UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ PAULA VIEIRA DE SOUZA

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1 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ PAULA VIEIRA DE SOUZA LEVANTAMENTO MICROBIOLÓGICO E CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS DO REBANHO LEITEIRO DA REGIÃO DE GARUVA Monografia apresentada ao Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do titulo de Médico Veterinário. Profº Orientador: Dr. João Ari Gualberto Hill. Orientador Profissional: Dr. Paulo Guataçara da Costa Lima. CURITIBA 2007

2 RESUMO Este trabalho teve por objetivo a avaliação das características microbiológicas do leite juntamente com a Contagem de Células Somáticas de vacas mestiças leiteiras, de rebanhos de ordenha manual e mecânica, realizados em 25 propriedades. Os resultados com maiores índices e mais preocupantes foram a E.coli com 93% e da S. aureus com 76%. Mostrou também uma correlação com o California Mastitis Test e a Contagem de Células Somáticas que foram realizados em 2 propriedades escolhidas, obtendo 50% de positividade. A mastite contagiosa e ambiental são consideradas como um problema potencial em criações com finalidade de produção leiteira. ii

3 ABSTRACT This work had as objective the evaluation of the milk microbiological characteristics from the Counting of Somatic Cells of crossbred dairy cows, of flocks of it milks manual and mechanics. The results with bigger preoccupying indices had been the E.coli with 93% and S. aureus with 76%. It also showed a correlation with the California Mastitis Test and the Counting of Somatic Cells that had been carried through in 2 chosen properties, getting 50% of positividade. The mastitis contagious and ambient are considered as a potential problem in creations with milk production purpose. iii

4 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Etiologia Transmissão Desenvolvimento da doença Estabelecimento de infecção e inflamação da área afetada Destruição do tecido alveolar Diagnóstico Contagem de Células Somáticas California Mastitis Test MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO...35 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...37

5 LISTA DE TABELAS TABELA 1: O RESULTADO DO EXAME DE CCS DO LEITE NA PRIMEIRA COLETA...26 TABELA 2: LEVANTAMENTO DE CMT PROPRIEDADES PILOTO...27 TABELA 3: RESULTADOS DO EXAME MICROBIOLÓGICO DAS AMOSTRAS DE LEITE TOTAL...30 TABELA 4: PORCENTAGENS DE ISOLAMENTO BACTERIANO...30 TABELA 5: O RESULTADO DO EXAME DE CCS DO LEITE SEGUNDA COLETA...32

6 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: DESENVOLVIMENTO DE MASTITE E A DEFESA DA VACA CONTRA INFECÇÃO...13 FIGURA 2: AS PRINCIPAIS ROTAS DE TRANSMISSÃO BACTERIANA...13

7 1 1 INTRODUÇÃO No Brasil, a produção de leite, como os outros segmentos da atual sociedade, é uma atividade cada vez mais competitiva. Portanto, é importante quantificar e qualificar os fatores que podem influenciá-la, buscando ganhos efetivos na quantidade e qualidade do leite produzido, na tentativa de suprir a demanda nacional. Em Santa Catarina a maior parte da produção leiteira de sua região litorânea é oriunda do pequeno produtor rural, que possui áreas reduzidas, dispõe de recursos de capital limitado, utiliza preponderantemente mão-de-obra familiar e pratica um sistema diversificado de cultivo, associados á produção animal. A produção de leite como qualquer atividade produtiva, deve gerar lucro ao produtor, de modo a mantê-lo na atividade. O lucro da atividade é função da produtividade, dos custos de produção e do preço do leite pago ao produtor, principalmente. Uma forma de aumentar o lucro é diminuindo as perdas econômicas advindas da ocorrência de doenças, as quais podem diminuir a produtividade e aumentar os custos. Nesse sentido, a mastite, inflamação da glândula mamária, é tida como o fator que mais contribui para as perdas econômicas da cadeia produtiva do leite. A mastite é um processo inflamatório da glândula mamária, acompanhada da redução de secreção de leite e mudança de permeabilidade da membrana dos ácinos, o que ocasiona mudança na sua composição. A inflamação caracteriza-se por aumento do volume, da temperatura,

8 2 vermelhidão, dor, distúrbio funcional, resultando em diminuição da produção de leite e em alterações físicas, químicas e bacteriológicas do mesmo (LANGONI, 2000; PARK & JACOBSON, 1996). Objetivo do presente trabalho foi realizar um levantamento em vinte cinco propriedades de rebanho leiteiro das contagens de células somáticas (CCS) e o perfil microbiológico, destas amostras para preparar duas propriedades pilotos para implementação de um programa de educação sanitária, visando redução da prevalência da mastite e uma melhor qualidade do leite, para atender as exigências da Instrução Normativa 51/02 no Município de Garuva, na região de Santa Catarina.

9 3 2 REVISÃO DE LITERATURA A mastite é a inflamação da glândula mamária, sendo causada, em grande parte, por microorganismos, tais como bactérias e fungos, destes as bactérias são os principais agentes etiológicos (FONSECA & SANTOS, 2000). As infecções da glândula mamária provocam redução da produção e da mudança da composição do leite que variam de acordo com a intensidade e a duração das infecções (MACHADO et al.1999). As infecções da glândula mamária podem apresentar-se sob duas formas de apresentação, a clínica e a subclínica. A forma subclínica é normalmente a mais prevalente sendo responsável por aproximadamente 70% das perdas, podendo reduzir a secreção de leite em até 45%. Os microrganismos envolvidos na etiologia da mastite bovina podem ser classificados em patógenos maiores e menores. Na primeira categoria estão incluídos os agentes que provocam maiores Contagem de Células Somáticas (CCS), alterações significativas na composição do leite e, conseqüentemente, grande impacto econômico. Os principais patógenos maiores são os Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, coliformes, estreptococos, enterococos, Pseudomonas sp., Actinomyces pyogenes e Serratia sp.. Estafilococos coagulase negativos e Corynebacterium bovis são considerados patógenos menores e promovem inflamação moderada com CCS de no máximo 2 a 3 vezes superior a dos quartos sadios (HARMON, 1994; LAFFRANCHI, 2001). A mastite clinica apresenta sinais evidentes da manifestação desta, tais como edema, aumento de temperatura, endurecimento e dor na glândula

