CARACTERIZAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS GRAM-NEGATIVOS ISOLADOS DE LEITE CRU

Transcrição

1 CARACTERIZAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS GRAM-NEGATIVOS ISOLADOS DE LEITE CRU M.Z. Waz 1, C. Lampugnani 2, C. Viana 3, M.J. Sereno 4, L.A. Nero 5, L.S. Bersot 6 1 Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: 55 (44) (mykaellazw@gmail.com) 2 Instituto Federal do Paraná - Campus Assis Chateaubriand, CEP: Assis Chateaubriand PR Brasil, Telefone: 55 (44) (camila.lampugnani@ifpr.edu.br) 3 Departamento de Medicina Veterinária Universidade Federal de Viçosa, CEP: Viçosa MG Brasil, Telefone: 55 (44) (cibeli_viana@hotmail.com) 4 Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: 55 (44) (mallusereno@gmail.com) 5 Departamento de Medicina Veterinária Universidade Federal de Viçosa, CEP: Viçosa MG Brasil, Telefone: 55 (31) (nero@ufv.br) 6 Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: 55 (44) (lucianobersot@gmail.com) RESUMO A quantidade e as características dos micro-organismos encontrados no leite são reflexo das condições de ordenha e armazenamento do produto. As bactérias psicrotróficas se multiplicam em baixas temperaturas e podem sintetizar enzimas termoestáveis que causam proteólise da caseína, sendo Pseudomonas o gênero mais predominante. Devido à importância dos micro-organismos psicrotróficos, 233 culturas psicrotróficas isoladas de leite foram selecionadas para verificação de produção de proteases à 21 C e 30 C, avaliação do seu comportamento mesofílico e detecção de Pseudomonas sp. Dentre os isolados, 47,21% foram consideradas proteolíticas em pelo menos uma das temperaturas avaliadas e 47,64% demostraram capacidade de multiplicação à 30 C. Foram confirmadas para Pseudomonas sp., 86,89% das culturas gram-negativas avaliadas, destas 86,79% eram P. fluorescens. Os micro-organismos psicotróficos proteolíticos são importantes deteriorantes de produtos lácteos e medidas que minimizem a contaminação e proliferação dos mesmos devem ser adotadas. ABSTRACT The amount and the characteristics of the microorganisms found in the milk are the reflection of the milking conditions and product storage. The psychrotrophics bacteria multiply at low temperatures, can synthesize thermostable enzymes which causes the proteolysis of the casein, beingpseudomonas the most prevalent genus. Due to the importance of the psychrotrophic microorganisms, 233 psychrotrophic cultures isolated from milk were selected to verify the protease production at 21 C and 30 C, evaluation of its mesophilic behavior and detection of the Pseudomonas sp. Among the isolated samples 47, 21% were considered proteolytic in at least one of the temperatures evaluated and 47,64% showed its capacity to multiply at 30 C. Were confirmed to Pseudomonas sp., 86,89% of gram-negative cultures evaluated, of these 86,79% were P.fluorescens. The proteolytic psychrotrophic microorganisms are important spoilage of dairy and measures to minimize the contamination and its proliferation should be adopted. PALAVRAS-CHAVE: Pseudomonas sp.; proteólise; caseína; refrigeração. KEYWORDS: Pseudomonas sp.; proteolysis; casein; refrigeration.

