ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

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1 Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: reagents@sanquin.nl Website: M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 Dispositivo ELISA que permite uma determinação quantitativa das subclasses de IgG humana no soro (pt) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL pt Anticorpos contra Preto Tampão Calibrador Conjugado Controlo DIL GREEN HRP HUM HO MOU pt Diluição Verde HRP Humano Peróxido de hidrogénio Rato RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS pt Vermelho Selos para placas Stock Stop Subclasses Substrato WASH WELL YELLOW pt Lavagem Cavidades Amarelo Gama ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS

2 pt I. INTRODUÇÃO A IgG humana abrange quatro subclasses: IgG, IgG, IgG e IgG. As características bioquímicas das subclasses de IgG têm sido objecto de descrição exaustiva (5). As diferenças entre as subclasses de IgG reflectemse em várias funções biológicas importantes, tais como o reconhecimento de antigénio, a activação do complemento e a ligação aos receptores de superfície celular. Muitos estudos revelaram que as anomalias nos níveis de soro das subclasses de IgG podem estar associadas a várias formas de doença. Particularmente bem documentada tem sido a associação da deficiência selectiva da subclasse IgG ao aumento de susceptibilidade às infecções virais ou bacterianas (, 5). Foram relatados níveis séricos baixos de IgG ou IgG em pacientes com infecções recorrentes das vias respiratórias superiores e inferiores. Por outro lado, foi igualmente encontrada uma associação entre concentrações séricas muito baixas de IgG e infecções recorrentes sinopulmonares (). Foram igualmente observadas anomalias nos níveis séricos de subclasses de IgG em doenças autoimunes, perturbações neurológicas e infecções por VIH (). II. PRINCÍPIO TÉCNICO O dispositivo PeliClass ELISA para subclasses humanas é um teste imunológico enzimático do tipo sandwich. O dispositivo contém tiras de microrecipientes forrados com anticorpos monoclonais de elevada avidez, cada um deles específico para uma das subclasses humanas de IgG. As amostras a testar e os soros de calibragem e de controlo são incubados nos respectivos recipientes. A subclasse de IgG a determinar ligarseá à fase sólida e a IgG não ligada será removida por lavagem. Seguidamente, o antisoro antihumano IgG peroxidase conjugado é adicionado a cada recipiente e o conjugado não ligado é removido por lavagem. Após incubação com solução substrato (ABTS) e HO, a reacção é parada com um tampão ácido. O produto de reacção de cor verde é medido por absorvência e a concentração da subclasse de IgG na amostra a testar é calculada em relação aos valores da curva de referência. O soro de controlo da subclasse de IgG é ensaiado para testar a validade das curvas de calibração e a exactidão das determinações das subclasses de IgG. Os níveis das subclasses de IgG no(s) calibrador(es) foram determinados utilizando um calibrador derivado da preparação referência da OMS 7/97. Utilizaramse os valores alvo recomendados de 5,0 g/l para a IgG;, g/l para a IgG; 0, g/l para a IgG e 0,5 g/l para a IgG (7). III. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O dispositivo PeliClass ELISA de subclasse humana deve ser armazenado a uma temperatura entre e 8 C e ser mantido na posição vertical. Poderá ser utilizado até à expiração do prazo de validade constante do rótulo. Tendo em conta a estabilidade de todos os componentes, o prazo de validade após a abertura é de semana, quando armazenado a uma temperatura entre e 8 C. As condições de transporte podem diferir das condições de armazenamento. IV. CONTEÚDO DO DISPOSITIVO Consultar o quadro incluído no começo do folheto na embalagem. O dispositivo PeliClass ELISA de subclasse humana contém reagentes suficientes para 8 testes para cada subclasse, incluindo calibradores, controlos e reagentes em branco. Os anticorpos monoclonais foram purificados a partir de meio de cultura de tecido, utilizando