10 4 mamária e aparecimentos de grumos, pus ou qualquer alteração da característica do leite (FONSECA & SANTOS, 2000). Em casos severos, a vaca mostra sinais de reação generalizada: febre, pulso rápido, perda de apetite e brusco declínio na produção de leite. A mastite subclínica caracteriza-se por alterações na composição do leite, tais como aumento na contagem de células somáticas (CCS), aumento nos teores de cloro, sódio e proteínas séricas, e diminuição nos teores de caseína, lactose e gordura do leite. Nesse tipo de mastite não existem sinais evidentes da doença, portanto não é possível diagnostica-la sem a utilização de testes auxiliares. Dessa forma, o sinal clássico da mastite subclínica é a elevação da CCS, e os testes auxiliares para o diagnóstico desta são o Califórnia Mastit Test, e a Contagem Eletrônica Células Somáticas (CECS) (FONSECA & SANTOS, 2000). Ao contrário da mastite clínica, a mastite subclínica é branda e mais difícil de ser detectada. A vaca se apresenta sadia, o úbere não mostra nenhum sinal de inflamação e o leite parece normal. Entretanto, microorganismos e células brancas do sangue (células somáticas) que são defesas para infecção, são encontradas em número elevado no leite (apud COLDEBELLA, et al. 2004). As perdas de leite e financeira devido à mastite clínica são facilmente observadas, a produção de leite cai drasticamente e o leite de vacas tratadas com antibióticos tem que ser descartado por três ou quatro dias (JOHNSON, 1994).

11 5 Apesar disso, muito mais leite é perdido devido à mastite subclínica porque, a grande maioria de casos de mastite são subclínicos (em média, para cada caso clínico, existem 20 a 40 casos subclínicos). A redução na produção de leite devido à mastite subclínica tende a persistir por períodos longos e portanto subestima a produção de vacas infectadas. O controle da mastite subclínica é mais importante do que simplesmente o tratamento de casos clínicos porque: As vacas que têm mastite subclínica são reservatórios de organismos que levam à infecção de outras vacas; A maioria dos casos clínicos começam como subclínicos; portanto, controlando a mastite subclínica é a melhor forma de reduzir casos clínicos. A mastite subclínica tem grande impacto na produtividade dos rebanhos leiteiros porque sua prevalência é maior que a da forma clínica e, assim, as medidas para o seu controle têm recebido grande atenção (PHILPOT, 2002). Existe uma outra grande divisão conceitual em termos de mastite. Esta se refere ao tipo de agente causador, que pode ser ambiental ou contagioso. Dessa forma, dividi-se a mastite em dois grandes grupos, quanto ao tipo de agente patogênico causador; mastite contagiosa e mastite ambiental (FONSECA & SANTOS, 2000). A mastite contagiosa caracteriza-se por apresentar baixa incidência de casos clínicos e alta incidência de casos subclínicos, geralmente de longa duração ou crônicos e apresentando alta CCS (FONSECA & SANTOS, 2000). A mastite ambiental é causada por agentes que vivem preferencialmente no habitat da vaca, em locais que apresentam esterco, urina, barro, e camas

12 6 orgânicas. Esse tipo de mastite caracteriza-se por alta incidência de casos clínicos, geralmente de curta duração, freqüentemente com manifestação aguda e com maior concentração nos momentos do pré e pós parto imediato (PHILPOT, 1998). Ao contrário da mastite contagiosa, nesse caso, a maioria das novas infecções ocorre durante o período entre as ordenhas, embora também haja ocorrências de novos casos durante a ordenha, especialmente em situações nas quais há problemas de funcionamento do sistema de ordenha. Visto que os patógenos ambientais estão disseminados por todo o ambiente da vaca, deduz-se que é impossível erradicar esse tipo de mastite, ao contrário da contagiosa, passível de erradicação. Além disso, dada a grande disseminação dessas bactérias ambientais na fazenda, todas as categorias animais estão sob risco; vacas em lactação, vacas secas, e novilhas (COLDEBELLA, 2003). Uma particularidade na mastite ambiental é que ela geralmente se manifesta em rebanhos bem manejados com baixa CCS, se faz presente na forma clínica e tem baixa duração. Isso por que a alta prevalência de mastite subclínica e alta CCS dos rebanhos com problemas de mastite contagiosa conferem até certo ponto, uma proteção parcial contra os agentes ambientais (PHILPOT, 2002). Por isso, cabe salientar que uma vez iniciando um programa de controle de mastite este deve ser integral, abrangendo medidas de controle tanto de mastite contagiosa quanto ambiental, pois quando se adotam rígido manejo e higiene na ordenha sem adoção de medidas de controle do ambiente, pode-se

13 7 obter queda significativa na CCS, seguidas de surtos de mastite clinica aguda causada por patógenos ambientais (FONSECA & SANTOS, 2000). 2.1 Etiologia Pode ser causada por uma ampla variedade de microrganismos, sendo as bactérias os agentes de maior prevalência. Em função do reservatório primário desses patógenos, a mastite pode ser classificada em contagiosa ou ambiental, destacando-se a primeira causada particularmente por Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, Corynebacterium bovis e Actinomyces pyogenes, que são responsáveis por cerca de 80% dos casos de mastite (LANGONI et al., 2000). Entre os patógenos principais da mastite contagiosa, destacamos o Staphylococcus aureus e o Streptococcus agalactiae e entre os patógenos secundários o Corynebacterium bovis (MARGATHO et al., 1998). Bactérias de gênero Staphylococcus ocupam um papel destacado na etiologia das infecções intramamárias do gado leiteiro. A espécie S. aureus é considerada um patógeno primário e tem sido o agente mais freqüentemente isolado tanto de infecções clínicas como subclínicas (BOOTH, 1995; BRAMLEY et al., 1996; BRITO et al., 1999). As espécies coagulase-negativas, comumente isoladas de leite bovino, são consideradas patógenos secundários e, em geral, causam reação inflamatória moderada na glândula mamária (BRAMLEY et al.1996). O Staphylococcus aureus é um microorganismo gram positivo, geralmente encontrado colonizando o canal do teto, o interior da glândula

14 8 mamária ou a pele do teto, especialmente quando esta se encontra lesada. Esse agente tem a propriedade de fixar-se as células epiteliais e estabelecer infecção por mecanismos patogênicos, como a produção de toxinas. Isso pode resultar em necrose do estroma e parênquima mamário, estabelecendo-se nesse local um foco de infecção. Tal necrose resulta em perda de função secretora e conseqüente redução significativa da produção de leite (FONSECA & SANTOS, 2000). Uma característica importante do S. aureus é sua capacidade de invasão, que permite que este se instale em partes profundas da glândula mamária. Além disso, geralmente há formação de tecido fibroso no foco da infecção, formando colônias de bactérias que impedem o acesso dos antibióticos ao sitio da infecção. Isso confere uma das principais características do agente; infecções de longa duração, com tendência a cronificar, e baixa taxa de cura, tanto espontânea quanto com a utilização de antibióticos (FONSECA & SANTOS, 2000). Bactérias de gênero Streptococcus agalactiae é a causa mais comum de infecções subclínicas mas raramente causa doença severa. O Streptococcus agalactiae é uma bactéria gram positiva, encontrada principalmente no interior da glândula mamária. Tem a propriedade de fixar-se nas células epiteliais do interior da glândula mamária, porém o quadro inflamatório é leve, ocorrendo forte edema, rubor ou endurecimento da glândula. Dificilmente essa infecção leva a morte do animal, quando o diagnóstico é feito rapidamente, sendo raro os casos de perda do quarto afetado (FONSECA & SANTOS, 2000).

