenadante até que 2 a 3 mililitros cubram o concentrado celular. 6. Redissolva o concentrado de células por agitação em um misturador Vortex. 7. Aspire com uma pipeta cerca de 1 mililitro da suspensão. Adicione duas gotas sobre uma lâmina previamente coberta com poli-l-lisina. Para os espécimens pouco celulares adicione 3 a 4 gotas ou mais, se necessário. 8. Faça os esfregaços segundo o método de esfregaços diretos. 9. Deixe as lâminas, com a superfície com o material voltada para cima, secar ao ar. 10. Imerja as lâminas, secas ao ar, em etanol a 95%, e deixe por 10 minutos para remover o Carbowax precipitado. NOTA: O esfregaço direto de escarro é feito com o espécimen fresco, enquanto o método de Saccomanno permite que a amostra fique no refrigerador para ser processada no dia seguinte. O fixador de Saccomanno contém Carbowax, o qual deve ser removido antes da coloração. 8

9 REFERÊNCIA GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press,

10 PREPARO DE BLOCO CELULAR PRINCÍPIOS O bloco celular é um procedimento auxiliar na avaliação diagnóstica citológica. Pode ser preparado a partir de fluidos, lavados, escovados, ou aspirados por agulha. A vantagem do bloco celular é a captura de qualquer tecido que possa estar presente no espécimen, permitindo, assim, a observação de alguma arquitetura tecidual. O bloco celular permite também a realização de cortes adicionais, para estudo com colorações especiais, úteis no auxílio diagnóstico de um caso. MATERIAIS E SOLUÇÕES Centrífuga Tubos de 10 mililitros para centrífuga Solução aquosa de gelatina a 2% derretida, dentro de um tubo de ensaio de vidro, mantido em água fervendo. Pipeta de vidro aquecida para transferência da gelatina. Formalina a 10%, neutra, tamponada. Etanol Xileno Parafina PROCEDIMENTO 1. Centrifugue o espécimen até formar o sedimento. 2. Decante o sobrenadante. 3. Acrescente cerca de 0,25 mililitros de solução aquosa de gelatina a 2%, quente, cuidadosamente, e com o auxílio de um bastão ou espátula levante o sedimento de modo que a gelatina flua sob o mesmo. 4. Coloque o tubo de ensaio no gelo para solidificar rapidamente a gelatina. 5. Remova o botão de gelatina com o bastão ou a espátula e coloque-o na formalina. 6. Deixe fixar por pelo menos 1 hora. 7. Processe como um tecido, emblocando em parafina. OBSERVAÇÕES: Alguns espécimens celulares, e.g., fluidos de cavidades corporais, contêm sangue e poderão coagular na ausência de heparina. Assim, o material diagnóstico ficará entremeado na rede de fibrina e não disponível para a avaliação. Entretanto, tais coágulos podem ser envolvidos em papel de filtro, fixados em formalina, e processados como tecido. Nestes casos, não é necessário concentrar a amostra, por meio de centrifugação, e emblocá-la em gelatina. REFERÊNCIA GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press,

