UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS E USO DE MODELOS MATEMÁTICOS APLICADOS A TÉCNICA IN VITRO DE PRODUÇÃO DE GASES NA AVALIAÇÃO DO CAPIM MARANDU COMBINADO COM CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS PERIVALDO DE CARVALHO CUIABÁ - MT 2015

2 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS E USO DE MODELOS MATEMÁTICOS APLICADOS A TÉCNICA IN VITRO DE PRODUÇÃO DE GASES NA AVALIAÇÃO DO CAPIM MARANDU COMBINADO COM CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS PERIVALDO DE CARVALHO Zootecnista Orientador: Prof. Dr. LUCIANO DA SILVA CABRAL Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso, para obtenção do título de Mestre em Agricultura Tropical. CUIABÁ MT 2015

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4 3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical CERTIFICADO DE APROVAÇÃO Título: ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS E USO DE MODELOS MATEMÁTICOS APLICADOS A TÉCNICA IN VITRO DE PRODUÇÃO DE GASES NA AVALIAÇÃO DO CAPIM MARANDU COMBINADO COM CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS Autor: Perivaldo de Carvalho Orientador: Prof. Dr. Luciano da Silva Cabral Aprovada em Comissão Examinadora: Prof. Dr. Luciano da Silva Cabral (FAMEVZ/UFMT) (Orientador) Prof. Dr. Nelcino Francisco de Paula (FAMEVZ/UFMT) (Coorientador) Profa. Dra. Isis Scatolin de Oliveira (FAMEVZ/UFMT) (Membro) Dr. Rodrigo Dias Lauritano Pacheco (EMPAER/MT) (Membro)

5 4 AGRADECIMENTO Quero agradecer primeiramente a Deus, que sem sua presença e permissão não poderia ter chegado até aqui. Pelo apoio dos meus pais, Pedro e Erna, que investiram seu tempo e dinheiro para me educar, e que em todo o tempo foram suporte na minha caminhada, contribuindo para formação dos meus valores. Que Deus me permita retribuir esse esforço da melhor forma possível! Pela companhia da Bruna, minha namorada, que me apoiou em vários momentos e me deu muito suporte tanto na hora de trabalhar como em minha vida pessoal. Pela orientação do Prof. Luciano da Silva Cabral, pela confiança e autonomia, sem as quais eu não poderia ter finalizado essa etapa. Obrigado por ser referência de simplicidade e conhecimento. Aos companheiros Arthur, Isabela Bianchi, Camila Garcia, Camilla Miranda, João Rufino, Joelson, Clóves, Beatriz Gomes, Armando, Luís Henrique, Sílvio, Fábio, Sandro, João Leandro, Karine, Mariane, Pedro Ivo, Alan Barboza (desculpem se esqueci de alguém), que participaram da coleta de dados e pela amizade, contribuindo para que esses momentos se tornassem menos exaustivos e mais divertidos. Muito Obrigado! Pela banca avaliadora, composta pelo Prof. Dr. Nelcino Francisco de Paula, Profª. Drª. Isis Scatolin de Oliveira, e Prof. Dr. Carlos Eduardo Avelino Cabral e pelo pesquisador PhD. Rodrigo Dias Lauritano Pacheco, que dispuseram tempo para sugerir e corrigir este trabalho, tornando-o mais apto e qualificado a compor o conhecimento científico. À Universidade Federal de Mato Grosso Campus Cuiabá e o Programa de Pós graduação em Agricultura Tropical pela oportunidade de realizar este mestrado e à CAPES pela bolsa de apoio, sem a qual não poderia ter realizado esse mestrado.

6 5 ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS E USO DE MODELOS MATEMÁTICOS APLICADOS A TÉCNICA IN VITRO DE PRODUÇÃO DE GASES NA AVALIAÇÃO DO CAPIM MARANDU COMBINADO COM CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS RESUMO- Objetivou-se com este trabalho avaliar os efeitos de doses de amido e glicose sobre os parâmetros cinéticos e digestão da fibra do capim Brachiaria brizantha cv. Marandu obtido na época das águas e avaliar quatro modelos matemáticos usados para estimar parâmetros cinéticos da digestão de alimentos destinados a nutrição de ruminantes por meio da técnica in vitro de produção de gases. Foram testados os seguintes níveis de amido e glicose (zero, 10, 20 e 30% na matéria seca (MS) total incubada). Os tratamentos foram incubados em frascos de 120 ml, com tampão de McDougall e inóculo ruminal proveniente de dois ovinos deslanados da raça Santa Inês canulados no rúmen, coletado antes da alimentação do período matutino. Os frascos foram tampados (tampas de borracha) e lacrados (alumínio) e mantidos a 39ºC em banho-maria com agitação orbital. Foram realizadas leituras da pressão dos gases (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84 e 96 horas após o início da incubação) no interior dos frascos usando um transdutor de pressão modelo PressDATA 800. Nos tempos 24, 48 e 96 horas dois frascos foram retirados aleatoriamente para avaliação da fibra insolúvel em detergente neutro (FDN) residual. Os níveis de amido promoveram aumento linear (P <0,05) na produção total de gases, redução do período de latência, mas não afetaram a taxa de digestão. Os níveis de glicose causaram efeito quadrático (P<0,05) sobre a taxa de digestão e a latência, mas não apresentaram efeito sobre a produção total de gás. Sobre a digestão da FDN, os níveis de amido causaram apenas redução linear (P<0,05) no tempo 24 h, enquanto que os níveis de glicose causaram redução linear (P<0,05) em todos os tempos avaliados, o que permite inferir que a glicose exerce efeitos negativos prolongados na digestão da FDN, enquanto que para o amido o efeito negativo é revertido com o tempo de incubação. O uso do modelo unicompartimental para a estimativa dos parâmetros cinéticos nos tratamentos que envolveram a adição de 20 e 30% de glicose gerou ajustes com baixos valore de R 2, sendo necessário portanto o uso do modelo bicompartimental, já que foram percebidos perfis de produção de gás com comportamento diáuxico. Para os modelos testados observa-se que os mesmos apresentaram capacidade de ajuste diferente para os níveis de amido e glicose usados. Considerando que os alimentos destinados a alimentação dos ruminantes tendem variar a sua composição especialmente quanto aos teores de carboidratos não fibrosos (CNF) e FDN, conforme proporcionado no presente trabalho, pela adição de concentrações de amido ou glicose, a avaliação dos modelos para estimar parâmetros cinéticos da produção de gás in vitro permite inferir que apenas um modelo matemático não seria adequado para avaliar diferentes tipos de alimentos. Palavras-chave: Brachiaria brizantha, digestão in vitro, fibra em detergente neutro, ovinos, produção de gás, taxa de digestão.