15 9 É importante em relação à qualidade do leite, esse agente desencadeia alta CCS, vacas infectadas podem eliminar elevado número de colônias de bactérias no leite, podendo comprometer a qualidade do leite de todo o rebanho. Corynebacterium bovis é um microorganismo gram positivo, encontrado principalmente no interior da glândula mamária e ducto do teto. A alta incidência deste em um rebanho indica deficiência na desinfecção dos tetos após a ordenha. Esse agente apresenta limitada virulência, determinando um pequeno aumento na CCS, os casos são quase sempre subclínicos e leves (FONSECA & SANTOS, 2000). A mastite ambiental é aquela ocasionada por agentes que partilham o mesmo ecossistema da vaca, tais como; solo, piso, cama, esterco, e materiais orgânicos. Dentre eles destacam-se Escherichia coli, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp., estafilococos coagulase-negativos, Streptococcus uberis e Streptococcus dysgalactiae (COLDEBELLA, 2003). A contaminação dos animais por esses microrganismos, embora possa ocorrer durante o processo de ordenha, acontece principalmente entre ordenhas. Geralmente são de difícil controle, pois seus principais agentes estão disseminados no ambiente dos animais (LANGONI, 2000). Os coliformes são um grupo de bactérias gram-negativas que incluem a Escherichia coli, Enterobacter sp., Klebsiella sp., apresentam quatro vezes maior durante o período seco que durante a lactação especialmente duas semanas após a secagem e duas antes do parto. Durante a lactação, a taxa de

16 10 risco é mais alta durante as primeiras semanas de lactação. Geralmente de curta duração (FONSECA & SANTOS, 2000). O Streptococci outro grupo de bactérias ambientais formado pelo Streptococcus uberis e Streptococcus dysgalactiae tornaram-se importante por serem responsáveis por aproximadamente 60% de todos os casos de mastite clínica (COLDEBELLA, 2003). 2.2 Transmissão A mastite contagiosa é transmitida quase exclusivamente durante a ordenha. Para que haja a transmissão, é necessário que exista um elemento de ligação entre um quarto infectado e um quarto sadio. Na maioria das vezes, esses vetores são; mãos do ordenhador, pano, esponja, para secagem dos tetos (quando utilizadas para varias vacas) e teteiras. Salientamos que a transmissão da mastite contagiosa se da principalmente pela colonização da pele dos tetos e não pela entrada direta do agente no interior da glândula mamária, especialmente naqueles rebanhos nos quais o equipamento de ordenha se encontra bem regulado (FONSECA & SANTOS, 2000). A transmissão da mastite ambiental é causada por microorganismos presentes no meio ambiente, as fontes de microorganismos incluem o esterco, cama inadequada, piquete mal conservado, poeira, sujeira, lama, água e equipamentos contaminados (HARMON,1994). As condições que favorecem a exposição do úbere aos microrganismos do ambiente incluem: superpopulação; áreas de vaca seca e maternidade sujas

17 11 e úmidas; ventilação que não remove a umidade adequadamente; acúmulo de fezes e umidade nas trilhas, nas áreas de alimentação, nas áreas de exercício, nos pastos e estábulos; piquetes barrentos; acesso a lagoas e açudes; e ordenha de úberes mal enxutos (GOMES, 2006). O Streptococcus uberis e Streptococcus dysgalactiae, pode ser transmitidos tanto do ambiente quanto durante o momento da ordenha, e portanto esses microorganismos não são exclusivamente ambientais (PHILPOT, 2002). 2.3 Desenvolvimento da doença Infecções começam quando microorganismos penetram no canal do teto e multiplicam-se na glândula mamária. O teto é a primeira linha de defesa contra a penetração de bactéria no úbere. Normalmente, o músculo do esfíncter fecha de forma apertada o canal do teto quando a vaca não está sendo ordenhada. A invasão do teto geralmente ocorre durante a ordenha. Organismos presentes no leite ou na ponta do teto são introduzidos no canal do teto e na cisterna quando ocorre admissão indesejada de ar na unidade de ordenha (deslizamento ou remoção das teteiras antes de fechar o vácuo). Depois da ordenha, o canal do teto permanece dilatado por uma a duas horas; entretanto, o canal de um teto machucado permanece parcialmente aberto (JOHNSON, 1994).

18 Estabelecimento de infecção e inflamação da área afetada Algumas bactérias podem entrar no úbere fixando-se e colonizando novos tecidos; outras podem mover-se pela corrente do leite produzida pelo movimento da vaca. A bactéria primeiramente danifica o tecido que envolve os ductos coletores maiores de leite. A bactéria pode encontrar leucócitos (células brancas do sangue) presentes naturalmente em pequeno número no leite (CUNNINGHAM,1999). Essas células são a segunda linha de defesa porque elas podem englobar e destruir bactérias. Entretanto, durante esse processo, os leucócitos liberam substâncias que causam o movimento de leucócitos adicionais do sangue para o leite (WATTIAUX, 2003). Se as bactérias não são totalmente destruídas, elas continuam a se multiplicar e começam a invadir os ductos menores e as áreas alveolares. Células secretoras de leite danificadas pelas toxinas e outras substâncias irritantes liberam substâncias que levam ao aumento da permeabilidade dos tecidos sanguíneos (Figura 1) (WATTIAUX, 2003).

