AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE POLPAS DE FRUTAS

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DA EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL CAMPUS BENTO GONÇALVES KELIMAR LEVIS DE PARIZ AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE POLPAS DE FRUTAS Bento Gonçalves 2011

2 2 KELIMAR LEVIS DE PARIZ AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE POLPAS DE FRUTAS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso Superior de Tecnologia em Alimentos do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Campus Bento Gonçalves como parte dos requisitos para a conclusão do curso. Orientadora: Profª Dra. Luciana Pereira Bernd Bento Gonçalves 2011

3 3 KELIMAR LEVIS DE PARIZ AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE POLPAS DE FRUTAS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso Superior de Tecnologia em Alimentos do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Campus Bento Gonçalves como parte dos requisitos para a conclusão do curso. COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra. Andressa Comiotto Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul, IFRS Profa. Dra. Lucia de Moraes Batista Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul, IFRS Profa. Dra. Luciana Pereira Bernd Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul, IFRS Bento Gonçalves, 2011.

4 4 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, pois sem ele nada é possível, até para aqueles que não acreditam em sua existência. Á minha orientadora Prof. Dr. Luciana Pereira Bernd, pela incomparável orientação, colaboração, confiança, paciência, compreensão e amizade. Agradeço a ela também, por dispor de seu tempo para me orientar, nesta fase da vida tão importante que está vivendo. Ao IFRS-BG e a toda a equipe do laboratório que me ajudou e me apoio para chegar onde cheguei e pela oportunidade de realizar minhas análises. Agradeço ao meu namorado Rudi, pela paciência, compreensão, companheirismo e pelo amor incondicional que amenizou as dificuldades encontradas para a conclusão deste trabalho. Agradeço a minha mãe, que me deu suporte e incentivo nessa etapa da minha vida, torcendo e acreditando sempre em mim. A toda minha família que torceu e acreditou em mim, principalmente minha madrinha Ilda e a minha avó Maria. Á todos os professores que compartilharam seu tempo e conhecimento comigo, ampliando minha visão acadêmica. Aos meus amigos que apoiaram nos momentos de dificuldades e dúvidas, me ajudando a buscar sempre o melhor caminho para a resolução dos problemas. À Borsato Industrial, onde realizei meu estágio e colocando em prática o que foi visto na teoria em sala de aula, em especial a Eliane e a Celi. Agradeço a empresa Merse, por ter me doado o material para realizar minhas análises. Á todos que, de certa forma contribuíram de alguma maneira para minha formação.

5 5 RESUMO As frutas, por serem perecíveis, deterioram-se em poucos dias, tendo sua comercialização dificultada a grandes distâncias. A fim de solucionar este problema, as partes comestíveis de frutas in natura podem ser processadas com a subsequente obtenção de polpa de fruta. Entre os parâmetros mais importantes que determinam a qualidade de um alimento, estão aqueles que definem as suas características microbiológicas, o que permite avaliá-lo quanto às condições de processamento, armazenamento, distribuição para consumo, vida útil e riscos à saúde da população. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica (bolores/ leveduras e aeróbios mesófilos) de amostras de polpas de frutas e compará-los aos resultados de laudos técnicos e aos padrões da legislação brasileira vigente. Para tal, foi determinada a contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e bolores e leveduras de 15 amostras de polpas de diferentes frutas e marcas (A, B e C) utilizadas pela empresa Borsato Industrial na produção de preparados para iogurte e caldas de sorvete. Das 15 polpas analisadas, 60 % apresentaram contagem de bolores e leveduras acima do padrão microbiológico segundo a IN n 1 de 07 de janeiro de 2000 da ANVISA, representando uma possível contaminação por micotoxinas. A legislação brasileira não define limites específicos para a contagem total de aeróbios mesófilos de polpas de frutas, porém 60 % das polpas analisadas apresentaram baixa contagem deste grupo de micro-organismos (de <1 a 5,0 x 10 1 UFC.g -1 ). Falhas no processamento e/ou nas boas práticas de fabricação possivelmente explicam a alta contagem de mesófilos aeróbios nas polpas de maçã da marca B (1,3x10 3 UFC.g- 1 ); nas polpas de mamão (7,5x10 2 UFC.g -1 ), morango sem sementes (6,9 x 10² UFC.g -1 ), banana (4,0x10 2 UFC.g -1 ) e abacaxi (1,2x10 2 UFC.g -1 ) da marca A; e na polpa de laranja da marca C (2,2 x 10 3 UFC.g -1 ), resultando em matérias-primas de qualidade inferior. As análises dos laudos técnicos das polpas, emitidos pelo responsável técnico de cada fornecedor, foram realizados a partir de uma média do lote, resultando diferenças com os resultados das análises realizadas no presente estudo. A legislação brasileira deveria incluir mais parâmetros microbiológicos para definir a qualidade de polpas de fruta, estabelecendo seus limites e determinando a referida legislação a ser cumprida pelas empresas fornecedoras/ processadoras de polpas. Palavras-chave: polpas, micro-organismos e legislação.

6 6 ABSTRACT Fruits are perishable and deteriorate in a few days, having a difficult commercialization over long distances. In order to solve this obstacle, the edible parts of fruits "in natura" can be processed with the subsequent production of fruit pulp. Among the most important parameters that determine the quality of foods are those that define their microbiological characteristics, allowing evaluating it conditions of processing, storage, distribution to consumption, shelf life and risks to the health population. Thus, the objective of this study was to evaluate the microbiological quality (mold/yeast and aerobic mesophilic) of samples of fruit pulp and compare them to the results of technical reports and standards of the Brazilian legislation. Was determined the total aerobic mesophilic bacteria and mold/yeasts count of 15 samples of pulps of different fruits and brands (A, B and C) used by Borsato Industrial. Of the 15 pulps analyzed, 60 % had mold and yeast counts above the standard microbiological according IN n 1 of January, 2000 (ANVISA), representing a possible contamination by mycotoxins. Brazilian legislation does not set specific limits for the total aerobic mesophilic count in fruits pulps, but 60 % of the pulps analyzed showed low counts of these micro-organisms (from <1 to 5.0 x 10 1 CFU.g -1 ). Failures in pulp processing and in good manufacturing practices possibly explain the high aerobic mesophilic count in apple pulp of brand B (1.3 x 10 3 CFU.g - 1 ); in papaya pulp (7.5 x 10 2 CFU.g -1 ), strawberry seedless pulp (6.9 x 10² CFU.g -1 ), banana pulp (4.0x10 2 CFU.g -1 ) and pineapple pulp (1.2 x 10 2 CFU.g -1 ) of brand A, and in orange pulp of brand C (2.2 x 10 3 CFU.g -1 ), resulting in raw materials of inferior quality. Analysis of the technical reports of pulp, issued by each supplier, were made from an average of the lot, resulting in differences with the results of analysis of this study. Brazilian legislation should include more parameters to define the microbiological quality of fruit pulp, establishing limits and determining the legislation to be fulfilled by suppliers and pulp processing. Keywords: pulps, micro-organisms, legislation.