7 6 ESTIMATION OF THE KINETIC PARAMETERS AND USE OF MATHEMATICALS MODELS APPLIED TO IN VITRO GAS PRODUCTION TECHNIQUE FOR MARANDU GRASS EVALUATION COMBINED WITH NON FIBROUS CARBOHYDRATES ABSTRACT - The objective this study was to evaluate the effects of starch and glucose levels on the kinetic parameters and fiber digestion of Brachiaria brizantha cv. Marandu grass obtained in the rainy season and to evaluate four mathematical models used to estimate kinetic parameters of digestion of foods for ruminant nutrition through in vitro gas production technique. The following starch and glucose concentrations were tested (zero, 10, 20 and 30% of dry matter incubated). The treatments were incubated into 120 ml bottles, with McDougall buffer and rumen fluid from two rumen fitted Santa Ines wethers, collected before feeding morning. The bottles were capped (rubber stoppers) and sealed (aluminum) and maintained at 39 C into a water bath with orbital shaking. Readings were taken from the gas pressure (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84 and 96 hours after beginning of incubation) inside the bottles by using a pressure transducer PressDATA model 800. At the time 24, 48 and 96 hours two bottles were randomly took off for evaluation of residual neutral detergent fiber. Starch levels shown a linear increase (P <0.05) in total gas production, reduced latency period, but did not affect digestion rates. Glucose levels caused a quadratic effect (P <0.05) on digestion rate and latency, but did not affect total gas production. On NDF digestion, starch levels caused only linear reduction (P <0.05) at 24 h time, while glucose levels caused a linear reduction (P <0.05) in all time periods, which can be inferred that prolonged glucose exerts an adverse effect on the NDF digestion, while for the negative effect of starch is reversed with time of incubation. The use of the one compartmental model for the estimation of kinetic parameters in treatments involving the addition of 20 and 30% generated fits with low R 2 values, being necessary the use of two-compartment model, since gas production profiles were noticed with diauxic behavior. For all tested models it was observed that they showed different ability to adjust to starch and glucose levels used. Whereas foods for feeding ruminants tend to vary its composition particularly concerning non-fiber carbohydrates (NFC) and NDF, as provided in this study, the addition of starch or glucose concentrations, the evaluation of models to estimate parameters kinetic in vitro gas production can be inferred that only a mathematical model would not be appropriate to evaluate different types of food. Key-words: Brachiaria brizantha, digestion rate, gas production, in vitro digestion, neutral detergent fiber, sheep.

8 7 SUMÁRIO Páginas 1 INTRODUÇÃO GERAL REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS PARÂMETROS CINÉTICOS DA DIGESTÃO IN VITRO DO CAPIM MARANDU COM ADIÇÃO DE CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MODELOS MATEMÁTICOS PARA ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DA DIGESTÃO DE FORRAGEM TROPICAL COMBINADA COM FONTES ENERGÉTICAS RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONCLUSÕES GERAIS... 56

9 8 1 INTRODUÇÃO A produção de ruminantes no Brasil, em sua grande maioria se baseia na utilização do pasto, cujos recursos nutricionais são responsáveis pelo suprimento de nutrientes para grande parte das exigências de mantença e produção dos animais. Este sistema de produção destaca-se dos demais em função do baixo custo de produção (Cabral et al., 2008) e pela praticidade de manejo, pois o próprio animal colhe a forragem, reduzindo gastos associados à colheita, processamento e distribuição da dieta, verificados em outros sistemas de produção (confinamento). Entretanto, para expressarem seu potencial produtivo, os bovinos necessitam de alimentação adequada que forneça proteína, energia, minerais e vitaminas (Paulino et al., 2001) em proporções compatíveis aos seus requisitos ao longo do ano. Porém, observa-se que os recursos nutricionais basais, ou seja, o pasto (Detmann et al., 2010), raramente constituem uma dieta equilibrada à produção animal, verificandose carências múltiplas de componentes minerais, energéticos e protéicos (Paulino et al., 2001), tornando necessária a utilização de recursos nutricionais suplementares, em que a proteína (ou compostos nitrogenados) assume papel prioritário (Paulino et al., 2006). Na época das chuvas, apesar da forragem apresentar teor adequado de proteína bruta(pb), o ganho de peso de bovinos está aquém dos ganhos observados sob condições similares em regiões temperadas. Parte dessa diferença, pode ser atribuída à alta degradabilidade da PB da forragem, o que causa perda excessiva de compostos nitrogenados no ambiente ruminal na forma de amônia, gerando déficit proteico em relação às exigências para ganhos elevados (Poppi & McLennan, 1995). Detmann et al., (2005), aponta como as principais limitações para o crescimento microbiano o fato da forragem disponível ao pastejo permitir baixa