19 13 FIGURA 1: DESENVOLVIMENTO DE MASTITE E A DEFESA DA VACA CONTRA INFECÇÃO. Fonte: Essenciais em Gado de Leite, FIGURA 2: AS PRINCIPAIS ROTAS DE TRANSMISSÃO BACTERIANA. Fonte: Essenciais em Gado de Leite, Leucócitos adicionais movem para o lugar da infecção. Eles entram no tecido alveolar em grandes números, se infiltrando pelas células secretoras de leite danificadas (Figura 1) (WATTIAUX, 2003).

20 14 Fluídos, minerais e fatores de coagulação também penetram na área afetada. Coágulos de leite podem fechar os ductos e isolar as regiões infectadas (SWENSON et al., 1996). 2.5 Destruição do tecido alveolar Às vezes os microorganismos são eliminados rapidamente e a infecção é resolvida. Nesse caso, os ductos obstruídos são abertos e a composição e produção retornam ao normal em alguns dias. Entretanto, a medida que a infecção persiste e os ductos permanecem obstruídos, o leite preso faz com que as células secretórias revertam para um estado de descanso (não produção) e o alvéolo começa a encolher (Figura 1). Substâncias liberadas pelos leucócitos levam à completa destruição das estruturas alveolares, que são substituídas por tecido conjuntivo e cicatricial (Figura 1). A destruição do tecido secretório de leite é, de fato, a terceira linha de defesa para trazer a infecção sob controle (WATTIAUX, 2003). Portanto, a medida que a doença progride, o número de células somáticas no leite torna-se elevado e associado com uma (permanente) redução da produção de leite. 2.6 Diagnóstico Os métodos de diagnóstico da mastite clinica e subclínica incluem exames microbiológicos, métodos químicos indiretos, CCS (Contagem de

21 15 Células Somáticas) do leite dos quartos mamários individuais, e CMT (California Mastitis Test) os animais ou do rebanho (QUINN, et al. 1994). A análise microbiológica do leite é essencial para a identificação do agente causador da mastite, é fundamental para a tomada de decisões no rebanho quanto a recomendações de tratamento e descarte, e principalmente para a adoção e monitoramento de medidas de controle. A identificação da espécie do microrganismo é feita por meio de cultura microbiológica em laboratório especializado (FONSECA & SANTOS, 2000) Contagem de Células Somáticas Mastite é a inflamação da glândula mamária e pode ser causada por muitos microrganismos (LANGONI, 1999), podendo se manifestar na forma clínica ou subclínica (COSTA & WATANABE, 1999). O termo células somáticas do leite é utilizado para designar todas as células presentes no mesmo, incluindo as de origem sangüínea (leucócitos) e as de descamação do epitélio glandular secretor. No entanto, em uma glândula mamária infectada, as células de defesa correspondem de 98 a 99% das células encontradas no leite (PHILPOT, 2002). Desse modo, a contagem de células somáticas (CCS) do leite indica, de maneira quantitativa, o grau de infecção da glândula mamária (MACHADO et al., 2000). A invasão da glândula mamária por microrganismos é seguida de um aumento do número de leucócitos no leite, a maioria, neutrófilos polimorfonucleares (BURVENICH et al., 1995). Essas células fazem parte dos mecanismos naturais de defesa do animal, migram da corrente circulatória para

22 16 a glândula mamária e são designadas de células somáticas do leite. O principal fator que influencia o aumento das células somáticas no leite é o estado infeccioso (HARMON, 1994). Outros fatores como estádio de lactação, idade do animal, estação do ano e vários tipos de estresse podem influenciar a contagem de células somáticas (CCS) mas não têm tanta importância se não ocorre infecção da glândula mamária (HARMON, 1994). A determinação da CCS no leite é um método convencional e amplamente usado para o diagnóstico da mastite subclínica em regiões de pecuária leiteira desenvolvida. É também o parâmetro mais empregado para avaliação da qualidade higiênica do leite, além de ser um instrumento valioso para avaliação e monitorização da mastite nos rebanhos (HEESCHEN & REICHMUTH, 1995). Atualmente não existe regulamentação para a CCS no leite para o comércio internacional. Entretanto, muitos países têm adotado limites máximos de células somáticas como parte de seus padrões nacionais de regulamentação, visando preservar a qualidade higiênica do leite. No Brasil, a Instrução Normativa 51/02 que regulamenta o Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite estabelece o limite de 1 milhão de células/ml ate 01/07/08, reduzindo para 750 mil, em 01/07/20. A CCS no leite de animais individuais ou de tanque é uma ferramenta valiosa na avaliação do nível de mastite subclínica no rebanho, na estimativa das perdas quantitativas e qualitativas de produção do leite e derivados, como indicativo da qualidade do leite produzido na propriedade e para estabelecer medidas de prevenção e controle da mastite (FONSECA & SANTOS, 2000).

23 17 Segundo KITCHEN (1981), o leite obtido de quartos mamários de animais sadios contém de 50 a 200 mil células/ml. Na dependência da severidade e extensão da infecção e, do tipo de microrganismo envolvido, as contagens podem variar de 200 a x 103 células/ml de leite. EBERHART et al. (1984), verificaram uma diminuição de 6% na produção de leite, em rebanhos com CCS no leite de tanque de /mL, 18% em contagens de /mL e de 29% em contagens de /mL. Contagens iguais ou inferiores a células/ml/leite foram consideradas normais, não acarretando maiores prejuízos ao produtor. PHILPOT e NICKERSON (1991), observaram uma diminuição na produção variando de 5% a 25% com a CCS entre a células/ml/leite. Além do aumento do número de células, a mastite provoca alterações nos três principais componentes do leite, gordura, proteína e lactose. Enzimas e minerais também são afetados. A extensão do aumento da CCS e as mudanças na composição do leite estão diretamente relacionadas com a superfície do tecido mamário atingido pela reação inflamatória. Portanto há uma relação direta entre a CCS e a concentração dos componentes do leite (SCHÄELLIBAUM, 2000). Em relação as proteínas ocorre uma redução naquelas sintetizadas na glândula mamária (á e â caseína, á-lactoalbumina e â-lactoglobulina) e aumento das proteínas de origem sangüínea (albumina sérica e imunoglobulinas), em virtude do aumento de permeabilidade vascular secundário ao processo inflamatório (KITCHEN, 1981). A proteína total do leite tem pouca variação, mas a concentração de cada tipo de proteína varia acentuadamente.