2 1. INTRODUÇÃO A qualidade do leite cru interfere no processamento, no rendimento e na aceitabilidade dos derivados lácteos (Botaro et al., 2013). Os principais aspectos que afetam a qualidade do leite cru são a incidência de vacas com mastite no rebanho e as condições de higiene e armazenamento durante a produção e o processamento do leite (Forsbäck et al., 2010). O número de micro-organismos no leite é um reflexo das condições de ordenha e armazenamento do produto, diretamente relacionado com o binômio tempo/temperatura em que ele permanecerá desde a ordenha até o processamento (Silveira et al., 2000). Segundo a Instrução normativa nº62 o leite cru deve ser refrigerado ainda na propriedade rural, atingir no máximo a temperatura de 7 C ainda na propriedade, em um período não superior à 3h após o término da ordenha e ser entregue na indústria com no máximo 10 C. O leite deve ser coletado por caminhões providos de tanques isotérmicos e encaminhado aos estabelecimentos industriais para seu processamento (Brasil, 2011). A refrigeração do leite na propriedade e o transporte a granel são medidas cuja implantação visa melhorar a qualidade microbiológica do leite produzido no país com relação às bactérias mesófilas. Entretanto, temperaturas de refrigeração selecionam a microbiota psicrotrófica que continua a se multiplicar nestas condições (Montanhini, 2012). As bactérias psicrotróficas podem se multiplicar em faixas de temperatura de 0 a 20 C, independentemente da temperatura ótima de multiplicação (Marth e Steele, 2001), sendo os principais agentes de deterioração de leite cru refrigerado e de seus derivados. Estes micro-organismos podem sintetizar enzimas termoestáveis que causam degradação do leite e redução do tempo de prateleira dos produtos lácteos (Elmoslemany et al., 2010), especialmente prejudicial para a qualidade do leite UHT devido à sua estocagem à temperatura ambiente por longos períodos de tempo. Outros defeitos causados por essas enzimas incluem alterações de sabor e odor em diversos produtos e redução do rendimento dos queijos (Arcuri et al., 2008). Os micro-organismos psicrotróficos são amplamente distribuídos no ambiente, podendo ser encontrados na água não tratada, no solo, na vegetação e na pele dos tetos e úbere (Elmoslemany et al., 2009). As bactérias psicrotróficas pertencem a diversos gêneros, sendo que as principais encontradas no leite incluem as gram-negativas Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Chromobacterium, Enterobacter, Klebsiella, Acinetobacter e Flavobacterium (Cempírková, 2002; Perin, L.M., et al., 2012). O gênero Pseudomonas é predominante entre os psicrotróficos encontrados no leite (Ercolini et al., 2009), sendo as espécies P. fluorescens e P. putida as mais frequentemente isoladas (Martins et al., 2006). Na fase de crescimento exponencial, em temperaturas de 4 C, estas bactérias sintetizam enzimas capazes de hidrolisar toda a caseína disponível em peptídeos solúveis, que deixam o leite com sabor amargo (Perko, 2011). Sendo evidente a influência dos psicotróficos na qualidade do leite, o estudo teve como objetivo a caracterização dos micro-organismos psicrotróficos isolados de leite cru de propriedades leiteiras da região oeste do Paraná quanto a sua atividade proteolítica, característica mesofílica e detecção de Pseudomonas sp. 2. MATERIAL E MÉTODOS

3 Amostras de leite cru foram coletadas em 50 propriedades leiteiras da região oeste do Paraná entre julho de 2014 e fevereiro de O leite foi coletado de forma asséptica dos tanques de refrigeração (expansão ou imersão) e transportado em caixa isotérmica com gelo até o Laboratório de Inspeção e Controle de Qualidade de Alimentos e Água, LACOMA, da Universidade Federal do Paraná Setor Palotina. As amostras de leite foram submetidas a pesquisa de micro-organismos psicrotróficos segundo a metodologia descrita por Cousin et al. (2001). Após crescimento, cepas foram selecionadas e testadas quanto a produção de proteases, a partir de plaqueamento em gota em placas de Ágar Leite 10% incubadas à 21 C/72h (Marshall, 1992) e 30 