cromatografia de coluna (troca de iões e cromatografia por afinidade). O calibrador e o soro de controlo são soros hum líquidos. V. MATERIAIS ADICIONAIS NECESSÁRIOS Água destilada para diluição de tampões de lavagem, diluição e substrato. Dispositivos de pipetagem para uma distribuição exacta de volumes. Uma incubadora (7 ± C). Um dispositivo de lavagem standard ELISA ou uma garrafa de esguicho de 500 ml, em plástico, para a lavagem automática ou manual das tiras. Um leitor ELISA standard para a medição da absorvência aos nm ou 05 nm. Papel milimétrico. VI. MANIPULAÇÃO DA AMOSTRA A TESTAR Apenas devem ser testadas amostras de soro. As amostras devem ser tão frescas quanto possível ou ser armazenadas por congelação. As amostras devem ser diluídas manualmente antes de serem utilizadas (consultar Vll PROTOCOLO DE ENSAIO). VII. PROTOCOLO DE ENSAIO Aguardar até que todos os reagentes estejam à temperatura ambiente (85ºC) e misturar bem. Evitar a formação de bolhas ou espuma. Recomendamos que todas as diluições de amostras, controlos e calibradores sejam testadas em duplicado.. PLACA DE MICROTITULAÇÃO O dispositivo PeliClass ELISA para subclasses de IgG humana permite a flexibilidade de utilizar placas parciais em ocasiões distintas. Previamente à abertura da bolsa de plástico, determinar a quantidade de tiras necessárias para testar o número de amostras desejado, mais recipientes para testar em duplicado os calibradores, os controlos e os reagentes em branco. Retirar as tiras que não forem usadas do suporte da placa e voltar a colocálas na bolsa de plástico com exsicante; armazenar a uma temperatura entre e 8ºC.. PREPARAÇÕESTAMPÃO Tampão de lavagem: Preparar o tampão de lavagem adicionando o conteúdo total do frasco do concentrado de tampãolavagem em 950 ml de água destilada. O tampão de lavagem diluído deverá ser armazenado a uma temperatura entre 8 C e permanece estável durante semana. Nota! O tampão concentrado pode conter cristais de sal. Antes de preparar o tampão de titulação de trabalho, aquecer o tampão concentrado BREVEMENTE até atingir 7ºC, a fim de dissolver os cristais. Tampão de diluição: Calcular a quantidade de tampão de diluição necessária (aproximadamente ml de tampão não diluído por tira de microrecipiente) e preparar uma solução de titulação de trabalho diluindo 0 vezes o tampão em água destilada.

3 . PREPARAÇÃO DO CALIBRADOR E DOS SOROS DE CONTROLO Para informações sobre as concentrações, consultar os Quadros e no folheto da embalagem. Calibrador: (Consultar o Quadro no folheto da embalagem) Rotular um tubo de 0 ml com :500 e oito tubos de ml tubos com Cal a Cal8 respectivamente. Pipetar,99 ml de tampão de diluição para o tubo de 0 ml e adicionar 0 µl de soro do calibrador (diluição inicial :500). Pipetar,9 ml de tampão de diluição para o tubo rotulado com Cal e,0 ml para os tubos rotulados com Cal Cal8. Pipetar 00 µl de calibrador diluído a :500 para o tubo Cal e, a partir deste tubo, preparar sete séries de diluições em duplicado, adicionar,0 ml da diluição prévia ao tubo seguinte rotulado com Cal. Seleccionar para cada subclasse de IgG as séries de diluições de calibrador: IgG : : IgG, IgG e IgG :0.000 : Controlo: Rotular um tubo com :500 e dois tubos de ml com :0.000 (para IgG,, ) e :0.000 (para IgG) respectivamente. Pipetar para o tubo rotulado com :500,99 ml de tampão de diluição e 0 µl de soro de controlo. Pipetar para o tubo rotulado com : µl de tampão de diluição e 5 µl de diluição :500. Pipetar para o tubo rotulado com : µl de tampão de diluição e 5 µl de diluição : Preparar um tubo de ml com ml de tampão de diluição como reagente em branco.. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS Diluir as amostras a testar com tampão de diluição, de acordo com o mesmo protocolo utilizado para o soro de controlo. Para os resultados situados fora das gamas de valores indicadas (ver quadro do folheto informativo incluso), o teste deve ser repetido com uma diluição diferente da amostra a testar. 