24 18 Os dados de literatura mostram dados contraditórios em relação aos teores de gordura no leite com aumento na CCS. Normalmente existe tendência de queda na concentração de gordura à medida que aumentava a CCS. Nos casos em que a produção de leite diminuiu em uma proporção maior que a síntese da gordura, a percentagem de gordura aumenta em animais com altas CCS em função do efeito da concentração. A mastite, acompanhada de altas CCS, está associada a diminuição da concentração de lactose no leite (HARTMANN, 2002). O potássio, mineral predominante no leite, decresce devido ao dano celular, enquanto há uma elevação nos níveis de sódio e cloro que passam do sangue para o leite (KITCHEN, 1981; HARMON, 1994; PEREIRA et al., 1999; SCHÄELLIBAUM, 2000). A contagem de células somáticas é influenciada por vários fatores, mas especialmente pela presença de infecções intramamárias, tornando-se um indicador bastante confiável de sanidade da glândula mamária. Outros fatores que podem interferir na CCS são a época do ano, raça, estágio de lactação, produção de leite, número de lactações, estresse causado por deficiências no manejo, problemas nutricionais, efeito rebanho, condições climáticas e doenças intercorrentes (VIANA, 2000; OSTRENSKY, 1999) California Mastitis Test O "California Mastitis Test" (CMT) é usado mundialmente para o diagnóstico da mastite subclínica, tendo a vantagem de poder ser empregado no próprio rebanho, no momento em que os animais são ordenhados. A interpretação do CMT se baseia na observação visual do leite após ser

25 19 misturado ao reagente. A reação se processa entre o reagente e o material genético das células somáticas presentes no leite, formando um gel, cuja concentração é proporcional ao número de células somáticas. O resultado do CMT é dado como negativo (0 ou neg), suspeito (+-), fracamente positivo (+), positivo (++) e fortemente positivo (+++). Os escores do CMT apresentam correlações variadas com a CCS (PHILPOT & NICKERSON 1991, QUINN et al., 1994). Tem-se questionado a interpretação do CMT como instrumento de diagnóstico da mastite subclínica, por ser um teste subjetivo que produz resultados falso-positivos ou falso-negativos, e considerando-se a definição de "doença" em função dos mesmos parâmetros adotados para a CCS (MARTIN et al., 1994, CASURA et al., 1995). Indiretamente, o número de leucócitos pode ser determinado pelo CMT, que se baseia na reação de um detergente aniônico adicionado de púrpura de bromocresol que, misturado ao leite, desenvolve geleificação e modificação da cor do indicador nos casos de mastite subclínica. A reação do CMT é proveniente da ação do reagente sobre as células somáticas presentes no leite, que se torna gelatinoso devido à liberação do ácido desoxiribonucléico (DNA), presente no núcleo dessas células. Desta maneira, quanto maior a quantidade de células, mais forte é a reação (EMBRAPA, 1984). O CMT é um bom teste para avaliar a sanidade da glândula mamária (THIERS et al., 1999). Mesmo nas regiões onde os métodos automatizados são disponíveis, o CMT continua a ser um instrumento importante para avaliação de quartos mamários individuais, pelas vantagens de fornecer resultados imediatos, ser prático e ter baixo custo (CASURA et al., 1995, ENEVOLDSEN et al., 1995). O

26 20 CMT apresenta, entretanto, o inconveniente da subjetividade e, por não ser patognomônico, sujeito a produzir resultados falso-positivos e falso-negativos (MARTIN et al., 1994). Os resultados obtidos com os testes de especificidade comprovam os dados obtidos por CASURA et al. (1995) e são justificados por MARTIN et al. (1994), que demonstraram ser a especificidade mais alta à medida que o limite crítico é definido menos rigidamente. Outras vantagens do uso do CMT são possibilitar a identificação de animais sob risco, selecionar amostras para exame laboratorial e servir de base para a organização de linhas de ordenha em rebanhos comprometidos (PHILPOT & NICKERSON, 1991). O uso regular do CMT pode contribuir para melhorar o estado sanitário dos rebanhos, se os dados obtidos forem usados para orientar a adoção de medidas para o controle da mastite e se forem associadas práticas adequadas de manejo e higiene. Contudo, dependendo da interpretação dada ao teste, pode-se colocar em risco programas de controle da doença pela possibilidade de se identificar um número considerável de animais ou quartos mamários doentes como normais. Como tem sido comprovada uma correlação positiva entre animais reagentes ao CMT e a presença de infecção, mesmo para as reações consideradas suspeitas. Os resultados obtidos são fundamentais para a compreensão dos problemas específicos dos rebanhos, para orientar medidas racionais de controle da mastite e sugerir alterações a respeito do manejo adotado (RADOSTITIS et al., 1994; BRAMLEY et al., 1996). As questões individuais a serem respondidas em cada rebanho direcionam, em geral, o tipo e a quantidade de amostras de leite a serem

27 21 avaliadas. Estas podem ser originadas de todas as vacas em lactação, somente dos casos clínicos, ou dos quartos mamários com contagens de células elevadas (ou com escores positivos no Califórnia Mastite Teste) (SEARS et al., 1993; BRAMLEY et al., 1996). Podem também representar amostras compostas dos quatro quartos mamários de uma vaca ou serem obtidas do leite total da fazenda (leite do tanque) (SEARS et al., 1993; BRITO et al., 1998). Este último grupo de amostras atenderá a programas de monitoramento de rebanhos, detectando a presença de patógenos específicos e têm a vantagem de limitar custos com exames laboratoriais (SEARS et al., 1993; BRAMLEY et al., 1996).

28 22 3 MATERIAIS E MÉTODOS O presente trabalho de pesquisa foi realizado em 25 rebanhos leiteiros, localizados na Zona Rural do Município de Garuva, do Estado de Santa Catarina. Os rebanhos apresentavam características diversas quanto a raça, grau de sangue, produção de leite, construções, tipo e manejo de ordenha. O número total de vacas em lactação desses rebanhos era de 264 animais com uma media de 8,5 litros e uma produção total de litros no dia da coleta. Somente em 5 rebanhos haviam 15 ou mais vacas em lactação. Nos dias 25/02/07 e 02/04/07 foram coletadas amostras de leite total de 25 propriedades e uma amostra geral do tanque para a realização do exame de contagem de células somáticas no Laboratório do Programa de Análise de Rebanhos Leiteiros da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa (APCBRH). Para coletar as amostras de leite para CCS, primeiro foi homogenizado todo leite, em seguida foram usados um coletor de amostras tipo concha na quantidade de leite conforme a marca existente no frasco, respeitando um mínimo da 2ª tarja e um máximo da 3ª tarja do frasco. Não enchemos o frasco até a borda superior, pois o leite tem a característica de separar a gordura, e a mesma poderá aderir na tampa do frasco, além de dificultar a homogeneização da amostra antes da análise. Fechamos o frasco imediatamente e colocamos na caixa isotérmica com gelo para manter a temperatura abaixo de 5º Celsius. Como este levantamento vai fazer parte de um programa de educação sanitária aos pecuaristas de leite, duas propriedades piloto com CCS acima de 1.000,000 foram escolhidas para realização do levantamento individual de