10 9 assimilação do nitrogênio (N) disponível em proteína no rúmen, em decorrência da alta degradabilidade dos compostos nitrogenados ou da baixa velocidade de degradação dos carboidratos fibrosos da forragem. Dessa forma, o fornecimento de fontes energéticas de rápida disponibilidade no rúmen, as quais ampliariam a assimilação do nitrogênio oriundo dos compostos nitrogenados de alta degradabilidade da forragem (Poppi & McLennan, 1995; Detmann et al., 2005) pode ser efetivo em melhorar a eficiência de uso do N pelo animal. Porém, a suplementação com alimentos ricos em amido ou açúcares pode causar reduções no consumo de forragem, pois estes podem comprometer a utilização da fibra pelos microrganismos ruminais (Mould et al., 1983). Vários fatores podem estar envolvidos nestes efeitos, como competição entre espécies bacterianas por nutrientes limitantes, como amônia (Tamminga, 1993), produção de proteínas (bacteriocinas), pelas bactérias que usam açúcares solúveis, que inibem o crescimento daquelas que degradam fibra (Piwonka & Firkins, 1996) e, principalmente, inibição do crescimento e da atividade das bactérias que degradam fibra devido à queda do ph ruminal (Russell & Dombrowski, 1980; Mould & Ørskov, 1983; Mould et al., 1983; Grant & Mertens, 1992). No entanto, recentemente tem-se estabelecido que os efeitos dos CNF podem se manifestar de forma diferenciada em função da origem química dos carboidratos presentes nos suplementos. Além disso, açúcares simples podem ter efeito diferente do amido sobre a fermentação de forragem no rúmen (Arroquy et al., 2005). Dessa forma, faz-se necessária a investigação dos efeitos de CNF suplementares de diferentes origens químicas sobre a dinâmica dos carboidratos fibrosos da forragem, o que permitiria delinear melhores estratégias de suplementação para otimização do uso do pasto. Aliado a este fato, nos sistemas atuais de adequação de dietas para ruminantes, a composição e as características dos alimentos possuem papel primordial, e metodologias de avaliação de alimentos objetivam rapidez, baixo custo e confiabilidade. Dentre outras, informações no que diz respeito às suas frações de carboidratos e proteínas, bem como de suas taxas de digestão, são fundamentais para estimar com maior exatidão o desempenho dos animais e maximizar a eficiência de utilização dos nutrientes (Moreira, et al., 2010). Uma técnica que tem sido amplamente utilizada nos laboratórios de nutrição de ruminantes é a de produção cumulativa de gases, por ser simples e de baixo custo. A

11 10 técnica possibilita a avaliação de um grande número de amostras em curto espaço de tempo com uniformidade físico-química do meio (Malafaia et al., 1998; Barcelos et al., 2001), demonstrando boas correlações com metodologias in vivo e in situ (Blummel & Orskov, 1993). Na técnica in vitro de produção de gases a amostra é incubada em meio anaeróbico com solução tampão e inóculo ruminal em ambiente hermeticamente fechado, no sentido de permitir o acúmulo dos gases resultantes da fermentação do substrato pela microbiota. Esses gases são medidos por meio de seringas, manômetros ou sensores ao longo do tempo, no sentido de construir uma curva cumulativa de produção de gases, a qual é usada para estimar os parâmetros cinéticos da digestão do substrato (amostra) avaliado (Theodorou et al., 1994). Desta forma, os gases medidos ao longo do tempo refletem a degradação da amostra, especialmente dos carboidratos, os quais são a principal fonte de energia para a microbiota ruminal (Cabral et al., 2000). A descrição matemática oriunda dos perfis de produção de gases, possibilita uma análise dos dados e comparação dos substratos utilizados ou das características do ambiente de fermentação e podem fornecer informações úteis relativas à composição do substrato e da degradabilidade das frações solúveis e lentamente fermentáveis (Groot et al., 1996). Assim, esse método pode ser utilizado para determinar a importância de algumas dessas diferentes frações do alimento, em fornecer energia aos microrganismos (Pell & Schofield, 1993). A estimação dos parâmetros cinéticos na técnica de produção de gases é feita por intermédio da utilização de modelos não lineares. Até o presente, vários modelos foram desenvolvidos para estimar os parâmetros cinéticos da digestão de alimentos pela técnica in vitro de produção de gases (France et al., 1993; Beuvink & Kogut, 1993; Gompertz proposto por Lavrencic et al.,1997), incluindo modelos exponenciais, logarítmicos com e sem latência. Ao se considerar os diferentes modelos matemáticos que foram desenvolvidos para estimar os parâmetros cinéticos da produção de gás in vitro, estes diferem entre si no número de parâmetros a serem estimados e nas pressuposições teóricas. Assim, o seu uso para uma grande variedade de alimentos parece ser limitado, já que ocorre elevada variação na composição dos alimentos destinados a alimentação de ruminantes, especialmente no conteúdo em carboidratos fibrosos e não fibrosos, teor de FDN indigestível (FDNi) e proteína.