11 PREPARAÇÃO DE CITOCENTRIFUGADO (CYTOSPIN) PRINCÍPIOS Para os espécimens paucicelulares ou em pequeno volume, tais como o líquido céfalorraquidiano ou os transudatos, a centrifugação das amostras para uma lâmina de vidro (cytospins), através de uma citocentrífuga, permite a captura de uma concentração maior de células para uma pequena área circular da lâmina. O cytospin elimina a maior parte dos restos proteináceos (debris), deixando um fundo limpo na lâmina. Os fabricantes deste tipo de equipamento fornecem as informações, quanto aos materiais e as soluções necessárias, e de como operar o equipamento. MATERIAIS E SOLUÇÕES Hemacitômetro Centrífuga Cytospin (Shandon Cytospin 2, Shandon Inc., Pittsburgh, PA) Câmaras Cytospin (citofunis para a colocação das amostras) Citoclipes Cytospin (prendedores de aço para lâminas) Filtros-almofadas Cytospin (cartões de filtro) Lâminas de vidro cobertas com poli-l-lisina (veja anteriormente), ou lâmina comuns se a poli- L-lisina não estiver disponível. Fixador Cytospin ou fixador de Saccomanno Etanol a 95% Pipetas PROCEDIMENTO 1. Conte as células do espécimen com o hemacitômetro, no microscópio, ou use uma quantidade aproximada (veja as observações abaixo). 2. Dilua as amostras, ricas em células, até 2 x 10 6 células/mililitro, e concentre as amostras paucicelulares, por meio de centrifugação, até o número de células citado, se possível. 3. Coloque um filtro-almofada (cartão de filtro) entre uma das lâminas (cobertas com poli- L-lisina) e cada uma das câmaras Cytospin (citofunis), mantendo o lado espesso do filtro não-justaposto à lâmina, e o conjunto preso com um citoclipe. O orifício no filtroalmofada (cartão de filtro) deve ficar na porção mais baixa da câmara (citofunil). 4. Coloque as câmaras (citofunis) dentro da centrífuga Cytospin. 5. Coloque algumas gotas de etanol a 95%, no poço da câmara (citofunil), para expandir o filtro. 6. Coloque 3 gotas da amostra (ou mais se a amostra for paucicelular) na porção horizontal do reservatório (citofunil) e, a seguir, várias gotas do fixador Cytospin. 7. Cubra o reservatório (citofunil) de modo que nenhum espécimen se perca. 8. Coloque a tampa sobre o cytospin (cabeçote com 12 posições) e feche a centrífuga. 9. Programe a velocidade (1.500 rpm) e o tempo (2 minutos). 10. Centrifugue. 11. Deixe a centrífuga parar antes de abri-la. OBSERVAÇÕES: Este procedimento é o recomendado para a Shandon Cytospin 2, Shandon Inc., Pittsburgh, PA, e pode ter que ser modificado no uso de outras citocentrífugas. O número de gotas de células, a ser usado, pode também ser determinado colocando-se uma gota da suspensão celular sobre uma lâmina de vidro e coberta com uma lamínula. A lâmina é, então, observada ao microscópio, de modo a se ter uma avaliação aproximada do número de células por campo, com a objetiva de 40x. O número aproximado de células contadas é, então, dividido por 60, cujo resultado inteiro será o número de gotas a ser usado em cada lâmina. Por exemplo, se a contagem celular for 20, o número de gotas será 3. Quando a observação com a objetiva de 10x revelar quase 11

12 nenhuma célula, use 20 gotas. Poucas gotas de saponina podem ser adicionadas, antes de se colocar o fixador Cytospin, se o espécimen for sanguinolento. A saponina lisa as hemácias, pois as mesmas são como um artefato que dificulta a observação das células diagnósticas. Deve-se lembrar que já existem equipamentos disponíveis para o preparo citológico, em monocamadas finas, sobre lâminas de vidro. Tais equipamentos variam desde simples e baratos até os mais complexos e caros. 12