5. PRIMEIRO PASSO DE LAVAGEM Lavar quatro vezes com tampão de lavagem os microrecipientes necessários no suporte de placa. Para uma lavagem manual, encher por completo os recipientes (> 00 µl) com tampão de lavagem e despejar, repetir este processo três vezes. No final, os recipientes devem ser esvaziados por completo. O reagente subsequente deve ser adicionado de imediato, não devendo os recipientes ser deixados secos por um período de tempo prolongado.. PASSO DA PRIMEIRA INCUBAÇÃO Adicionar 00 µl de calibradores diluídos, de controlos, de amostras e de reagentes em branco nos recipientes apropriados. Cobrir a placa com película aderente, agitar suavemente batendo no bordo da placa de microtitulação durante alguns segundos, para misturar o conteúdo de cada recipiente. Incubar durante hora a 7 C. Imediatamente antes da lavagem, preparar o reagente da incubação seguinte conforme descrito no ponto SEGUNDO PASSO DE LAVAGEM Aspirar o sobrenadante dos recipientes e lavar a placa conforme descrito no ponto INCUBAÇÃO COM ANTICORPO HRPCONJUGADO PARA IgG HUMANA Diluir o conjugado :500 por pipetagem de 0 µl do conjugado para,97 ml de tampão de diluição. Continuar a diluir o conjugado: :000 por pipetagem de, ml da diluição :500 para,0 ml de tampão de diluição. :000 por pipetagem de,0 ml da diluição :500 para,0 ml de tampão de diluição. :000 por pipetagem de,5 ml da diluição :500 para,5 ml de tampão de diluição. Adicionar: 00 µl da diluição :500 nas tiras de microrecipientes antiigg; 00 µl da diluição :000 nas tiras de microrecipientes antiigg; 00 µl da diluição :000 nas tiras de microrecipientes antiigg; 00 µl da diluição :000 nas tiras de microrecipientes antiigg; Cobrir a placa com película aderente, agitar suavemente batendo no bordo da placa de microtitulação durante alguns segundos, para misturar o conteúdo de cada recipiente. Incubar durante hora a 7 C. Imediatamente antes da lavagem, preparar o reagente da incubação seguinte conforme descrito no ponto TERCEIRO PASSO DE LAVAGEM Aspirar o sobrenadante dos recipientes e lavar a placa conforme descrito no ponto INCUBAÇÃO COM SUBSTRATO DE ABTS Calcular a quantidade de solução de substrato (serão necessários aproximadamente 0,9 ml por tira de microrecipiente). Adicionar os equivalentes a 00 µl de solução stock de peróxido de hidrogénio e 00 µl de solução stock ABTS a 0 ml de tampão de substrato de titulação de trabalho ( ml de solução stock de substrato + 8 ml de água destilada). Adicionar 00 µl de solução de substrato a todos os recipientes. Agitar suavemente batendo no bordo da placa de microtitulação durante alguns segundos, para misturar o conteúdo de cada recipiente. Incubar durante 0 minutos à temperatura ambiente (85ºC).. REACÇÃO ENZIMÁTICA DE PARAGEM Adicionar 50 µl de solução de paragem a todos os recipientes.. LEITURA DA PLACA Ler dentro de uma hora a (de preferência) ou 05 nm num leitor ELISA. VIII. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO DOS DADOS Registar a absorvência a (preferencialmente) ou 05 nm para cada recipiente e estabelecer a média dos valores dos duplicados. Para cada amostra, os duplicados não devem divergir mais do que 5% em relação ao valor médio. Se os duplicados apresentarem uma variação superior, o teste deverá ser repetido. Registar as absorvências médias dos calibradores (eixo y) versus a concentração de subclasse correspondente ng/ml (eixo x) no papel milimétrico e desenhar a curva mais adequada. Os níveis das subclasses de IgG no soro de controlo devem situarse dentro da(s) gama(s) de valor(es) indicada(s) no quadro do folheto informativo incluso. Para cada amostra, inserir o valor médio das absorvências na curva referência. As amostras a testar que apresentem uma absorvência média fora da gama de diluições da curva de referência devem ser adequadamente diluídas. Para uma avaliação da concentração das subclasses de IgG numa amostra a testar, comparar os níveis encontrados com os valores normais para as subclasses IgG (ver X GAMAS DE VALORES DE REFERÊNCIA). IX. GAMA DE VALORES DE ENSAIO Consultar o quadro do folheto informativo incluso para informações sobre as gamas de valores de ensaio específicas do dispositivo.