12 11 Esses componentes tendem a alterar os perfis de degradação (Bezerra et al., 2005), portanto, podem afetar os parâmetros cinéticos estimados e seu significado biológico, o que limitaria seu uso em sistemas de adequação de dietas para ruminantes, os quais consideram parâmetros cinéticos da degradação dos nutrientes no rúmen. Com isso, torna-se necessária a avaliação de diferentes modelos matemáticos para estimação de parâmetros cinéticos da digestão da matéria seca(ms) por meio da técnica in vitro de produção de gases. Assim, objetivou-se com esse trabalho avaliar a produção de gás e a degradação in vitro da FDN de capim Brachiaria brizantha cv. Marandu, mediante a suplementação com diferentes fontes de carboidratos (amido ou glicose), bem como avaliar diferentes modelos matemáticos para estimação de parâmetros cinéticos da digestão da MS por meio da técnica in vitro de produção de gases.

13 Referências Bibliográficas ARROQUY, J.I.; COCHRAN R. C.; NAGARAJA, T. G. et al. Effect of types of non-fiber carbohydrates on in vitro forage fiber digestion of low-quality grass hay. Animal Feed Science and Technology, v.120, p , BARCELOS, A. F.; PAIVA, P. C. A.; PEREZ, J. R. O.; TEIXEIRA, J. C.; CARDOSO, R. M.; SANTOS, V. B. Avaliação da casca e da polpa desidratada de café (Coffea arabica l.) pela técnica de degradabilidade in vitro de produção de gases. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 30, n. 6, p , BEUVINK, J.M.W.; KOGUT, J. Modeling gas production kinetics of grass silages incubated with buffered ruminal fluid. Journal of Animal Science, v.71, p , BEZERRA, A.R.G.F., MALAFAIA P., MANCINI, M.C., BEZERRA, E.S., VIEIRA,R.A.M. Parâmetros cinéticos da degradação in vitro de alimentos incubados com inóculo microbiano de diferentes espécies de ruminantes. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.57, n.4, p , BLUMMEL, M.; ORSKOV, E.R. Comparison of "in vitro" gas production and naylon degradability of roughage in predicting feed intake in cattle. Animal Feed Science and Technology, v.40, p , CABRAL, L. S.; VALADARES FILHO, S. C.; MALAFAIA, P. A. M. Frações de Carboidratos de Alimentos Volumosos e suas Taxas de Degradação Estimadas pela Técnica de Produção de Gases. Rev. bras. zootec., 29(6): , 2000 (Suplemento 1). CABRAL, L.S.; ZERVOUDAKIS, J.T.; COPPEDÊ, C. M.; SOUZA, A. L.; CARAMORI JÚNIOR, J.G.; POLIZEL NETO, A.; OLIVEIRA, I. S.; Suplementação de bovinos de corte mantidos em pastagem de Panicum maximum cv. Tanzânia-1 no período das águas. Rev. Bras. Saúde Prod. An., v.9, n.2, p , abr/jun, DETMANN, E.; PAULINO, M.F.; VALADARES FILHO, S.C. et al. Níveis de proteína em suplementos para terminação de bovinos em pastejo durante período de transição seca/águas: digestibilidade aparente e parâmetros do metabolismo ruminal e compostos nitrogenados. Revista Brasileira de Zootecnia, v.34, p , 2005.

14 13 DETMANN, E., PAULINO, M.F., VALADARES FILHO, S.C. Otimização do uso de recursos forrageiros basais. In: Proceedings of the 3rd International Symposium on Beef Cattle Production, Viçosa, Brazil. pp FRANCE, J.; DHANOA, M.S.; THEODOROU, M.K.; LISTER, S.J.; DAVIES, D.R.; ISAC, D. A model to interpret gas accumulation profiles associated with in vitro degradation of ruminant feeds. Journal of Theoretical Biology, v.163, p , GRANT, R. J.; MERTENS, D.R. Influence of buffer ph and raw corn starch addition on in vitro fibre digestion kinetics. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 75, n. 10, p , GROOT, J.C.J.; CONE, J.W.; WILLIAMS, B.A.; DEBERSAQUES, F.M.A.; LANTINGA, E.A. Multiphasic analysis of gas production kinetics for in vitro fermentation of ruminant feeds. Animal Feed Science and Technology, v.64, p.77-89, LAVRENCIC, A.; STEFANON, B.; SUSMEL, P. An evaluation of the Gompertz model in degradability studies of forage chemical components. Animal Science. v.64, p , MALAFAIA, P. A. M.; VALADARES FILHO, S. C.; VIEIRA, R. A. M.; SILVA, J. F. C.; PEREIRA, J. C. Cinética ruminal de alguns alimentos investigada por técnicas gravimétricas e metabólicas. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 27, n. 2, p , MOREIRA P.C. et al. Produção cumulativa de gases e parâmetros de France avaliados pela técnica semiautomática in vitro de fontes de carboidratos de ruminantes. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v.11, n.2, p , MOULD, F.L.; ØRSKOV, E.R.; MANNS, O. Associative effects of mixed feeds. I. Effects of type and level of supplementation and the influence of the rumen ph on cellulolysis in vivo and dry matter digestion of various roughages. Animal Feed Science and Technology, v.10, p.15-30, MOULD, F. L.; ØRSKOV, E. R. Manipulation of rumen fluid ph and its influence on cellulolysis in sacco, dry matter degradation and the rumen microflora of sheep offered either hay or concentrate. Animal Feed Science and Technology, Amsterdam, v. 10, n. 1, p. 1-14, PAULINO, M.F.; DETMANN, E.; ZERVOUDAKIS, J.T. Suplementos múltiplos para recria e engorda de bovinos em pastagens. In: SIMPÓSIO DE PRODUÇÃO DE GADO DE CORTE, , Viçosa. Anais... Viçosa: SIMCORTE. p , PAULINO, M.F.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO. S.C. Suplementação animal em pasto: energética ou protéica? In: SIMPÓSIO SOBRE MANEJO ESTRATÉGICO DA PASTAGEM, , Viçosa. Anais... Viçosa: SIMFOR.p , 2006.