13 PROCEDIMENTOS DE COLORAÇÃO O método de coloração mais comumente usado nos preparados citológicos é o de Papanicolaou. Modificações desta técnica variam de um laboratório para outro. É aconselhável a padronização deste método, de modo que sejam obtidos resultados satisfatórios. As preparações secas ao ar são coradas pelo método de Romanovsky e, usualmente, pelos métodos Diff-Quick ou de Giemsa. O uso de outros métodos de coloração, na rotina do diagnóstico citológico, tem sido limitado. As colorações especiais, rotineiramente utilizadas na maioria dos laboratórios histológicos, são algumas vezes aplicadas. Nós utilizamos como referência, para tais técnicas, o AFIP`s Laboratory Methods in Histotechnology. COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU PRINCÍPIOS O procedimento de coloração de Papanicolaou foi desenvolvido para uma ótima visualização das células cancerosas esfoliadas das superfícies epiteliais do corpo. É uma reação de coloração policromática, consistindo de um corante nuclear de base aquosa e de dois contracorantes citoplasmáticos de base alcoólica, cujo objetivo é mostrar as muitas variações na morfologia celular e os graus de maturidade e de atividade metabólica celular. Este método não é específico para qualquer substância encontrada no câncer. SOLUÇÕES Hematoxilina Água destilada mililitros. Etileno glicol mililitros. Hematoxilina de Gill II (Lerner, Pittsburgh, PA)...2 gramas. Iodato de sódio...0,2 grama. Sulfato de alumínio...17,6 gramas. Ácido acético glacial...20 mililitros. [N. do T.: A hematoxilina de Gill II pode ser substituida pela hematoxilina, cristais (C.I.: 75290)] Misture os ingredientes, na sequência, utilizando uma barra magnética, por 1 hora à temperatura ambiente. O corante pode ser usado imediatamente, porém filtre antes de cada uso. A hematoxilina empregada nesta fórmula é a anidra. Se for utilizada a forma da hematoxilina em cristais, use 2,36 gramas. Um grama de ácido cítrico pode ser substituido por 20 mililitros de ácido acético glacial. Banho de ácido clorídrico (usado somente para os filtros) Água destilada mililitros. Ácido clorídrico, concentrado...2 mililitros. (Prepare fresco em cada dia) 13

14 Hidróxido de amônio (banho azulador) Água destilada mililitros. NH 4 OH, concentrado...1 mililitro. (Prepare fresco em cada dia) Corante Orange G Solução-estoque: Orange G a 10% Orange G (Lerner) (C.I.16230)...10 gramas. Água destilada...até completar 100 mililitros. (Quando estiver preparando a solução-estoque leve em consideração a pureza do corante. Exemplo: Se a pureza for de 80%, use 12,5 gramas). Solução de trabalho: Corante Eosina-65 Solução estoque...20 mililitros. Ácido fosfotúngstico...0,15 grama. Etanol a 95% mililitros. Soluções-estoque: Eosina Y a 20% Eosina Y, aquosa (Lerner) (C.I )...20 gramas. Água destilada, 70 o a 80 o C...até completar 100 mililitros. Verde Claro (Light-Green SF) a 3% Light-Green SF (Lerner) (C.I )...3 gramas. Água destilada, 70 o a 80 o C...até completar 100 mililitros. As soluções podem ser usadas imediatamente, porém filtre-as antes de cada uso. Leve em consideração a concentração (pureza) do corante, quando for preparar as soluções-estoques. Solução de trabalho: EA-65 Solução-estoque de eosina Y...20 mililitros. Solução-estoque de Light-Green SF...10 mililitros. Ácido fosfotúngstico...2 gramas. Etanol a 95% mililitros. Metanol absoluto mililitros. Ácido acético glacial...20 mililitros. 14

15 Etanol: 95%, 100% Xileno (xilol) Meio de montagem PROCEDIMENTO 1. Etanol a 95%...10 gotas (veja as notas abaixo). 2. Etanol a 95%...10 gotas. 3. Água destilada/desionizada...10 gotas (veja as notas abaixo). 4. Água destilada/desionizada...10 gotas. 5. Hematoxilina...3 minutos. 6. Água destilada/desionizada...20 gotas. 7. Banho azulador...20 gotas. 8. Água destilada/desionizada...20 gotas. 9. Etanol a 95%...10 gotas. 10. Etanol a 95%...10 gotas. 11. Orange G, solução de trabalho...1 minuto. 12. Etanol a 95%...10 gotas. 13. Etanol a 95%...10 gotas. 14. Etanol a 95%...10 gotas. 15. Eosina-EA65, solução de trabalho...5 minutos. 16. Etanol a 95%...10 gotas. 17. Etanol a 95%...10 gotas. 18. Etanol a 95%...10 gotas. 19. Etanol a 100%...10 gotas. 20. Etanol a 100%...10 gotas. 21. Etanol a 100%...10 gotas. 22. Xileno...10 gotas. 23. Xileno...10 gotas. 24. Monte em meio resinoso. 15