C/48h (Montanhini, 2012). A proteólise foi evidenciada pela formação de um halo transparente ao redor da colônia, decorrente da hidrólise de caseína pela enzima produzida pelo micro-organismo. Simultaneamente, as cepas foram semeadas em ágar padrão para contagem e incubadas à 35 C/48 h (Franco e Landgraf, 2003), de modo a observar a ocorrência de comportamento mesofílico das mesmas. Para seleção dos gram-negativos, as cepas não fermentadoras de lactose que cresceram em Ágar MacConkey após incubação à 25 C/48h, foram submetidas à confirmação por coloração de Gram. E apenas os isolados gram-negativos foram submetidos a testes moleculares para detecção de Pseudomonas sp. e Pseudomonas fluorescens. A metodologia de extração do DNA foi adaptada a partir do protocolo de extração do Kit Wizard Genomic DNA Purification para bactérias Gram-negativas. A quantidade de DNA extraído foi avaliada através do equipamento NanoDrop Lite (Thermo Scientific). Foram utilizados dois conjuntos de primers para as reações em cadeia da polimerase (PCR). O primeiro, para confirmação do gênero Pseudomonas, teve como alvo a região 16S descrita por Spilker et al. (2004), sendo eles PA-GS-F (GACGGGTGAGTAATGCCTA) e PA-GS-R (CACTGGTGTTCCTTTATA) cujo produto da amplificação contempla 618 pares de base (pb). O segundo par de primers utilizou-se de uma região 16S descrita por Scarpellini et al. (2004), 16SPSEfluF (TGCATTCAAAACTGACTG) e 16SPSER (AATCACACCGTGGTAACCG) e objetivou a identificação de P. fluorescens, sendo o produto da amplificação de 800pb. Os produtos amplificados nas reações de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, contendo gel Red. Os géis foram fotodocumentados em transiluminador LPIX, Locus. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Conforme apresentado na Tabela 1, das 233 culturas psicrotróficas isoladas, 110 (47,21%) foram consideradas proteolíticas em pelo menos uma das temperaturas a que foram submetidas, sendo que 90 (38,63%) delas apresentaram atividade proteolítica nas duas temperaturas avaliadas. Resultado semelhante ao de outros autores que evidenciaram atividade proteolítica em 40 a 45% das estirpes psicrotróficas avaliadas (Silveira et al., 1998; Martins et al., 2006; Nörnberg et al., 2010). Tabela 1 Resultados das análises realizadas com as culturas psicrotróficas. N estirpes proteolíticas Psicrotróficos Em pelo menos uma das temperaturas avaliadas 110 (n=233) Nas duas temperaturas avaliadas 90 Em apenas uma temperatura avaliada 20 Proteólise à 21 C 106

4 Proteólise à 30 C 93 Psicrotróficos com comportamento mesofílico (n=111) Em pelo menos uma das temperaturas avaliadas 70 Nas duas temperaturas avaliadas 60 Em apenas uma temperatura avaliada 10 Proteólise à 21 C 67 Proteólise à 30 C 63 Dentre as estirpes que formaram proteólise em apenas uma das duas temperaturas avaliadas, três foram proteolíticas apenas na temperatura de 30 C enquanto que 17 estirpes foram proteolíticas apenas à 21 C. Em relação ao comportamento mesofílico das estirpes, dentre as 233 estirpes psicrotróficas avaliadas, 111 (47,64%) foram capazes de se multiplicar em temperatura característica de microorganismos mesófilos. Sugerindo que estes micro-organismos são mesófilos capazes de se adaptar ao frio alterando seu metabolismo, uma vez que a maioria dos psicrotróficos apresenta temperatura ótima de multiplicação entre 20 e 30 ºC (Muir, 1996; McPhee e Griffths, 2011). Correlacionando o comportamento mesofílico com a capacidade de produzir protease, 70 estirpes mesófilas foram consideradas proteolíticas em pelo menos uma das temperaturas avaliadas e 60 apresentaram atividade proteolítica nas duas temperaturas avaliadas. Dentre as 111 estirpes com comportamento mesofílico, 67 foram proteolíticas à 21 C e 63 à 30 C. Três foram proteolíticas à 30 C mas não apresentaram o mesmo comportamento proteolítico quando incubadas à 21 C e sete estirpes apresentaram atividade proteolítica apenas quando incubadas à 21 C. Wang e Jayarao (2001) relataram que estirpes de P. fluorescens incubadas a 7, 22 e 32 ºC apresentaram atividade proteolítica de 