29 23 rebanho através do teste CMT, de acordo com LANGENEGGER et al.,1970 no dia 01 e 02/03 pela ordenha da tarde. A introdução de novas rotinas de manejo nestas duas propriedades foi realizada através da participação e discussão com os pecuaristas, finalizando de acordo com o melhor manejo conforme as condições do proprietário. Foram coletadas no dia 20/03/07 amostras de leite para exames microbiológicos dos mesmos rebanhos e propriedades com mais uma amostra total do tanque, essas as amostras de leite total foram enviadas para o Laboratório de Microbiologia da Universidade Tuiuti do Paraná. As amostras de leite eram homogeneizadas e posteriormente, uma alíquota de 0,01mL era semeada na superfície de ágar MacConkey e ágar Sangue ( Blood ágar base - Difco ) sangue bovino a 5% e incubados em estufa bacteriológica a 37º C, sendo as leituras efetuadas após 24 e 48 horas de incubação. Inicialmente observaram-se as características morfológicas das colônias como tamanho, tipo, coloração e presença de hemólise. Para confirmação dos resultados foram semeadas as culturas do ágar Sangue para o Manitol e em estufa bacteriológica a 37º C, sendo as leituras efetuadas após 24 horas de incubação. O crescimento bacteriano do ágar MacConkey foi transferido para Kits para Identificação Microbiana, com maior exatidão, rapidez e segurança em seus resultados. Os kits Newprov se destinam a identificação de Enterobactérias e bacilos gram negativos não-fermentadores da glicose (grupo dos Pseudomonas spp, Acinetobacter spp, Burkholderia spp, entre outros).

30 24 Os kits para Enterobactérias, disponíveis na forma tradicional ou miniaturizada constituem-se de cinco diferentes tubos, onde é possível obter a leitura de dez provas bioquímicas. As provas positivas somadas equivalem a um determinado número existente num catálogo de identificação, com diferentes percentuais de acerto, desta maneira é possível à identificação com maior exatidão. O kit para identificação de não-fermentadores propicia a identificação rápida e de maneira eficaz. Para efeito de triagem bioquímica existem disponíveis os meio de EPM e Mili na forma tradicional ou miniaturizada. Estes são indicados para a maioria das Enterobactérias a prática é usada na maioria dos isolados clinicamente importantes.

31 25 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A amostra de tanque representa o pool de leite colhido de todas as propriedades em caminhão isotérmico. Conforme verifica-se na Tabela 1, a amostra do tanque apresentou CS/ml, padrão atualmente em conformidade ao preconizado pela Instrução Normativa 51/02. De 25 propriedades, 5 produtores (20%) (Tabela 1) estão com contagem acima de CS/ml e precisam ser notificados pelo Serviço de Inspeção Municipal. Como a Instrução Normativa 51/02 preconiza contagem de CCS máxima de a partir de 01/07/08, observamos pela Tabela 1 que 20 produtores (80%) estão de acordo com essas futuras exigências. A media de CCS dos tanques, realizado pelo Laboratório do Programa de Análise de Rebanhos Leiteiros da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa (APCBRH), no ano de 2006, realizada em amostras, foi de CS/ml.

32 26 TABELA 1: O RESULTADO DO EXAME DE CCS DO LEITE NA PRIMEIRA COLETA: PROPRIEDADES CCS 02/2007 (x1000/ml) TANQUE 882 As propriedades 7 e 15 foram escolhidas como propriedades piloto pela alta CCS (propriedades 7 = e 15 = ) que essas apresentavam, e vão servir como referência na difusão das técnicas de manejo para o programa de combate a mastite. Os resultados do levantamento de CMT estão dispostos na Tabela 2, e confirmam a correlação positiva entre CCS e CMT, como são relatados por (BRITO et al., 1997 e VIANNI et al., 1990).

33 27 TABELA 2: LEVANTAMENTO DE CMT PROPRIEDADES PILOTO: Produtores 7 15 Nº de animais Nº de quartos testados Total de animais com CMT positivo 13 4 % de animais positivo 50% 40% Nº quartos com CMT positivo % de quartos CMT positivo 24% 30% Nº de quartos com mastite clínica CCS amostra tanque 1 coleta DELLA LIBERA et al. 2001, e HARMON 1994, associam alta CCS com porcentagens de quartos mamários atingidos por infecções crônicas estipulando esses em 20 a 40% em CCS acima de percentual esse verificado nesse levantamento. Foram introduzidas as seguintes sugestões de manejo; Produtor 7: tratamento de um animal com mastite clínica, cinco animais próximos ao período de secagem foram retirados da ordenha e tratados com antibióticos de longa ação para vaca seca, três animais que estão no terço médio de lactação foram deixados por ultimo na ordenha e seu leite destinado na alimentação dos bezerros, os outros quatro animais que apresentavam boa produção leiteira continuaram na ordenhadeira e receberam tratamento com probióticos intramamários. Outra técnica introduzida foram a imersão dos tetos após a ordenha. Produtor 15: tratamento de um animal com mastite clínica, duas vacas com fase final de lactação foram retiradas da ordenha e tratadas com antibiótico de longa ação intramamária. Este produtor por fazer aleitamento dos bezerros diretamente nas vacas não quis utilizar produto de imersão nos tetos, mas aderiu a mudança do manejo da limpeza da ordenhadeira, pois não utilizava detergentes específicos para essa prática e nem utilizava escovas