16 MÉTODO DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU PARA FILTROS 1. Etanol a 95%...10 gotas. 2. Água destilada/desionizada...10 gotas. 3. Água destilada/desionizada...10 gotas. 4. Hematoxilina...2 minutos. 5. Água corrente de torneira...20 gotas. 6. Banho ácido, 1 gota/segundo por...1 minuto. (ou até que os filtros fiquem amarelo-pálidos) 7. Água destilada/desionizada...20 gotas. 8. Banho azulador...2 minutos. 9. Etanol a 95%...10 gotas. 10. Etanol a 95%...10 gotas. 11. Orange G, solução de trabalho...10 segundos. (não goteje nos filtros a partir deste ponto, deixe-os nas soluções) 12. Etanol a 95%...1 minuto. 13. Etanol a 95%...1 minuto. 14. Etanol a 95%...1 minuto. 15. Eosina-EA 65, solução de trabalho...8 minutos. 16. Etanol a 95%...4 minutos. 17. Etanol a 95%...2 minutos. 18. Etanol a 95%...1 minuto. 19. Etanol a 100%...1 minuto. 20. Etanol a 100%...1 minuto. 21. Etanol a 100%...1 minuto. 22. Xileno...1 minuto. 23. Xileno...1 minuto. 24. Monte em lâmina de vidro com meio resinoso. RESULTADOS NOTAS: Veja as figuras 7 a 10, ao final do capítulo de técnicas citopatológicas. Quando estiver seguindo o procedimento de Papanicolaou, observe que todos os esfregaços que tenham sido fixados com spray e todas as preparações de Saccomanno devem permanecer no 16

17 etanol a 95%, por pelo menos 10 minutos, antes de se proceder a coloração. Pode-se usar água destilada ou desionizada. Durante a coloração, um número substancial de células se solta das lâminas ou dos filtros. Não é incomum que tais células flutuantes se fixem em outro espécimen. Para evitar a ocorrência de contaminação cruzada, certas regras devem ser seguidas: Todas as soluções devem ser filtradas diariamente. Os casos menos propensos a soltar células devem ser corados primeiro, e aqueles que mais facilmente soltam células devem ser corados por último. A ordem de coloração das amostras nãoginecológicas deve ser a seguinte: (1 o ) fluidos espinhais; (2 o ) esfregaços e citocentrifugados (cytospins); e (3 o ) todos os filtros. Deve-se ter em mente, entretanto, que o problema do desprendimento de células não pode ser totalmente eliminado. Algumas ocorrências que precedem a aplicação do meio de montagem na lâmina podem influenciar os resultados. Tais ocorrências incluem a espessura do esfregaço celular e a presença de água no etanol absoluto e no xileno. Para os esfregaços celulares espessos, ou para os filtros, uma quantidade maior de meio de montagem deve ser utilizada. Áreas densas, como borrões, das preparações, cobertas pelo meio de montagem, favorecem a produção de bolhas de ar e o aparecimento de focos secos pelo ar, causando o artefato conhecido com flocos de milho (Figura 11). Se isto ocorrer, retire a lamínula imergindo a lâmina no xileno, e, a seguir, recoloque a lamínula. Outro problema é a transferência de água para o etanol absoluto e deste para o xileno, tornando-os enevoados, esbranquiçados. O resultado será a má-desidratação e imagens pouco nítidas (Figura 12). Se água for notada no xileno, IMEDIATAMENTE, troque o xileno, assim como o etanol absoluto. Acima de tudo, um preparado citológico satisfatório depende não somente da coloração, mas também da coleta do espécimen, da sua preparação, e da sua fixação. Uma coloração perfeita não melhorará as amostras paucicelulares, ou as amostras mal-fixadas com células degeneradas, ou as amostras cujas células ficam obscurecidas por lagos de leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos). Tais preparações podem ser consideradas insatisfatórias. REFERÊNCIAS GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.-armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology,