15 14 PELL, A. N.; SCHOFIELD, P. Computerized monitoring of gas production to measure forage digestion in vitro. Journal of Dairy Science, Madison, v. 76, n. 9, p , PIWONKA, E. J.; FIRKINS, J. L. Effect of glucose fermentation on fiber digestion by ruminal microorganisms in vitro. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 79, n. 12, p , Dec POPPI, D.P.; McLENNAN, S.R. Protein and energy utilization by ruminants at pasture. Journal of Animal Science, v.73, p , RUSSELL, J. B., DOMBROWSKI, D. B. Effect of ph on the efficiency of growth by pure cultures of rumen bacteria in continuous culture. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 39, n. 3, p , TAMMINGA, S. Influence of feeding management on ruminal fibre digestibility. In. Jung, H. et al. (Eds.), Forage cell wall structure and digestibility. Madison: ASA. p ,1993 THEODOROU, M. K.; WILLIAMS, B. A.; DHANOA, M. S. et al. A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds. Animal Feed Science and Technology, n.48, v.3-4, p , 1994.

16 15 2 PARÂMETROS CINÉTICOS DA DIGESTÃO IN VITRO DO CAPIM MARANDU COM ADIÇÃO DE CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS Resumo - Objetivou-se avaliar efeitos de níveis (0, 10, 20 e 30%) de amido e glicose sobre os parâmetros cinéticos e degradação ruminal da fibra da Brachiaria brizantha cv. Marandu por meio da técnica in vitro de produção de gases. O capim Marandu com os níveis de carboidratos suplementares foi incubado em frascos de 120 ml, com tampão de McDougall e inóculo ruminal proveniente de dois ovinos da raça Santa Inês canulados no rúmen. Foram realizadas leituras da pressão dos gases no interior dos frascos, bem como dois frascos foram retirados nos tempos 24, 48 e 96 horas (h) para avaliação da FDN residual. Os níveis de amido promoveram aumento linear (P<0,05) na produção total de gases, redução do período de latência, mas não afetaram a taxa de digestão. Os níveis de glicose causaram efeito quadrático (P<0,05) sobre a taxa de digestão e latência. Os níveis de amido causaram efeito negativo(p<0,05) apenas no tempo 24 h, enquanto que a glicose em todos os tempos avaliados. Assim podese inferir que a glicose exerce efeitos negativos prolongados na digestão da FDN, enquanto que para o amido o efeito negativo é revertido com o tempo de incubação. Palavras-chave: degradação, forragem tropical, ruminantes, taxas de digestão, Brachiaria brizantha.

17 16 2 KINETICS PARAMETERS OF IN VITRO DIGESTION OF THE MARANDU GRASS WITH ADITION OF NON-FIBROUS CARBOHYDRATES ABSTRACT - This work aimed to evaluate the effects of starch or glucose levels (0, 10, 20 and 30%) on kinetic parameters and fiber digestion of the Marandu grass by in vitro gas production technique. The samples have been incubated into 120 ml flasks and added McDougall buffer and ruminal inoculum from two rumen fitted wethers. The gas production readings were recorded until 96 hours after inoculation and two flasks have benn analysed for residual NDF at 24, 48 and 96 hours. The starch levels caused linear increase (P<0.05) in the total gas production, drop in the lag period but did not affect the digestion rates. The glucose levels have caused quadratic effect on lag period and digestion rates. The starch levels caused negative effects on FDN digestion only 24 h after inoculation, while glucose levels promoted negatives effects for all evaluated times. Keywords: carbohydrates, degradability, digestion rates, ruminants, tropical forage.