7 7 LISTA DE ABREVIATURAS AC Contagem de Aeróbios ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AOAC Association of Official Analytical Chemists BDA Ágar Batata Dextroxe BPF Boas Práticas de Fabricação g gramas IBRAF Instituto Brasileiro de Frutas IFRS-BG Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Rio Grande do Sul - campus Bento Gonçalves IN Instrução Normativa MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento PCA Ágar Contagem Padrão ph Potencial Hidrogeniônico UFC Unidade Formadora de Colônias º Brix Grau Brix ºC graus Celsius

8 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Fluxograma de produção da polpa de fruta Figura 2: Procedimento de inoculação e contagem de colônias em placas 3M Petrifilm.. 27 Figura 3: Contagem Total de Aeróbios na placa 3M Petrifilm Figura 4: Amostras coletadas em embalagens estéreis Figura 5: Esquema geral do preparo de diluições seriadas Figura 6: Inoculação das diluições seriadas em placas de petri contendo meio de cultura BDA Figura 7: Inoculação na placa de Petriflm Figura 8: Contagem de bolores e leveduras da polpa de morango sem sementes, marca A, diluição Figura 9: Contagem de bolores/leveduras nas polpas de abacaxi, manga, mamão e maracujá na diluição Figura 10: Contagem de bactérias aeróbias mesófilas nas polpas de morango sem sementes, banana, abacaxi e mamão nas diluições 10-1, 10-2, 10-1, 10-1, respectivamente Figura 11: Contagem de aeróbios mesófilos ((UFC.g -1 ) e métodos de conservação de cada polpa de fruta

9 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Processo de conservação das polpas e contagem de Bolores/Leveduras e Aeróbios mesófilos (UFC.g - 1) apresentados nos laudos técnicos...30 Tabela 2: Quantificação de bolores e leveduras nas polpas de frutas em comparação aos laudos técnicos Tabela 3: Quantificação de bactérias aeróbias mesófilas nas polpas de frutas em comparação aos laudos técnicos

10 10 SUMÁRIO RESUMO... 5 ABSTRACT... 6 LISTA DE ABREVIATURAS... 7 LISTA DE FIGURAS... 8 LISTA DE TABELAS INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA FRUTAS PROCESSAMENTO DE POLPA DE FRUTAS Transporte Recepção na Indústria Lavagem Seleção Preparo Despolpamento Refino Tanque de Equilíbrio Desaeração Tratamento Térmico Envase e Conservação Armazenamento CONTROLE DE QUALIDADE CRITÉRIOS MICROBIOLÓGICOS PARA A AVALIAÇÃO DA QUALIDADE QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE POLPAS DE FRUTAS Padrões Microbiológicos Exigidos pela Legislação MICRO-ORGANISMOS INDICADORES Micro-organismos Aeróbios Mesófilos Contagem Total de Micro-organismos Aeróbios Bolores e Leveduras Contagem de Bolores e Leveduras CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS EM PLACAS... 25

11 Plaqueamento em Superfície MÉTODO DE CONTAGEM EM PETRIFLM TM Contagem Total de Aeróbios por Placa 3M Petriflm TM MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRAS DE POLPA DE FRUTAS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS Preparo de Diluições Seriadas Análise de Bolores e Leveduras Análise de Aeróbios Mesófilos RESULTADOS E DISCUSSÕES CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS CONTAGEM DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 45

12 12 1 INTRODUÇÃO A comercialização de produtos derivados de frutas tem crescido em todo o mundo, sendo que a demanda apresenta tendência de crescimento devido às suas características organolépticas e vantagens à saúde. A alta perecibilidade dos frutos é responsável por perdas significativas, o que tem impulsionado o desenvolvimento de processos tecnológicos. A polpa de fruta tem grande importância como matéria-prima, podendo ser produzida nas épocas de safra, armazenadas e processadas nos períodos mais propícios ou segundo a demanda do mercado consumidor, como doces em massa, geléias, gelados comestíveis, néctares entre outros (BUENO et al., 2002). As polpas de frutas apresentam como características gerais: elevada atividade de água, potencial de óxido-redução positivo e baixo potencial hidrogeniônico (ph). Destes fatores, a elevada acidez restringe a microbiota deterioradora, que se limita principalmente a bolores e leveduras; sendo principalmente estes os mais importantes agentes de deterioração de polpas e sucos de frutas (FAZIO, 2006). A legislação brasileira vigente que fixa limites para bolores e leveduras em polpa de frutas é a Instrução Normativa nº1, de 07 de janeiro de 2000 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), porém, a Resolução RDC nº 12, de 02/01/2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) que apresenta o Regulamento Técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos, não menciona a contagem de bolores e leveduras em polpa de frutas. No entanto, a contagem de aeróbios mesófilos em polpas de frutas é desconsiderada pela legislação brasileira. A preocupação com a qualidade e segurança dos alimentos é uma questão mundial de saúde pública, pelo fato de podermos ingerir algum tipo de alimento contaminado por microorganismos patogênico, toxinas ou micotoxinas. Desta forma, o trabalho teve como objetivo, avaliar a qualidade microbiológicas (bolores e leveduras e aeróbios mesófilos) de diferentes amostras de polpa de frutas e comparar os resultados com os laudos técnicos e com a legislação brasileira vigente.