4 X. GAMAS DE VALORES DE REFERÊNCIA Gamas de valores de referência (g/l) para as subclasses IgG em amostras de soro de indivíduos caucasi saudáveis (8). Para outras populações devem ser obtidas gamas de valores de referência distintas. Idade IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPENHO Reprodutibilidade Concentração de subclasse IgG IgG IgG IgG IgG Variação intraensaio (%) Variação interensaio (%) 7 7 b. Comparação do dispositivo PeliClass para subclasses da IgG humana versus Mancini As concentrações IgG, IgG, IgG e IgG nos soros foram determinadas por um ensaio ELISA e comparadas com os valores equivalentes encontrados no Mancini. Constataramse as seguintes correlações: Subclasse IgG Linha de regressão linear Correlação IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Nota: Os valores citados para as características de desempenho específico do teste representam os resultados típicos e não poderão ser considerados especificações para este dispositivo. XII. RESTRIÇÕES. O utilizador deve ter tido treino e estar familiarizado com os testes ELISA e com o procedimento de teste.. As amostras muito hemolisadas ou lipémicas devem ser rejeitadas. Podem ser obtidos resultados inesperados em amostras contendo factor reumatóide, níveis elevados de bilirrubina, ou outros complexos imunes circulantes. Estas amostras devem ser analisadas por outro método.. As amostras que não se enquadrem na gama de valores, por ex. no caso das paraproteínas, devem ser repetidas utilizando diluições diferentes.. O aparecimento dum nível diminuído duma das subclasses de IgG nunca pode fornecer um diagnóstico definitivo, devendo antes ser considerado como uma indicação para uma perturbação do sistema imunitário, exigindo o prosseguimento da investigação diagnóstica. 5. Utilizar sempre soro de controlo para verificar a validade das curvas de calibração. Quando o controlo não se enquadra na gama de valores, os resultados das amostras a testar não são fiáveis. O teste deverá ser repetido.. Os reagentes dos diferentes lotes não são permutáveis. 7. Não se devem misturar restos de reagentes (por ex. volume morto) com os conteúdos de frascos acabados de abrir. 8. As tampas e os frascos não são permutáveis. As tampas devem ser recolocadas nos frascos respectivos. 9. Se bem que o calibrador humano e os soros de controlo tenham sido testados para os marcadores de agentes transmissores de doenças específicas, de acordo com as directrizes da UE em vigor em matéria de Boas Prática Médicas, e tidos como não reactivos, devemse considerar todos os componentes de origem humana como potencialmente infecciosos. 0. Conservante: Thiomersal 0,00%.. Utilizar novos selos para as placas em cada passo de fixação/incubação no ensaio ELISA, a fim de evitar uma contaminação cruzada. Não utilizar folha de alumínio.. Utilizar pontas de pipeta descartáveis para cada transferência, a fim de evitar contaminações cruzadas.. De cada vez que o kit for utilizado, devem ser preparadas diluições frescas de calibradores, conjugados e tampões.. Não utilizar outros reagentes ou tiras de microtitulação para além dos que são fornecidos com o dispositivo. 5. O azido sódico inactiva HRP; não utilizar soluções com teor de azido sódico, nem adicionar azido sódico aos tampões fornecidos.. A eliminação de resíduos deve ser tratada de acordo com o regulamento do seu laboratório.

5 XIII. BIBLIOGRAFIA. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5