18 INTRODUÇÃO A produção de ruminantes no Brasil, em sua grande maioria baseia-se na utilização de forrageiras tropicais, em virtude da capacidade destes animais em ingerir e digerir alimentos fibrosos, bem como pelas condições climáticas do país. Desta forma, esses recursos alimentares são responsáveis pelo suprimento de nutrientes para grande parte das exigências de mantença e produção dos animais pelo menos em parte do ano (Paulino et al., 2006). Apesar dessa vantagem dos ruminantes, existe a necessidade de intensificação da pecuária no Brasil, no sentido de aumentar a eficiência dos recursos naturais (pasto) e minimizar os impactos ambientais inerentes a atividade (gases de efeito estufa, compostos nitrogenados, etc.). Este fato tem aumentado o interesse por parte de técnicos e produtores no uso de fontes de CNF na dieta de animais em pastejo em determinadas condições de produção. Entretanto, ainda há muita controvérsia sobre os efeitos desses compostos no ambiente ruminal, especialmente sobre a microbiota que digere os carboidratos fibrosos. O uso de fontes de CNF tenderia a ser mais efetivo quando são utilizados pastos bem manejados na época das águas, onde o valor nutritivo da forragem apresenta-se adequado para a microbiota ruminal, época que ocorreria tendência de perda de compostos nitrogenados do ambiente ruminal em decorrência de elevada degradação de proteínas solúveis. Neste sentido, estudos da concentração e digestibilidade dos componentes dos alimentos são essenciais para adotar práticas de alimentação eficazes, porém, estes estudos exigem recursos consideráveis em termos de trabalho, alimentos, animais e tempo. Aliado a estes fatores, para que os sistemas de alimentação sejam eficientes, precisam ser fundamentados em mecanismos que determinam a resposta dos

19 18 animais aos nutrientes, lidando com aspectos quantitativos da digestão e do metabolismo do ruminante (Mertens, 2005). Atualmente, metodologias para avaliação de alimentos para ruminantes objetivam rapidez, baixo custo e confiabilidade. Além disso, os sistemas atuais de adequação de dietas para ruminantes necessitam da composição e características dos alimentos, dentre as quais, informações sobre às suas frações de carboidratos e proteínas, bem como de suas taxas de digestão, para que se possa estimar com maior exatidão o desempenho dos animais e maximizar a eficiência de utilização dos nutrientes (Moreira et al., 2010). A estimativa do valor nutritivo dos alimentos utilizados para ruminantes pelo método in vivo é limitada pela necessidade de ter um número representativo de animais homogêneos para serem mantidos durante um período de adaptação e de amostragem, aumentando os custos de avaliação em grande escala (Fondevila &Barrios, 2001). Além disso, as avaliações estão sujeitas ao erro associado ao uso de indicadores para a medição do fluxo da digesta, marcadores microbianos e variação inerente ao animal (Stern et al., 1997). Por essa razão, têm-se desenvolvido técnicas in vitro, as quais são menos onerosas e facilitam o controle das condições experimentais. Essas técnicas de laboratório podem ser eficientes desde que sejam facilmente reproduzíveis e altamente correlacionadas com resultados obtidos in vivo (Getachew et al., 1998). Uma técnica que tem sido amplamente utilizada nos laboratórios de nutrição de ruminantes é a técnica de produção cumulativa de gases, por ser simples e de baixo custo, além de possibilitar o processo de um grande número de amostras em curto espaço de tempo e uniformidade físico-química do meio (Malafaia et al., 1998; Barcelos et al., 2001). O sistema de produção de gás in vitro permite estimar a digestibilidade da MS e matéria orgânica (MO), indicando diretamente os produtos finais produzidos pela fermentação, como os gases (CO2e CH4) e indiretamente a produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), (Bueno et al., 2005). Os AGCC são as principais fontes de energia para os ruminantes, sendo responsáveis por 50 a 70% da energia disponível para o animal (Kozloski, 2002). Diante do exposto, objetivou-se avaliar a inclusão de fontes energéticas (amido e glicose), associadas com capim Brachiaria brizantha cv. Marandu da dieta de ruminantes por meio da determinação da digestibilidade in vitro da MO, bem como da produção de gases e digestibilidade da FDN desses carboidratos.

20 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Nutrição Animal do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá-MT. A forragem avaliada foi proveniente de amostras de lâminas foliares de Brachiaria brizantha cv. Marandu, adubada com 90 kg/ha de N, a qual foi colhida no período das águas aos 42 dias após o corte, na fazenda experimental da UFMT, localizada no município de Santo Antônio do Leverger - MT. A forragem apresentou em sua composição: 23 % de MS, 93 % de MO, 9,55 % de PB e 58,58 % de FDN 37,65 % de PIDN. A forragem, após secagem sob ventilação forçada (60ºC/72 h), foi processada em moinho de facas com peneira de porosidade 1 mm e, posteriormente, analisada quanto aos teores de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO) e proteína bruta (PB), segundo métodos descritos em (Silva & Queiroz, 2002). As avaliações da FDN foram conduzidas segundo recomendações de (Van Soest et al., 1991). Para constituir os tratamentos, escolheu-se a forragem como referência à implementação dos demais, e este foi construído de forma a simular situação de bovinos sob pastejo durante o período das águas. Os demais tratamentos foram constituídos com o fornecimento das fontes energéticas do suplemento, associandose a substituição da forragem por amido ou glicose. Desta forma, os tratamentos avaliados foram: 1) 100% Forragem; 2) 90% Forragem + 10 % Amido; 3) 80% Forragem + 20 % Amido; 4) 70% Forragem + 30 % Amido; da mesma forma foram organizados os tratamentos com a utilização de glicose: 1)100% Forragem; 2)90% Forragem + 10 % Glicose; 3) 80% Forragem + 20 % Glicose; 4) 70% Forragem + 30 % Glicose.