13 13 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 FRUTAS O Brasil deve fechar o ano com uma produção de frutas recorde, passando de 42,6 milhões de toneladas registradas em 2010, para mais de 44 milhões de toneladas no ano de 2011, de acordo com o Instituto Brasileiro de Frutas (IBRAF, 2011). As frutas têm grande importância na nutrição humana devido ao grande conteúdo de vitaminas e sais minerais. Porém são importantes micro habitats para uma grande variedade de micro-organismos, devido sua natureza apresentar alta concentração de açúcares simples, baixo ph, alta atividade de água e intensa visitação por insetos (FAZIO, 2006). Por serem perecíveis, grande parte dessas frutas sofrem rápida deterioração, tendo sua comercialização dificultada, especialmente a longas distâncias (SANTOS et al., 2008). Aliado a isto, a produção de alimentos é sazonal, principalmente a de origem vegetal, evidenciando a necessidade do desenvolvimento de métodos essenciais que prolonguem o período de armazenamento destes alimentos (FERNANDES et al., 2009). A alta perecibilidade dos frutos e sua sazonalidade impulsionam o desenvolvimento de processos tecnológicos, dentre os quais pode-se destacar a produção de polpas, que é uma atividade agroindustrial importante na medida em que agrega valor econômico à fruta, evitando desperdícios e minimizando as perdas que podem ocorrer durante a comercialização do produto in natura, além de permitir estender sua vida útil com manutenção da qualidade (EVANGELISTA & VIEITES, 2006). 2.2 POLPAS DE FRUTAS O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) define polpa de fruta, através do Regulamento Técnico Geral para Fixação dos Padrões de Identidade e Qualidade para Polpa de Fruta, como o produto não fermentado, não concentrado, não diluído, obtido de frutos polposos, por meio de processos tecnológico adequado, com teor mínimo de sólidos totais, proveniente da parte comestível do fruto (BRASIL, 2000). Ainda de acordo com o mesmo regulamento, a polpa de fruta deve ser obtida de frutas frescas, sãs e maduras, com características físicas, químicas e organolépticas do fruto. Não deverá conter terra, sujidade, parasitas, fragmentos de insetos e pedaços das partes não

14 14 comestíveis da fruta e da planta, assim como não deverá ter suas características físicas, químicas e organolépticas alteradas por equipamentos, recipientes e embalagens utilizados durante o seu processamento e comercialização. 2.3 PROCESSAMENTO DE POLPA DE FRUTAS A polpa de fruta é um produto processado que, via-de-regra, visa substituir a fruta in natura, sendo que a sua produção se tornou um meio favorável para o aproveitamento integral das frutas na época da safra, evitando os problemas ligados à sazonalidade. Da matéria-prima, altamente perecível, obtém-se um produto armazenável. Desta forma, a agroindustrialização é uma alternativa para melhor aproveitamento da matéria-prima, além de representar uma oportunidade para os fruticultores obterem melhores ganhos financeiros (MARTINS, 2006 apud SERAFIN, 2009). Em geral, o produto obtido é utilizado como matéria-prima por outras indústrias, na fabricação de iogurtes, sorvetes, refrescos, doces e etc. Pode também ser processado durante a safra, visando a sua utilização posterior para obtenção de doce em massa, geléias e néctar. Esse produto não exige uma seleção e classificação das frutas tão rigorosa quanto à necessária para produzir fruta ou doce de fruta em calda, em especial nos quesitos aspecto e uniformidade, uma vez que a matéria-prima será triturada ou desintegrada e, depois, despolpada. Depois de pasteurizada, a polpa pode ser preservada por tratamento térmico adicional, enlatamento asséptico, congelamento ou adição de aditivos químicos (MORAES, 2006). Na Figura 1, pode-se observar o fluxograma da produção de polpa de fruta.

15 15 Colheita Transporte Recepção Lavagem Seleção Preparo Despolpamento Refino Tanque de Equilíbrio Desaeração Pasteurização Envase Esterilização comercial Envase Congelamento Armazenamento Congelamento Armazenamento Figura 1. Fluxograma de produção da polpa de fruta. Envase Asséptico Armazenamento Colheita A operação de colheita está condicionada às peculiaridades de cada fruta, à variedade de cultivar disponível e características desejáveis no produto. O estágio de maturação é a principal característica a ser observada. Portanto, para se obter as características desejáveis da matéria-prima para o processamento, devem ser observados os seguintes atributos: maturação fisiológica (observar se o fruto é ou não climatério), ph, Grau Brix (º Brix) e acidez titulável. Estas informações devem ser obtidas quando o fruto ainda está no campo de produção para promover uma colheita seletiva de frutas (INTEC, 2005).

16 Transporte A forma como a fruta é levada até a indústria influencia muito na preservação da sua qualidade, além disso, fatores como tempo e temperatura devem ser controlados. O transporte deve ser feito no menor prazo possível e em horários mais frescos (à noite ou pela manhã). Os caminhões devem ser bem ventilados e devem ser utilizadas caixas plásticas, pois, as caixas de madeira aceleram a deterioração das frutas durante o transporte e devem ser evitadas. O transporte e manuseio da matéria-prima devem ser feitos de maneira a não permitir choques mecânicos, elevação da temperatura e acúmulo de metabólitos. O empilhamento não deve causar danos às frutas que se encontram nas camadas inferiores, principalmente àquelas mais maduras (INTEC, 2005) Recepção na Indústria Ao chegarem à indústria, as frutas devem ser pesadas para se ter conhecimento do volume real de frutas processadas, reduzindo-se o peso das descartadas após seleção (RAMOS et al., 2006). Logo depois, as frutas passam por uma pré-seleção, onde se separam as estragadas e aquelas em estágio de maturação avançado daquelas com maturação apropriada. Nesta etapa, para verificar a qualidade do suprimento da indústria, retira-se uma amostra representativa da carga para proceder-se às análises iniciais de ºBrix, acidez titulável, ph e uma avaliação sensorial por técnicos treinado para este fim. As caixas plásticas devem passar por um processo de higienização para limpeza e remoção de sujidades (INTEC, 2005) Lavagem Como a matéria-prima tende a chegar à indústria com uma carga de micro-organismos, sujidades, e principalmente terra adquiridos durante a colheita e transporte, é necessário que se tenha um controle de eliminação dos mesmos. A lavagem tem como objetivo reduzir o número de micro-organismos iniciais a um mínimo aceitável, e ainda permitir melhor visualização das frutas durante a seleção. Esta operação é considerada uma das mais importantes no processamento (INTEC, 2005), podendo ser realizada em duas fases: 1. Banho por imersão, onde as frutas são submetidas à imersão em água com elevadas concentrações de cloro por determinado tempo. Para as que são colhidas ao invés de apanhadas do chão e que apresentem incrustações leves em sua superfície, se empregam baixas concentrações de cloro na água de limpeza, por um tempo reduzido. Em contra partida,