18 CONTROLE DE QUALIDADE DO MÉTODO DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU A apreciação técnica das lâminas coradas é feita para se determinar a ótima qualidade da coloração na avaliação citológica. Um registro diário da qualidade dos métodos de coloração celular deve ser mantido. Neste registro deve-se incluir a data e as observações quanto a qualidade da coloração ser ou não-aceitável. As ações corretivas devem ser documentadas quando as colorações estiverem não-aceitáveis. As ótimas colorações dependem da quantidade, da qualidade, e da tonalidade verdadeira dos corantes. A hematoxilina, um corante nuclear, deve ser avermelhada, azul, azul-escura, ou púrpuraescura. Uma cor castanha significa excessiva oxidação da hematoxilina o que, geralmente, dá resultados de coloração insatisfatórios. A hematoxilina não deve bloquear a captura ou adulterar a cor dos contracorantes aplicados subsequentemente. Para a avaliação da qualidade da coloração nuclear, o núcleo das células intermediárias deve ser observado. A cromatina dos mesmos deve ser granular, nítida, distinta, e de cor púrpura-clara. O núcleo dos neutrófilos deve também ser utilizado para a avaliação da qualidade tintorial nuclear. Eles devem corar-se intensamente em azul-escuro a púrpuraescuro e ter a cromatina com imagem bem nítida e distinta. Os contracorantes Orange G e a Eosina-EA65 podem dar cores vívidas, transparência citoplasmática e contracoloração diferenciada. Nas células preservadas de modo ideal, várias cores citoplasmáticas diferentes são identificadas. A eosina Y dá a cor rósea-avermelhada às células escamosas maduras e cora o nucléolo em vermelho; o Verde Claro (Light-Green SF) cora em verdeazulado as células metabolicamente ativas; e o Orange G cora em laranja ou amarelo o citoplasma queratinizado. Fragmentos espessos de tecido ou células acumuladas em múltiplas camadas, algumas vezes apresentam uma penetração irregular do corante, resultando em cores que não são normalmente esperadas. Sempre que for possível, camadas mais finas de células são o desejável. Deve-se ter cuidado na avaliação da morfologia das células, evitando-se a apreciação superficial da coloração que, eventualmente, pode levar a uma avaliação diagnóstica errônea. 18

19 DESCOLORAÇÃO DE LÂMINAS PRINCÍPIOS Ocasionalmente pode ser necessário descorar uma lâmina de citologia, seja para recolorir pelo método de Papanicolaou, seja para requerer uma coloração especial, que pode auxiliar no diagnóstico. MATERIAIS E SOLUÇÕES Jarras de coloração Xileno Etanol a 100% Álcool-ácido (HCl a 1% em etanol a 70%) Banho azulador Etanol a 95% PROCEDIMENTO 1. Coloque a lâmina na jarra de coloração contendo xileno e deixe a lamínula se destacar espontaneamente; não a puxe. As lâminas que estão montadas há muito tempo podem necessitar de vários dias para que a lamínula se solte. 2. Remova todos os traços do meio de montagem mergulhando a lâmina em xileno, fazendo 2 trocas de 1 minuto cada. 3. Coloque a lâmina em etanol a 100%, fazendo 2 trocas de 1 minuto cada. 4. Coloque a lâmina no álcool-ácido até que a descoloração se complete. O tempo variará nesta etapa. 5. Mergulhe a lâmina no banho azulador de deixe por 3 ou 4 minutos. 6. Enxágue em água de torneira, fazendo 2 trocas. 7. Coloque a lâmina na jarra de coloração contendo etanol a 95%. A lâmina está agora pronta para ser recolorida pelo método de Papanicolaou ou por uma coloração especial. 19