21 20 As seguintes fontes foram utilizadas: amido (amido solúvel P.A. SYNTH) e glicose (glicose D ANIDRA P.A.). A escolha desses componentes utilizados na constituição dos suplementos se deu com base na pureza da fonte energética e na ausência de FDN ou proteína, o que permitiu avaliar de forma exclusiva a degradação da fração fibrosa insolúvel da forragem. Foram realizadas três incubações sucessivas, de modo a minimizar efeitos entre incubações. Para inoculação foi utilizado líquido ruminal proveniente de dois ovinos da raça Santa Inês, castrados e canulados no rúmen, mantidos em baias individuais, cobertas e com piso de concreto, dotadas de comedouro e bebedouro individual. Os animais doadores foram adaptados durante 30 dias antes da coleta do líquido ruminal a dieta composta por volumoso mais concentrado na proporção 70:30 respectivamente. Como volumoso, foi utilizada a mesma forragem que foi incubada e o concentrado era composto pela mistura de farelo de soja, milho e mistura mineral com 21 % de PB (% da MS). O inóculo ruminal foi obtido da região de interface líquido:sólido do ambiente ruminal, sendo filtrado por uma camada tripla de gaze, imediatamente acondicionado em recipiente térmico e transportado à sala de incubação sob anaerobiose. Alíquotas de forragem foram acondicionadas em frascos de vidro com 120 ml de volume total. Em seguida, foi adicionada a fonte energética segundo a estrutura dos tratamentos anteriormente descritos, perfazendo o total de 500 mg de MS por frasco para todos os tratamentos. Posteriormente, foram adicionados aos frascos solução tampão de McDougall (McDougall, 1948), com ph previamente ajustado para 6,8 por intermédio de aspersão com CO2 isento de oxigênio. A solução tampão foi adicionada solução redutora recémpreparada, composta de 625 mg/l de HCl-cisteína e 1000 mg/l de Na2SO3. Em cada frasco de incubação, foram adicionados 40 ml da solução total (solução tampão e solução redutora) 30 minutos antes da inoculação, sob aspersão de CO2, para que as condições anaeróbicas fossem garantidas, permanecendo os frascos em banho-maria a 39 o C. Em seguida, foram inoculados 10 ml de líquido de rúmen em cada frasco, sempre sob aspersão com CO2, os quais foram imediatamente vedados com tampa de borracha e lacrados com lacre de alumínio, elevados ao banho-maria a 39 o C, com sistema de agitação orbital (Malafaia et al., 1998). A relação final, para os tratamentos com a adição de suplementos energéticos, foi de 100 mg de MS/10 ml de solução

22 21 final e 1 ml de inóculo ruminal/4 ml de solução tampão. Após lacrar os frascos, os gases presentes no interior dos mesmos foram liberados por meio de uma agulha, e o tempo foi computado para a realização das leituras de pressão dos gases. Para corrigir o volume de gás oriundo do líquido de rúmen e da solução tampão, três frascos foram incubados sem amostra (branco); dessa forma, para cada tempo de leitura, o volume de gás dos frascos com amostra foi subtraído do volume dos frascos sem amostra. As leituras de pressão gerada pelos gases foram realizadas por meio de um transdutor (PressDATA 800) de pressão conectado em sua extremidade uma agulha (0,7mm). As leituras de pressão ocorreram com maior frequência nos períodos iniciais e reduziram posteriormente (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84 e 96 horas após o início da incubação). O procedimento de incubação foi repetido três vezes, perfazendo o total de três avaliações por tempo de incubação para cada tratamento. As incubações foram feitas em sequência. Foram usados 6 frascos para cada tratamento em cada incubação, dos quais dois foram retirados aleatoriamente e analisados nos tempos de 24, 48 e 96 horas para a FDN residual, por meio do uso de autoclave, objetivando avaliar o possível efeito das fontes energéticas sobre a digestão da FDN (Pell & Schofield, 1993). Ao final de cada tempo de incubação citados à cima, os frascos foram retirados do banho-maria e submetidos à mensuração do ph com potenciômetro digital, aos quais adicionou-se posteriormente 50 ml de detergente neutro (Van Soest et al., 1991). Após serem vedados novamente, os frascos foram autoclavados (105ºC/1 hora), de forma a extraírem-se todos os componentes solúveis em detergente neutro (Pell & Schofield, 1993), sendo o conteúdo filtrado sob vácuo em cadinhos filtrantes (porosidade 2) e lavados com água quente e acetona PA. A FDN residual foi obtida após secagem do material em estufa não ventilada (105ºC/16 horas). Os dados de produção de gases ao longo dos tempos de incubação foram usados para a construção dos perfis de produção cumulativa de gás em planilha do excel, os quais foram usados para estimar os parâmetros cinéticos da digestão das amostras contendo amido e glicose, por intermédio do modelo unicompartimental eq. (1). Devido ao mau ajuste do modelo unicompartimental as amostras contendo glicose, também foi utilizado o modelo bicompartimental eq. (2) de (Schofield et al., 1994): Gás = Vf / (1+ exp(2-4*c*(t-l))); (1)