17 17 para aquelas em condições de recepção muito ruins costuma-se utilizar máximas concentrações de cloro por tempos maiores. 2. Aspersão, a qual tem como objetivo a remoção das impurezas remanescentes além da retirada do excesso de cloro. Esta deve ser realizada com água tratada em quantidades ideais, retirando o excesso de cloro da lavagem anterior sem desperdícios de água (FAZIO, 2006) Seleção É feita após a operação de lavagem, é uma etapa muito importante, pois é a responsável pela classificação final da fruta que será processada. Nesta fase, as frutas são expostas sobre mesas ou esteiras apropriadas onde são avaliadas quanto à maturação, firmeza, machucaduras, defeitos causados por fungos, roedores e insetos. São retiradas todas aquelas que venham a comprometer a qualidade do produto final (FAZIO, 2006) Preparo Alguns frutos como abacaxi, manga, etc. exigem uma preparação prévia ao despolpamento envolvendo descasque, retirada de talos e de sementes. Após esta etapa são levados ao despolpamento ou prensagem (INTEC, 2005) Despolpamento É o processo utilizado para extrair a polpa da fruta do material fibroso, das sementes e dos restos das cascas (MORAES, 2006). Segundo Ramos et al. (2006), a etapa é realizada em despolpadeira vertical ou horizontal contendo peneiras, onde é extraída a polpa mais grosseira, para em seguida ser conduzida a refinaria. A velocidade da despolpa influência no rendimento e a temperatura também altera a sua eficiência conforme o tipo de matéria-prima Refino A polpa mais grosseira passa por uma refinadeira devido à quantidade de fibras, tornando-se mais refinada e melhorando seu aspecto visual (RAMOS et al., 2006) Tanque de Equilíbrio É necessário que o material despolpado seja depositado nos tanques de equilíbrio (até a capacidade do tanque), a fim de proporcionar uma uniformidade ao produto final. Para se

18 18 conseguir atender a um padrão de qualidade uniforme e constante, nesta fase do processamento, o produto pode sofrer algumas correções visando-se atingir um padrão préestabelecido em função de cada matéria-prima. Os padrões são estabelecidos a partir de análises sensoriais com os consumidores e através de análises físico-químicas pertinentes na legislação para o controle de qualidade. A formulação deve ser realizada ajustando o ph, quando necessário, com substâncias permitidas por legislação e ajustando-se o Brix adequado para cada fruta, fazendo-se a sua correção através da adição de sacarose (INTEC, 2005) Desaeração A desaeração leva à redução da quantidade de oxigênio e, consequentemente, à redução da oxidação e reações enzimática na polpa. O oxigênio é responsável por alterações de cor, sabor, aroma e perda de vitaminas, principalmente o ácido ascórbico (vitamina C) (RAMOS et al., 2006) Tratamento Térmico Nesta etapa a polpa passa por um processo de elevação da temperatura, o qual permite preservar as principais características (cor, sabor e aroma típicos) da fruta original, além de contribuir para a melhoria das características de conservação do produto (redução de contagem microbiológica) (INTEC, 2005). A polpa deve ser submetida a um tratamento térmico de acordo com a sua destinação, sendo que em alguns casos, esta etapa pode ser suprimida, promovendo-se o congelamento rápido, imediatamente após o despolpamento. Para o tratamento térmico a polpa deve ser conduzida para um inativador enzimático (pasteurizador tubular, devido à viscosidade e consistência do produto), onde receberá calor suficiente para a inativação da catalase e peroxidase (enzimas que escurecem e afetam a conservação do produto acabado). O tratamento térmico indicado depende da atividade enzimática de cada material e deve ser rápido. Em geral a polpa é aquecida a 90 ºC (+ ou - 2 ºC) por um período de 60 segundos, ou o mínimo necessário para a destruição de microorganismos contaminantes (INTEC, 2005). Segundo Ramos et al. (2006) pode ser realizada uma esterilização comercial, onde a polpa passa por um tratamento térmico de 110 C por 30 segundos sendo posteriormente