80%, 91% e 58% nas respectivas temperaturas. Das 233 estirpes de psicrotróficos isoladas das amostras de leite cru, 65 estirpes (27,90%) mostraram-se não fermentadoras de lactose em ágar MacConkey, sendo isto característico de Pseudomonas sp. e quando submetidas ao teste de Gram, 63 culturas foram consideradas Gram negativas. As 61culturas gram negativas (duas culturas não puderam ser recuperadas) foram submetidas a análise molecular, e 53 (86,89%) foram confirmadas para Pseudomonas sp. Essa porcentagem é superior ao relatado por Arcuri et al., (2008) que observou positividade de 43,2% para Pseudomonas sp. de 250 bactérias psicrotróficas gram-negativas avaliadas. Diversos autores afirmam que Pseudomonas sp. são descritas como os principais micro-organismos isolados de leite cru refrigerado e estão associadas à deterioração do leite devido à sua capacidade de produzir proteases resistentes ao calor (De Jonghe et al., 2011; Decimo et al., 2014; Scatamburlo et al., 2015; Tremonte et al., 2014). Apenas sete culturas não apresentaram amplificação do gene 16S para P. fluorescens, sendo assim 86,79% das colônias positivas para a espécie em questão. Este resultado é semelhante aos demais autores que afirmam que P. fluorescens é a espécie gram-negativa predominante em leite cru (Cox, 1993; Muir, 1996; Magan et al., 2001; Pinto 2014). 4. CONCLUSÕES A microbiota gram-negativa psicrotrófica proteolítica de leite cru refrigerado encontrada no estudo apresentou alto potencial deteriorador associado à produção de enzimas proteolíticas. Dentre elas destaca-se o gênero Pseudomonas e, principalmente, a espécie P. fluorescens que podem produzir

5 enzimas proteolíticas termorresistentes. Tais enzimas são capazes de causar alterações significativas em leite UHT e derivados lácteos, tornando clara a importância de boas práticas de produção para diminuir a contaminação do leite cru e a adoção de medidas que minimizem a proliferação destes microorganismos. 5. AGRADECIMENTOS L.S. Bersot recebe o apoio do CNPq; L.A. Nero recebe o apoio do CNPq e FAPEMIG; C. Viana, M.Z. Waz, M.J. Sereno recebem apoio da CAPES. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Arcuri, E.F., Silva, P.D.L., Brito, M.A.V.P., Brito, J.R.F., Lange, C.C., Magalhães, M.M.A. (2008). Contagem, isolamento e caracterização de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado. Ciência Rural, 38, Botaro, B. G., Gameiro, A. H., Santos, M. V. (2013). Quality based payment program and milk quality in dairy cooperatives of Southern Brazil: an econometric analysis. Scientia Agricola, 70, Brasil, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. (2011). Regulamento Técnico de Produção, Identidade e Qualidade do Leite tipo A, do Leite Cru Refrigerado, do Leite Pasteurizado e Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu Transporte a Granel. (Instrução Normativa nº 62, de 29 de dezembro de 2011). Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Cempírková, R. (2002). Psychrotrophic vs. total bacterial counts in bulk milk samples. Veterinarni Medicina, 47 (8), Cousin, M. A., Jay, J., Vasavada, P. C. (2001). Psychrotrophic microrganisms. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (1984). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4. ed.). Washington: American Public Health Association. Cox, M.J. (1993). The significance of psychrotrophic Pseudomonas in dairy products. The Australian Journal of dairy Technology, 48, De Jonghe, V., Coorevits, A., Koenraad, V. H., Messens, W., Landschoot, A. V., De Vos, P., Heyndrickx, M. (2011). Influence of storage conditions on the growth of Pseudomonas species in refrigerated raw milk. Applied and Environmental Microbiology, 77 (2), Decimo, M., Morandi, S., Salvetti, T., Brasca, M. (2014). Characterization of gram negative psychrotrophic bacteria isolated from Italian bulk tank milk. Journal of Food Science, 79 (10), Elmoslemany, A. M., Keefe, G. P., Dohoo, I. R., Jayarao, B. M. (2009). Risk factors for bacteriological quality of bulk tank milk in Prince Edward Island dairy herds. Part 2: Bacteria count-specific risk factors. Journal of Dairy Science, 92(6), Elmoslemany, A. M., Keefe, G. P., Dohoo, I. R., Wichtel, J. J., Stryhn, H.; Dingwell, R. T. (2010). The association between bulk tank milk analysis for raw milk quality and on-farm management practices. Preventive Veterinary Medicine, 95(1-2), Ercolini, D., Russo, F., Ferrocino, I., Villani, F. (2009). Molecular identification of mesophilic and psychrotrophic bacteria from raw cow's milk. Food Microbiology, 26(2),