20 MÉTODO DO CORANTE DIFF-QUIK PRINCÍPIOS Este corante é comprado comercialmente e é um corante de Wright-Giemsa modificado. Foi originalmente idealizado para ser um método de coloração rápido para os esfregaços sanguíneos, porém também tem sido um corante de grande valor na avaliação de material citológico seco ao ar. SOLUÇÕES Fixador de Diff-Quik Solução I de Diff-Quik Solução II de Diff-Quik PROCEDIMENTO 1. Fixador de Diff-Quik...5 gotas. 2. Solução I de Diff-Quik...8 a 10 gotas. 3. Solução II de Diff-Quik...8 a 10 gotas. 4. Água corrente de torneira...8 a 10 gotas. 5. Seque ao ar a lâmina corada. 6. Xileno...5 gotas. 7. Montar em meio resinoso. Recolorir as lâminas coradas pelo método Diff-Quik pode ser feito com bons resultados, se necessário. PROCEDIMENTO DE RECOLORAÇÃO 1. Coloque a lâmina no xileno e gentilmente remova a lamínula, enquanto a mesma vai soltando. 2. Imerja a lâmina em xileno limpo para remover todo o meio de montagem. 3. Seque completamente a lâmina ao ar. 4. Coloque a lâmina no fixador de Diff-Quik e deixe por 45 minutos. 5. Recolore com as soluções I e II acima especificadas. RESULTADOS Veja a Figura 13, ao final do capítulo de técnica citopatológica. OBSERVAÇÃO Filtre a solução II diariamente ou antes de cada uso. Complete ou troque os corantes frequentemente. As lâminas coradas no Diff-Quik NUNCA devem ser colocadas numa superfície quente para secar lâminas. As lâminas coradas pelo Diff-Quik podem ser recoradas se o espécimen ficar hipercorado ou pouco corado. REFERÊNCIA GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press,

21 MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GIEMSA PRINCÍPIO Este método é uma coloração do tipo-romanovsky em uma etapa, que requer fixação, com o metanol, de esfregaços citológicos secos ao ar. SOLUÇÃO Tampão fosfato 1/15M, ph 6,8 Solução A: Na 2HPO 4.2H 2 O...5,93 gramas. Água destilada até o volume de mililitros. Solução B: KH 2 PO 4...4,53 gramas. Água destilada até o volume de mililitros. Solução tampão de trabalho, ph 6,8 Solução A...50 mililitros. Solução B...50 mililitros. Água destilada mililitros. Ajuste o ph para 6,8 com a solução A ou B. Corante de Giemsa Giemsa (Merck)...10 mililitros. Solução tampão de trabalho...90 mililitros. Metanol Xileno Meio de montagem PROCEDIMENTO 1. Fixe as lâmina em metanol por 15 minutos. 2. Enxágue na solução de trabalho de tampão, ph 6,8. 3. Core no corante de Giemsa por 20 minutos. 4. Enxágue em água corrente de torneira até que a água fique clara. 5. Deixe secar ao ar. 6. Clarifique no xileno por 5 minutos. 7. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Veja a Figura 14, ao final do capítulo de técnica citopatológica. OBSERVAÇÕES Dependendo do tipo de espécimen, diferentes tempos de coloração são aplicados. A maioria dos tipos celulares é corada em 20 minutos, porém os fluidos cérebroespinhais levam apenas 5 minutos. Os esfregaços devem estar bem secos ao ar, antes de serem fixados em metanol, pois a fixação com o metanol de esfregações incompletamente secos gera artefatos azuis no núcleo, que podem mimetizar nucléolo aumentado. 21

22 REFERÊNCIA LOPES CARDOZO, P.- Atlas of Clinical Cytology. Netherlands, Publisher Targa, Hertogenbosch, REFERÊNCIAS ADICIONAIS SELECIONADAS BALES, C.E. & DURFEE, G.R.- Cytologic Techniques. In: KOSS, L.G.- Diagnostic Cytology and its Histopathologic Basis. 4 th ed., Philadelphia, Pa, JB Lippincott Company, pp KEEBLER, C.M.- Cytopreparatory Tecniques. In: BIBBO, M. ed.- Comprehensive Cytopathology. Philadelphia, Pa, W.B. Saunders, pp AGRADECIMENTOS: Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James Ownbey pela tomada das fotografias para as ilustrações. 22

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