19 19 resfriada até C, para ser envasada assepticamente, porém, esse tratamento permite destruir principalmente fungos filamentosos e leveduras Envase e Conservação Após o processo de despolpamento ou tratamento térmico, a polpa é encaminhada ao envase. O procedimento do envase está diretamente relacionado ao método de conservação escolhido. Na produção de polpa congelada, o produto não é submetido a nenhum outro tratamento visando à inibição de reações químicas e enzimáticas e/ou redução da atividade de micro-organismos que possam levar a perda de qualidade. Portanto o envase posterior ao congelamento da polpa deve ser efetuado o mais rápido possível para manter as características da fruta fresca (FAZIO, 2006). No congelamento, após a fase de pasteurização, a polpa é resfriada imediatamente ao redor de 0 a 2 ºC em trocador de calor. Em seguida, o material é acondicionado em embalagens dos mais diversos tipos. A seguir o produto é submetido ao congelamento (MORAES, 2006). As polpas devem ser submetidas ao congelamento rápido, e que irá retardar qualquer tipo de alteração na polpa (química, bioquímica, microbiológica), além de evitar a formação de camadas (estratificação) durante o congelamento. A temperatura recomendada para polpa se situa na faixa de 18 ± 5 ºC, no entanto, o tempo necessário para abaixar a temperatura do produto para 5 ºC não deve ultrapassar 8 horas. A temperatura de 18 ºC deverá ser atingida em um tempo máximo de 24 horas e deve ser mantida durante todo o tempo de armazenamento e transporte até o momento do consumo (FAZIO, 2006). O envase asséptico é realizado principalmente em bag s, sem qualquer contato manual podendo ser armazenados à temperatura ambiente, em local fresco, seco e protegido da luz solar (RAMOS et al., 2006). Este método é indicado apenas para produtos com ph abaixo de 4,5, nos quais enquadra-se a maioria das frutas tropicais (INTEC, 2005). Portanto, a fruta depois de despolpada pode ou não sofrer tratamento térmico e posterior a esse processo, pode ou não ser congeladas. Essas etapas são definidas conforme os equipamentos de cada empresa.

20 Armazenamento As polpas que sofreram o processo de congelamento devem ser armazenadas em câmeras frigoríficas à temperatura de -18 C. As polpas submetidas ao envase asséptico devem ser armazenadas em local fresco, seco e protegido da luz solar (RAMOS et al., 2006). 2.4 CONTROLE DE QUALIDADE O sistema de controle de qualidade na indústria processadora de polpas deve ser elaborado dentro da realidade da empresa, porém seguindo os conceitos de qualidade e das Boas Práticas de Fabricação (BPF). É imprescindível que possua um Laboratório de Controle de Qualidade, assim como pessoal treinado para tal função. Caso não haja laboratório, é necessário que as atividades sejam feitas em local terceirizado. No Programa de Qualidade da empresa deve ser relatada a metodologia utilizada, se é em laboratório próprio ou terceirizado e se o estabelecimento mantém contra-provas de cada lote produzido, com qual periodicidade, onde são guardadas e como são identificadas. Caso a empresa possua um Laboratório de Controle de Qualidade, este deve ter um responsável fazendo controle dos produtos fabricados, sempre seguindo as normas exigidas pela legislação. O Regulamento Técnico para Fixação dos Padrões de Identidade e Qualidade para Polpa de Frutas (BRASIL, 2000) estabelece as análises físico-químicas e microbiológicos devem ser realizadas, como: ph; sólidos solúveis totais; acidez total; açúcares totais naturais; sólidos totais; bolores e leveduras; coliforme fecal e Salmonella. Os parâmetros das análises são alterados nas normas específicas de cada tipo de polpa de fruta, conforme as suas características peculiares. 2.5 CRITÉRIOS MICROBIOLÓGICOS PARA A AVALIAÇÃO DA QUALIDADE Entre vários parâmetros que determinam a qualidade de um alimento, os mais importantes, são sem dúvida, aqueles que definem suas características microbiológicas. A avaliação da qualidade microbiológica de um produto fornece informações que permitem

21 21 avaliá-lo quanto às condições de processamento, armazenamento e distribuição para o consumo, sua vida útil e quanto ao risco à saúde da população. Para que a análise microbiológica seja conduzida de forma que os resultados obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado, é necessário que critérios de avaliação sejam claramente estabelecidos (FRANCO & LANDCRAF, 2003). De acordo com o Codex Alimentarius, os seguintes itens compõem um critério microbiológico: O plano de amostragem no qual se define o número de unidades a serem analisadas e o tamanho de cada unidade; A definição dos micro-organismos que devem ser estudados em cada produto; A definição da metodologia analítica a ser adotada; O estabelecimento dos padrões, normas e especificações que definirão se o produto será aprovado ou reprovado. 2.6 QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE POLPAS DE FRUTAS Todos os alimentos, independente de sua origem, podem apresentar uma microbiota natural extremamente variável, concentrada principalmente na região superficial, embora os tecidos internos, tanto de vegetais como de animais, possam eventualmente, apresentar formas microbianas viáveis (ABREU, 2003 apud FAZIO, 2006). Com base na composição nutricional das frutas, pode-se presumir que estas são capazes de sustentar o desenvolvimento de bactérias, bolores e leveduras; contudo, o seu ph é mais baixo do que o intervalo que favorece o crescimento bacteriano. Por outro lado, a ampla faixa de ph de crescimento de bolores e leveduras propicia que estes atuem como agentes de alteração das frutas. A presença de fungos e leveduras é preocupante principalmente devido a sua capacidade de produzir micotoxinas, algumas mutagênicas e carcinogênicas. Ainda que os produtos de frutas sejam mais suscetíveis à contaminação por bolores e leveduras, surtos de doenças entéricas causados por bactérias, parasitas e vírus contaminantes destes produtos, têm sido documentados. Devido à sua composição, as polpas de frutas constituem-se em bons substratos para o desenvolvimento de micro-organismos, os quais, além de deteriorar o produto, podem acarretar danos à saúde do consumidor. Para garantir a oferta de um produto isento de contaminações, é necessário que se realize um rigoroso controle do processo produtivo e do produto. A conservação das polpas de frutas e a manutenção da qualidade microbiológica exigida pela legislação têm sido