6 Forsbäck, L., Lindmark-Månsson, H., Andrén, A., Svennerstensjaunja, K. (2010). Evaluation of quality changes in udder quarter milk from cows with low-tomoderate somatic cell counts. Animal, 4(4), Franco, B. D. G. M., Landgraf, M. (2003). Microbiologia dos Alimentos (2. ed.). São Paulo: Editora Atheneu. Magan, N., Pavlou, A., Chrysanthakis, I. (2001). Milk - sense: a: volatile sensing system recognises spoilage bacteria and yeasts in milk. Sensors and Actuators, 72, Marshall, R.T. (1992). Standard Methods for the Examination of Dairy Products (16 ed.) Washington: American Public Health Association. Marth, E. H.; Steele, J. L. (2001). Applied dairy microbiology (2. ed.). New York: Marcel Dekker. Martins, M.L., Pinto, C.L.O., Rocha, R.B., Araújo, E.F., Vanetti, M.C.D. (2006). Genetic diversity of Gram-negative, proteolytic, psychrotrophic bacteria isolated from refrigerated raw milk. International Journal of Food Microbiology, 111(2), McPhee, J.D., Griffths, M.W. (2011). Psychrotrophic bacteria: Pseudomonas spp. Encyclopedia of Dairy Sciences Montanhini, M. T. M. (2012). Caracterização fenotípica e genotípica de Bacillus cereus isolado em produtos lácteos com relação ao seu comportamento psicrotrófico (Tese de doutorado). Universidade Federal do Paraná, Curitiba. Muir, D.D. (1996). The shelf life of dairy products: factors influencing raw milk and fresch products. Journal of the Society of Dairy Technology, 49(1), Nörnberg, M.F.B.L., Friedrich, R.S.C., Weiss, R.D.N., Tondo, E.C., Brandelli, A. (2010). Proteolytic activity among psychrotrophic bacteria isolated from refrigerated raw milk. International Journal of Dairy Technology, 63, Perko, B. (2011). Effect of prolonged storage on microbiological quality of raw milk. Mljekarstvo, 61(2), Perin, L.M., Moraes, P.M., Almeida, M.V, Nero, L.A. (2012). Intereference of storage temperatures in the development of mesophilic, psychrotrophic, lipolytic and proteolytic microbiota of raw milk. Semina: Ciências Agrárias, 33(1), Pinto, C.L.O., Machado, C.R., Cardoso, R.R., Alves, R.M., Vanetti, M.C.D. (2014). Proteolytic potential of Pseudomonas fluorescens isolated from refrigerated raw milk. Brazilian Journal of Sustainable Agriculture, 4, Scarpellini, M., Franzetti, L., Galli, A. (2004). Development of PCR assay to identify Pseudomonas fluorescens and its biotype. FEMS Microbiology Letters, 236, Scatamburlo, T., Yamazi, A., Cavicchioli, V., Pieri, F., Nero, L. (2015). Spoilage potential of Pseudomonas species isolated from goat milk. Journal of Dairy Science, 98, Silveira, I.A., Carvalho, E.P., Teixeira, D. (1998). Verificação das atividades proteolíticas e lipolíticas da flora microbiana isolada do leite cru tipo B refrigerado. II Microrganismos mesófilos e termófilos. Ciência e Agrotecnologia, 22, Silveira, I.A., Carvalho, E.P., Teixeira, D. (2000) Influência de microrganismos psicrotróficos sobre a qualidade do leite cru refrigerado. Uma revisão. Higiene Alimentar, 12(55), Spilker, T., Coenye T., Vandamme P., Lipuma J.J. (2004). PCR Based assay for differentiation of Pseudomonas aeruginosa from other Pseudomonas species recovered from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology, 42, Tremonte, P., Tipaldi, L., Succi, M., Pannella, G., Falasca, L., Capilongo, V., Coppola, R., Sorrentino, E. 2(014). Raw milk from vending machines: Effects of boiling, microwave treatment, and refrigeration on microbiological quality. Journal of Dairy Science, 97, Wang, L., Jayarao, B.M. (2001). Phenotypic and Genotypic Characterization of Pseudomonas fluorescens Isolated from Bulk Tank Milk. Journal of Dairy Science, 84 (6),