34 28 apropriadas para lavagem das teteiras, este passou a utilizar detergentes ácidos e bases. O resultado do exame microbiológico das 26 amostras de leite provenientes dos 264 animais estudados, estão apresentados na tabela 3, demonstrou que as bactérias do gênero Escherichia coli foram isoladas de 24 amostras, correspondendo a 93% do total dos agentes isolados, apresentados na tabela 4 as porcentagens de isolamento bacteriano. Normalmente estes agentes foram isolados com maior freqüência em vacas com mastite clínica. Embora existam algumas divergências com relação à freqüência de bactérias isoladas no leite de vacas com mastite clínica e subclínica relatada na literatura (LONGO et al., 1994; VIANNI et al., 1992; COSTA et al., 1995). Escherichia coli continua sendo um agente freqüentemente isolado neste tipo de infecção, representando grande importância epidemiológica e clínica nas mastites bovinas. Segundo RUEGG 2004, em muitos rebanhos, as bactérias gram negativas são responsáveis pelo grande percentual de mastite clínica e em amostras de leite coletadas apenas de vacas que não apresentavam sinais sistêmicos da doença (tais como febre, anorexia, dor) foram isolados coliformes em 44,3% dos casos, enquanto que Streptococcus ambientais 33,6%, Stafilococcus coagulase negativa 18,3% e varias outras bactérias 3,8% foram os responsáveis pelos casos restantes. Verificou-se o isolamento do Staphylococcus aureus com freqüência relativamente alta (76%) no leite total dos animais estudados. Estes achados estão de acordo com a citação feita por COSTA et al. 1995, que relataram o

35 29 isolamento de 81,77% deste agente no leite. Geralmente é isolado em menos de 1% dos quartos quando se adotam pré e pós dipping. Esta observação foi condizente com as condições observadas nas propriedades visitadas que geralmente não adotavam medidas higiênicas no pré e pós ordenha das vacas. Staphylococcus spp também teve percentual considerável nos isolamentos (12%), e deve ser considerado, uma vez que pode estar envolvido em casos de mastite clinica a crônica, fatal a produção de leite. Foram poucas as amostras de leite total com a presença da Salmonella enteritidis spp. e do Micrococcus mas devemos ressaltar a sua importância, principalmente por ser agentes bacterianos transmissíveis e prejudiciais ao homem. Estes resultados estão expostos na Tabela 3 e na Tabela 4 com suas porcentagens.

36 30 TABELA 3: RESULTADOS DO EXAME MICROBIOLÓGICO DAS AMOSTRAS DE LEITE TOTAL: PROPRIE- TIPOS DE BACTÉRIAS ISOLADAS DADE 1 E. coli S.aureus 2 E. coli Streptococcus 3 E. coli 4 E. coli Streptococcus 5 E. coli S.aureus 6 E. coli S.aureus 7 E. coli S.aureus 8 E. coli S.aureus 9 E. coli S.aureus 10 E. coli S.aureus 11 E. coli S.aureus 12 E. coli S.aureus 13 E. coli S.aureus 14 E. coli S.aureus 15 E. coli Micrococcus 16 E. coli S.aureus 17 E. coli Streptococcus 18 E. coli S.aureus 19 E. coli S.aureus 20 E. coli S.aureus 21 E. coli S.aureus 22 E. coli 23 E. coli S.aureus 24 S.aureus Salmonella 25 S.aureus Salmonella tanque E. coli S.aureus TABELA 4: PORCENTAGENS DE ISOLAMENTO BACTERIANO: Bactéria Isolada Número de Propriedades Porcentagem Isolamento Escherichia coli 23 93% Staphylococcus aureus 19 76% Streptococcus spp 3 12% Salmonella enteritidis 2 8% Micrococcus 1 4%

37 31 Segundo FERREIRO (1978), o Staphylococcus aureus é provavelmente o agente mais isolado em casos de mastite. BRITO et al. (1999), fizeram um levantamento do padrão de infecção intra mamária em 48 rebanhos leiteiros perfazendo um total de 1609 vacas leiteiras na Zona da Mata e Campo das Vertentes em Minas Gerais e considerando o total de isolamento, encontraram Staphylococcus aureus 19,2%; Staphylococcus spp. coagulase negativa 12,4%; Streptococcus agalactiae 6%; Streptococcus spp. escolina positiva 4%; Streptococcus spp. escolina negativa 2,1%; Corynebacterium 55,2%; leveduras 0,1%; Pseudomonas spp. 0,1%. Outros trabalhos em que se examinaram amostras de leite originarias de 43 fazendas leiteiras (LANGENEGGER et al., 1970, HARROP et al., 1975), 118 (FERREIRO et al.,1981) mostraram o mesmo padrão encontrado por BRITO et al., (1999). No período de , foram examinadas 702 amostras de leite bovino com mastite subclínica, pelo Serviço de Diagnóstico Microbiológico do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnica - UNESP - Campus de Botucatu. Isolaram-se 802 microrganismos em cultura pura e em associaçäo, como se segue: Staphylococcus aureus 35,53%, Staphylococcus epidermidis 23,19%, Corynebacterium bovis 9,23%, Corynebacterium pyogenes 4,49%, Streptococcus uberis 4,36%, Streptococcus dysgalactiae 3,37%, Candida albicans 3,37%, Streptococcus agalactiae 3,24%, Escherichia coli 2,87%, Pseudomonas aeruginosa 2,37%, Klebsiella sp 2,12%, Alcaligenes faecalis 2,0%, Proteus mirabilis 1,37%, Pasteurella multocida 1,25%, Micrococcus sp 0,37%, Salmonella sp 0,25%, Acinetobacter calcoaceticus 0,25%, Nocardia asteroides 0,25% e Enterobater aglomerans 0,12%. Pelo estudo de sensibilidade bacteriana verificou-se que os

38 32 estafilococos foram os microrganismos isolados com maior freqüência (58,72%). Analisando o segundo levantamento do CCS, realizado 30 dias após a primeira contagem, depois do tratamento instituído para os dois produtores piloto, conforme mostrado a Tabela 5, verificamos uma acentuada redução na CCS dos produtores 7 e 15, bem como na amostra agranel do caminhão tanque. TABELA 5: O RESULTADO DO EXAME DE CCS DO LEITE SEGUNDA COLETA: SEQÜENCIA CCS 04/2007 (x1000/ml) TANQUE 541