22 22 atendidas principalmente pelo emprego da pasteurização e do congelamento (SEBASTIANY et al., 2009) Padrões microbiológicos exigidos pela legislação A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) através da Resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001) define os padrões microbiológicos para cada alimento. As polpas de frutas concentradas ou não, com ou sem tratamento térmico, refrigeradas ou congeladas possuem parâmetros somente para coliformes a 45 C e para Salmonella ssp., com no máximo 10² UFC.g -1 e ausência em 25 g, respectivamente, não apresentando assim, limite para a contagem padrão total e para bolores e leveduras. Contudo, a literatura reporta resultados de numerosos estudos que apresentam elevadas contagens destes micro-organismos, demonstrando ser discutível a não adoção destes critérios na avaliação da qualidade de sucos, refrescos, néctares e polpas de frutas nesta Resolução (SEBASTIANY et al., 2009). A legislação vigente no âmbito do Ministério da Agricultura (Instrução Normativa nº1, de 07 de janeiro de 2000) (BRASIL, 2000), por sua vez, fixa os limites máximos microbiológicos para polpa de frutas, tais como: Bolores e leveduras: máximo 5x10 3 UFC.g -1 para polpa "in-natura", congelada ou não, e 2x10³ UFC.g -1 para polpa conservada quimicamente e/ou que sofreu tratamento térmico. Coliformes fecais: máximo 1.g -1 Salmonella ssp.: ausente em 25 g 2.7 MICRO-ORGANISMOS INDICADORES Os micro-organismos estão intimamente associados com a disponibilidade, a abundância e a qualidade do alimento para consumo humano. Alimentos são facilmente contaminados com micro-organismos na natureza, durante manipulação e processamento. Após ter sido contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento de microorganismos, podendo até mesmo mudar suas características físicas, químicas e organolépticas do alimento levando o mesmo a deterioração (CUNHA, 2006). Embora as estatísticas brasileiras sejam precárias, acredita-se que a incidência de doenças microbianas de origem alimentar em nosso país seja bastante elevada. Mesmo em países desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gêneros alimentícios é considerado seguro

23 23 do ponto de vista de higiene e saúde pública, a ocorrência de doenças desta natureza é significante e vem aumentando, apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de produção e controle de alimentos (FRANCO & LANDCRAF, 2003). Micro-organismos indicadores são grupos ou espécies de micro-organismo que, quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (FRANCO & LANDCRAF, 2003). Segundo Hajdenwurcel (1998), os micro-organismos indicadores podem ser divididos em dois grupos: 1) Micro-organismos que não oferecem um risco direto a saúde: contagem padrão de mesófilos, psicotróficos e termófilos e contagem de bolores e leveduras. 2) Micro-organismos que oferecem um risco baixo e indireto a saúde: coliformes totais, coliformes fecais, enterococos, enterobactérias totais, Escherichia coli Micro-organismos Aeróbios Mesófilos Dentre os micro-organismos existentes, as bactérias são largamente estudadas por serem responsáveis por processos de deterioração, participarem da elaboração de alimentos e/ou por serem responsáveis por infecções e intoxicações de origem alimentar. As bactérias aeróbias mesófilas se desenvolvem na presença de oxigênio, se multiplicam sob temperaturas de 20 a 45 C, tendo a temperatura ótima entre 30 a 45 C. A presença de bactérias mesófilas em grande número indica matéria-prima excessivamente contaminada; limpeza e sanitização de superfícies inadequadas; higiene insuficiente na produção ou conservação dos alimentos; condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas circunstâncias (FORTUNA, 2007) Contagem Total de Micro-organismos Aeróbios O método de contagem de micro-organismos aeróbios baseia-se no plaqueamento de alíquotas do alimento homogeneizado e de suas diluições, onde é utilizando-se o Ágar Padrão de Contagem (PCA). A mudança de temperatura e tempo de incubação permitem a contagem de grupos diferentes de micro-organismos como: mesófilos, psicotróficos, termófilos e termodúricos (HAJDENWURCEL, 1998). A contagem total de aeróbios mesófilos é o método mais utilizado como indicador geral de populações bacterianas em alimentos. Não diferencia tipos de bactérias, sendo

24 24 utilizada para se obter informações gerais sobre a qualidade do produto. A contagem não é indicador de segurança, pois não está diretamente relacionada à presença de patógenos ou toxinas (SILVA et al., 2007). A contagem de bactérias aeróbias mesófilas indica a qualidade sanitária dos alimentos. Mesmo que os patógenos estejam ausentes e que não tenham ocorrido alterações nas condições organolépticas do alimento, um número elevado de micro-organismo indica que o alimento é insalubre (FRANCO & LANDCRAF, 2003). Todas as bactérias patogênicas de origem alimentar são mesófilas. A contagem elevada desse grupo de bactérias nos alimentos é indicativo do uso de matérias-primas contaminadas ou processamento insatisfatório, sob o ponto de vista sanitário (FRANCO & LANDCRAF, 2003). Altas contagens em produtos prontos diminuem o período de vida útil, levando sua deterioração (HAJDENWURCEL,1998) Bolores e Leveduras Os bolores e as leveduras constituem um grande grupo de micro-organismos, a maioria originária do solo ou do ar. Os bolores são extremamente versáteis, a maioria das espécies é capaz de assimilar qualquer fonte de carbono derivada de alimentos, sendo também indiferente com relação às fontes de nitrogênio, podendo utilizar o nitrato, os íons de amônia e o nitrogênio orgânico. As leveduras são mais exigentes que os bolores, sendo muitas incapazes de utilizarem o nitrato e carboidrato complexos, como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente. Esses fatores limitam a gama de alimentos susceptíveis a deterioração por leveduras (SILVA et al., 2007). Os bolores e as leveduras são também bastante resistentes a condições adversas, como ácido e atividade de água baixa. A maioria das leveduras apresenta atividade de água mínima de crescimento na faixa de 0,88 e a maioria dos bolores na faixa de 0,80. Com relação ao ph os fungos são muito poucos afetados pela variação da faixa de 3,0 a 8,0. Vários bolores crescem abaixo de 2,0 e diversas leveduras abaixo de 1,5. Entretanto, quando o ph afasta-se do ótimo (geralmente próximo a 5,0) a velocidade crescimento diminui e, se houver outros fatores de inibição (atividade de água, temperatura, etc.), seu efeito restritivo sobre a velocidade de crescimento torna-se mais acentuado (SILVA et al., 2007). A temperatura ótima de crescimento da maioria dos fungos encontra-se na faixa de 25 a 28 C, não crescendo bem em temperaturas mesófilas (35 a 37 C) e raramente em temperaturas acima de 45 C. Seu crescimento não é incomum sob condições de refrigeração

25 25 (5 C), porém, abaixo de 10 C negativos podem ser considerados microbiologicamente estáveis (SILVA et al., 2007). A consistência do alimento, assim como a atmosfera de armazenamento, exerce uma considerável influência sobre os tipos de fungos que irão provocar a deterioração do produto. Em linhas gerais, as leveduras predominam em alimentos líquidos, os bolores ao contrário são favorecidos por substratos firmes e sólidos. Mas essa afirmação não deve ser entendida como absoluta, pois simplesmente as leveduras são mais competitivas em meios líquidos, provocando alteração percebida mais fácil (SILVA et al., 2007). O crescimento de bolores e leveduras é mais lento do que o de bactérias em alimentos de baixa acidez e alta atividade água, porém em alimentos ácidos e de baixa atividade de água, o crescimento de fungos é maior, provocando deterioração principalmente em frutas frescas, vegetais e cereais. São também responsáveis pela deterioração de sucos de frutas, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva, quando armazenados em condições inadequadas (FRANCO & LANDCRAF, 2003) Contagem de Bolores e Leveduras A contagem de bolores e leveduras é aplicável principalmente na análise de alimentos ácidos, com ph < 4,5, nos quais a presença elevada é indicativo de falhas ao longo do processamento, comprometendo a vida útil do produto. Embora existam muitas espécies toxigênicas, esta contagem não visa à obtenção deste tipo de informação, mas sim uma avaliação global do produto (HAJDENWURCEL, 1998). Segundo Rodrigues (2005), altas contagens de bolores e leveduras indicam sanitização pobre no processamento do alimento ou uma seleção mal feita da matéria-prima introduzindo produtos contaminados. Eles são indicadores de uma má técnica de processamento e falha na higiene da planta processadora. A alta contagem pode indicar também possível presença de micotoxinas que podem apresentar riscos a saúde. 2.8 CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS EM PLACAS A análise de alimentos para a presença, os tipos e números de micro-organismos e/ou seus produtos é muito importante na microbiologia de alimentos. Apesar dessa importância nenhum dos métodos normalmente utilizados permite a determinação exata do número de micro-organismos em um alimento.

26 26 A contagem padrão em placas é utilizada para a quantificação de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos, aeróbios psicotróficos, os bolores e leveduras, os clostrídios sulfito redutores, os enterococos e as bactérias lácticas (SILVA et al., 2007). No método de contagem padrão em placas, porções de amostras de alimentos são misturadas ou homogeneizadas, diluídas serialmente em um diluente apropriado, plaqueadas sobre ou dentro de um meio ágar adequado, o qual é incubado sob temperatura apropriada por um determinado tempo, sendo então todas as colônias visíveis contadas (JAY, 2005). Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos, não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células. Essa correlação é feita entre o número de colônias e o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC), que podem ser tanto células como agrupamentos característicos de certos micro-organismos (SILVA et al., 2007). Segundo Silva et al. (2007) para a inoculação da amostra ao meio de cultura, chamada de plaqueamento, podem ser utilizadas quatro procedimentos básicos: a) o plaqueamento em profundidade, b) o plaqueamento em superfície, c) o plaqueamento em gotas ou d) filtração em membranas Plaqueamento em Superfície A inoculação superficial é considerada vantajosa sob alguns aspectos, pois não expõe o micro-organismo ao calor do meio fundido, permite a visualização das características morfológicas e diferenciais de colônias, facilita a transferência de colônias, permite a utilização de meios que não podem ser fundidos depois de prontos e não exige que os meios sejam translúcidos. Sua principal desvantagem é que o volume inoculado é limitado à capacidade de absorção de líquido pelo meio de cultura, que não permite a inoculação de mais de 0,5 ml por placa, o procedimento padrão é a incubação de 0,1ml/placa de cada diluição (SILVA et al., 2007). 2.9 MÉTODO DE CONTAGEM EM PETRIFLM TM Petriflm TM (3M Company ) é uma modificação da contagem de unidades formadoras de colônias em placas, composto por dois filmes estéreis reidratáveis, impregnados pelo meio de cultura e por substâncias geleificantes solúveis em água fria. A inoculação é feita no filme inferior que, depois de inoculado, é coberto como filme superior. O inoculo é espalhado com

27 27 um difusor de plástico, por leve pressão manual e, depois da solidificação do gel, as placas são incubadas para o desenvolvimento de colônias (SILVA et al., 2007) As placas Petriflm são sistemas prontos de meio de cultura que contém diferentes tipos de nutrientes, géis hidrossolúveis a frio, corantes e indicadores, adequado a cada tipo de micro-organismo pesquisado. O sistema das placas Petriflm melhora a eficiência, pois reduz a análise microbiológica a três etapas (Figura 2). Figura 2. Procedimento de inoculação e contagem de colônias em placas 3M Petrifilm Contagem Total de Aeróbios por Placa 3M Petriflm TM A placa 3M Petrifilm para Contagem Total de Aeróbios (AC) é um sistema de meio de cultura pronto para uso, que contém os nutrientes do método padrão, um agente geleificante solúvel em água fria, e um indicador que facilita a enumeração das colônias. As placas 3M Petrifilm são utilizadas para enumeração de bactérias aeróbias nas indústrias de alimentos (3M do Brasil, 2011). Para realização da leitura na placa 3M Petrifilm para Contagem Total de Aeróbios deve-se contar todas as colônias vermelhas independentemente de seu tamanho ou intensidade de cor, conforme demonstrado na Figura 3 (3M do Brasil, 2011).

28 28 Figura 3. Contagem Total de Aeróbios na placa 3M Petrifilm. A Placa 3M Petrifilm para Contagem de Aeróbios pode ser usada para enumerar aeróbios totais em todos os alimentos e possui aprovação nacional pelo MAPA e orgãos internacionais, como AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Como as colônias na placa 3M Petrifilm AC são vermelhas, elas podem se diferenciar das partículas de produto que tem forma irregular e coloração opaca (3M do Brasil, 2011).