39 33 RENEAU 1986, e HARMON afirmam que o principal fator que influencia no aumento da CCS do leite é a mastite e apesar de outros fatores como, período de lactação, idade do animal, estação do ano e outros tipos de estresse poderem influenciar na CCS, eles não possuem tanta importância como a infecção na glândula mamária. As diferenças entre manejos e tipos de ordenha são refletidas na CCS e no CMT (BARBOSA, 2002). Rebanhos com boa técnica de ordenha, desinfecção de tetas pré e pós ordenha, secagem adequada de vacas, tratamento com antibiótico para mastite clínica, além de preocupação com higiene e suplementação mineral adequada demonstram baixos índices de mastite e proporcionalmente baixas CCS e reações negativas ou baixas no CMT (BARKEMA et al., 1998). Outro aspecto importante a se considerar está diretamente relacionado com as condições precárias de higiene dos animais, instalações e ambiente onde é realizado a ordenha, com a alta prevalência das mastites subclínicas. Estas, segundo DODD (1993), ocorrem com maior freqüência que a mastite clínica e causam grandes prejuízos econômicos devido à queda na produção de leite pela atrofia do epitélio secretor glandular. Os resultados obtidos neste estudo concordam com a citação feita por FAGLIARI et al. (1993), que observaram aumento considerável no grau de concordância entre o CCS e o exame bacteriológico, quando o escore deste teste era mais alto. Após todo esse estudo das propriedades foi realizada uma palestra de educação sanitária para esses produtores de leite, apresentando como

40 34 exemplos as duas propriedades piloto, a propriedade 7 e 15, que obtiveram valores maiores de CCS. Esse programa teve o intuito de mostrar formas práticas para esses criadores devido suas condições precárias de renda, foi discutido formas de prevenção, controle, e possíveis tratamentos. Também foram apresentadas as mudanças após a implantação do estudo nas duas propriedades, mostrando visivelmente sua melhora, assim melhorando a qualidade do leite, os produtores poderão obter uma margem maior de lucros.

41 35 5 CONCLUSÃO Concluímos que os resultados encontrados de 93% das propriedades com agente ambiental E. coli e 76% das propriedades com agente contagioso S. aureus, ocorreu devido às condições inadequadas de manejo e ao local propicio para o desenvolvimento fácil desses agentes. Esta é uma doença de manejo e para se fazer uma prevenção adequada, é preciso considerar todo o manejo da propriedade. Quando os índices desta doença se elevam, significa que uma ou mais ações dentro do manejo estão sendo executadas de forma inadequada. Vale ressaltar que as mastites ambientais são esporádicas e podem acometer qualquer dos animais em lactação. A sanidade do rebanho é fundamental para o controle da mastite, devese manter as vacas em ambiente limpo e seco, realizar o controle contra insetos, roedores e outros animais que podem ser prejudiciais, fornecer água de boa qualidade, manter os equipamentos de ordenha desinfetados tanto manual quanto a ordenhadeira, realizar o pré e pós dipping dos quartos mamários, adotar procedimentos de controle na hora da ordenha, manter a vaca em pé após a ordenha, tratar os casos clínicos com antibiótico de infusão intramamária, descartar as vacas com infecção crônica, assim reduzindo os riscos de novas infecções em outras vacas, diminuindo o nível de infecção no rebanho e diminuindo a CCS do tanque de leite. Também devem ser realizados alguns testes que podem auxiliar no diagnóstico e controle da mastite. O CMT (California Mastitis Test) é um teste que pode ser realizado na sala de ordenha sendo muito prático. A CCS

42 36 (Contagem de Células Somáticas) é um exame laboratorial realizado pela APCBRH que auxilia na análise do leite. A CCS e o CMT possuem alta correlação no diagnóstico de mastite em vacas em lactação. A identificação dos agentes da mastite é realizada por meio de culturas essa identificação é importante para a implementação de métodos de controle e prevenção e para o monitoramento de rebanhos. Podem ser realizados com menor freqüência, porém é um exame que identifica o agente causador da mastite com precisão para o tratamento.

43 37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APCBRH/PARLPR Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa e Programa de Análise de Rebanhos Leiteros do Paraná. Contagem de Células Somáticas dos Tanques em disponível em: Acesso em: 11. abr BARBOSA, C. P., BENEDETTE, E., RIBEIRO, S. C. A., GUIMARÃES, E. C. Relação entre Contagem de Células Somáticas (CCS) e os resultados da California Mastitis Test (CMT), no diagnóstico de mastite bovina. Biosci J. v.18. n.1. jun p BARKEMA, H. W., SCHUKKEN, Y. H., LAM, T. J. G. M., BEIBOER, M. L. BRAND, A. BENEDICTUS, G. Management practices associated with low, medium and high somatic cell counts bulk milk. Journal of Dairy Science. Champaign. v.81. n p BENITES, N. R. Estudo dos aspectos microbiológicos e histopatológicos da mastite infecciosa bovina. São Paulo, p. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. BRAMLEY, A. J., CULLOR, J. S., ERSKINE, R. J., FOX, L. K., HARMON, R. J., HOGAN, J. S., NICKERSON, S. C., OLIVER, S. P., SMITH, K. L. & SORDILLO, l. M. Current concepts of bovine mastitis. National Mastitis Council. Madison p.1-3. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa. N.51/02. Diário Oficial da União. Brasília, DF. 15. ago secção 1. p.2-4.

44 38 BRITO, J. F. R., CALDEIRA, G. A. V., VERNEQUE, R. S., PAIVA & BRITO, M. A. V. Sensibilidade e especificidade do Califórnia Mastitis Test como recurso diagnóstico da mastite subclínica em relação à Contagem de Células Somáticas. Pesquisa Veterinária Brasileira. Coronel Pacheco. v. 17. n.2. abr/jun p BRITO, M. A. V. P, BRITO, J. R. F., SOUZA, H. M. et al. Avaliação da sensibilidade da cultura de leite do tanque para isolamento de agentes contagiosos da mastite bovina. Pesquisa Veterinária Brasileira. v p BRITO, M. A. V. P., BRITO, J. R. F., RIBEIRO, M. T., VEIGA, V. M. O. Padrão de infecção intramamária em rebanhos leiteros: exame de todos os quartos mamários das vacas em lactação. Arq. Brasileiro Medicina Veterinária e Zootecnia. v.51. n.2. Belo Horizonte. Abr BURVENICH, C., GUIDRY, A. J. & PAAPE, M. J. Natural defence mechanisms of the lactating and dry mammary gland. Proc. IDF Int. Mastitis Seminar. Tel Aviv p CASURA, C., SCHUKKEN, Y. H. & RÜSCH, P. Quality assessment of California mastitis test as a diagnostic tool in quarter somatic cell count estimation. Proc. IDF Int. Mastitis Seminar. Tel Aviv p COLDEBELLA, A. Contagem de Células Somáticas e Produção de Leite em Vacas Holandesas Confinadas. Dissertação (Mestrado). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. USP. Piracicaba p COSTA, E. O., BENITES, N. R., MELVILLE, P. A. et al. Estudo etiológico da mastite clínica bovina. Revista Brasileira Medicina Veterinária. v p