29 29 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 AMOSTRAS DE POLPA DE FRUTAS Da câmara de congelamento da empresa Borsato Industrial, foram coletadas 15 amostras de polpas de diferentes frutas congeladas em embalagens estéreis, sendo 11 da marca A, 3 da marca B e 1 da marca C, conforme demonstrado na Figura 4. Figura 4. Amostras coletadas em embalagens estéreis. Todas as amostras, com exceção da amostra da marca C, continham laudos técnicos emitidos pelo responsável técnico de cada fornecedor, nos quais apresentados os resultados de suas contagens de Bolores e Leveduras e Aeróbios Mesófilos e quais processos de conservação foram aplicados às mesmas, conforme demonstrado na Tabela 1. O laudo técnico de uma amostra da marca A continha o processo de conservação, porém não apresentava sua caracterização microbiológica.

30 30 Tabela 1 - Processo de conservação das polpas e contagem de Bolores/leveduras e Aeróbios mesófilos (UFC.g - 1) apresentados nos laudos técnicos Polpa Fornecedor Contagem de Processo de Contagem de Bolores Aeróbios Conservação e Leveduras Mesófilos Manga A Congelado < 10 8,0 x 10¹ Maça A Pasteurizado/Congelado < 10 <10 Banana A Pasteurizado/Congelado 3,0 x ,9 x 10² Amora A Congelado < 10 1,0 x 10¹ Goiaba A Pasteurizado/Congelado < 10 1,0 x 10¹ Pêssego A Pasteurizado/Congelado np*** <10 Moranago ss* A Congelado 7,0 x ,9 x 10² Moranago cs** A Congelado 2,0 x ,0 x 10¹ Abacaxi A Pasteurizado/Congelado 5,0 x ,0 x 10² Ameixa A Pasteurizado/Congelado 2,0 x ,0 x 10 1 Mamão A Pasteurizado/Congelado < 10 1,8x 10² Uva B Pasteurizado/Congelado <100 <100 Maçã B Pasteurizado/Congelado <100 <100 Maracujá B Pasteurizado/Congelado <100 <100 Laranja C np*** np*** np*** *ss: sem sementes; **cs: com sementes; ***np: não possuía laudo técnico As amostras coletadas foram acondicionadas em caixas de material isotérmico (isopor) contendo cubos de gelo e imediatamente transportadas ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos do IFRS - Campus Bento Gonçalves. 3.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS Nas amostras de polpas coletadas foram realizadas análises microbiológicas de contagem de bolores e leveduras segundo Silva et al. (2007) e contagem de aeróbios mesófilos segundo 3M do Brasil (2011) em placas de Petrifilm. Todas as vidrarias utilizadas como pipetas, espátulas, alça de Drigalski, vidro relógio e béckeres foram previamente esterilizadas em autoclave 121 C/ 30 minutos Preparo de Diluições Seriadas As diluições seriadas das amostras foram realizadas em Água Peptonada Tamponada (Himedia ), seguindo-se as instruções dadas pelo fabricante, ou seja, 20 g do meio diluídos em 1000 ml de água destilada, seguido de homogeneização e autoclavagem.

31 31 No momento da análise, as amostras de polpas de frutas foram descongeladas a temperatura ambiente, procedendo-se a seguir com o preparo de diluições seriadas até 10-4, conforme demonstrado na Figura 5. Figura 5. Esquema geral do preparo de diluições seriadas Análise de Bolores e Leveduras Para a determinação de bolores e leveduras nas amostras de polpas de frutas, utilizouse o meio Agar Batata Dextrose (BDA, Himedia ), seguindo-se as instruções dadas pelo fabricante, ou seja, 39 g do meio diluídos em 1000 ml de água destilada, seguido de homogeneização e aquecimento em micro-ondas, com posterior autoclavagem. O meio de cultura, após ser acidificado com ácido tartárico 10 % (1 ml de ácido para cada 100 ml de meio), foi vertido (± 20 ml) em placas de petri descartáveis estéreis. Conforme metodologia descrita por Silva et al. (2007), utilizou-se o método de plaqueamento direto em superfície das diluições seriadas (10 1 até 10 4 ) previamente preparadas. Para tal, inoculou-se 0,1 ml de cada diluição na superfície do meio BDA solidificado nas placas de petri e, com auxílio de uma alça de Drigalski, espalhou-se o inóculo cuidadosamente em toda sua superfície, até completa absorção. As etapas deste processo podem ser visualizadas na Figura 6.

32 32 Figura 6. Inoculação das diluições seriadas em placas de petri contendo meio de cultura BDA. Após a incubação das placas em incubadoras do tipo B.O.D. (modelo CP 602, Solab) sob 25 ºC por 5 dias, as colônias de bolores e leveduras foram contadas em contador de colônias (modelo CP611, Phoenix ) e os resultados foram expressos pelo número de Unidades Formadoras de Colônia por grama de amostra (UFC.g -1 ) Análise de Aeróbios Mesófilos Conforme instruções do fabricante, que segue o método da AOAC (2000), colocou-se a placa de Petrifilm sob uma superfície plana dentro da câmara de fluxo (modelo Flv-K, Trox Technik) previamente preparada. A seguir, levantou-se a folha superior da placa e inoculou-se 1 ml da diluição 10-1 ou 10-2, no centro da folha inferior da membrana, a qual continha o meio seletivo específico para tal quantificação. Recobriu-se com a folha superior de modo a evitar o aprisionamento de bolhas e deixou-se a placa em repouso por mais ou menos um minuto para permitir que o gel solidificasse, conforme demonstrado na Figura 7.

33 33 Figura 7. Inoculação na placa de Petrifilm. A diluição 10-1 foi utilizada para a contagem de aeróbios mesófilos para quase todas as amostras, com exceção das polpas de banana e laranja, para as quais se utilizou a diluição 10-2, uma vez que, segundo os laudos técnicos, as mesmas apresentaram uma contaminação mais elevada. As membranas foram incubadas em incubadoras do tipo B.O.D. (modelo CP 602, SOLAB) por 48 h sob temperatura de 35 C, conforme descrito pelo método da AOAC (2000). Após decorrido o tempo de incubação, as colônias foram contadas em contador de colônias (modelo CP 611, Phoenix ) e os resultados foram expressos pelo número de Unidades Formadoras de Colônia por grama de amostra (UFC.g -1 ).