23 22 Onde Vf, representa o volume final de gás (ml); c, a taxa de digestão da matéria seca da amostra (h -1 ); t (h), o tempo de incubação e L (h), a latência. Gás = Vfa / (1+ exp(2-4*c1*(t-l))) + Vfb / (1+ exp(2-4*c2*(t-l))); (2) Onde Vfa, representa o volume (ml) máximo de gás encontrado para a fração de rápida digestão; Vfb, idem para a fração de lenta digestão; C1(h -1 ), equivale à taxa de degradação para a fração de rápida digestão; C2(h -1 ), equivale à taxa de degradação para a fração de lenta digestão; t (h), a produção de gás ao tempo (t) equivale à soma de Vfa + Vfb, e L (h), representa a duração dos eventos iniciais da digestão ruminal, comum às duas fases de digestão. Os parâmetros cinéticos estimados e a digestibilidade da FDN foram analisados em delineamento inteiramente casualizado utilizando o PROC MIXED do SAS (versão 9.3). O modelo estatístico foi o seguinte:y ij = μ + T i + ε ij Onde Yij é a variável dependente, µ é a média geral, Ti é o efeito do nível de amido ou glicose, e Eij é o erro residual. Os níveis de amido e glicose foram considerados como efeitos fixos, e as incubações como efeitos aleatórios, sendo cada frasco considerado como uma unidade experimental. A opção LSMEANS foi usada para obter as médias individuais para cada tratamento. Contrastes ortogonais foram usados para partição específica dos efeitos do nível de amido e glicose em ordem linear, quadrática e cúbica. Em todas as análises significâncias foram declaradas a P<0,05.

24 Resultados e Discussão Os valores estimados para o volume final de gás (VF), taxa de digestão (C) e tempo de latência (L) utilizando níveis crescentes de amido em substituição à forragem encontram-se na Tabela 2. Os valores de R 2 para o ajuste do modelo aos dados foram elevados, onde o menor valor foi de 0,98, o que permite inferir que o modelo unicompartimental foi adequado para a estimação dos parâmetros cinéticos da digestão da forragem com a inclusão de amido. Não houve efeito dos níveis de amido (P>0,05) sobre a taxa de digestão (C) da forragem, sendo observado o valor médio de 0,0218 h -1. Isso pode ter ocorrido pela boa qualidade da forragem utilizada, assim como pelo eficiente tamponamento proporcionado pelo tampão (McDougall, 1948), uma vez que os valores de ph final não foram afetados (ph = 6,76) pelos níveis de amido. De acordo com Mertens & Loften (1980), quando o ph do meio é reduzido para valores abaixo de 6,0 a digestão da fibra pode ser reduzida, fato este não verificado no presente estudo. Adicionalmente, as alterações na relação acetato:propionato podem ter colaborado para não alteração das taxas de digestão. Tabela 2. Volume final de gás (VF), taxa de digestão da matéria seca (C), e período de latência (L) em função da inclusão de amido substituindo a forragem. Parâmetros Níveis de Amido (%) Valor p EPM L Q C VF 1 21,728 24,615 26,898 28,477 0,607 <0,001 0,312 0,971 C 2 0,022 0,020 0,022 0,022 0,001 0,673 0,427 0,515 L 3 12,038 7,128 6,022 4,225 0,084 0,001 0,089 0,247 R 2 0,99 0,99 0,99 0,98 1 ml/100mg de MS, 2 em h -1, 3 em h -1, valores de R 2 obtidos para o ajuste do modelo unicompartimental aos dados observados. L = Linear; Q = Quadrático e C = Cúbico.

25 24 Para o período de latência (L) e volume final de gás (VF), verificou-se efeito linear (P<0,05) da substituição dos níveis de amido, onde o aumento da inclusão de amido promoveu aumento da produção de gás, enquanto que o tempo de latência foi reduzido. A maior produção de gás ocorreu pela maior disponibilidade de nutrientes (CNF) para os microrganismos ruminais in vitro (Wascheck et al., 2010). De acordo com Mertens (1997), os CNF apresentam digestão rápida e completa no trato gastro intestinal (TGI) enquanto que os carboidratos fibrosos (CF) apresentam digestão lenta e incompleta. Desta forma, quando alimentos ricos em CNF são acrescentados as dietas dos ruminantes espera-se elevação da digestibilidade da dieta total, como pode ser evidenciado pelo aumento do volume final de gás. O efeito da adição de CNF sobre os perfis de degradação da MS de forrageiras pode ser variável, pois a fermentação desses compostos pela microbiota presente no inóculo se dá de forma mais rápida e gerando diferentes produtos finais da fermentação (Beuvink & Spoesltra, 1992). Considerando que o principal constituinte da forragem é a FDN, cuja digestão dos seus polímeros e fermentação dos monômeros implica na produção de acetato, o qual libera 2 moles de CO2por mol de acetato (produção direta) e 0,87 moles de CO2 por mol de AGV (produção indireta), enquanto que a fermentação de amido gera, principalmente propionato como produto final e, que a produção de propionato só libera 0,87 moles de CO2 indiretamente (Beuvink & Spoesltra, 1992), a adição de amido embora permita aumentar a quantidade de carboidratos potencialmente digestíveis nos frascos de incubação, a alteração na relação acetato:propionato altera a produção de gases direta. Desta forma, a não alteração da taxa de digestão da MS em função da adição de amido pode ser em parte explicada pelo efeito deste evento. Cabral et al., (2002) avaliando silagem de milho com níveis crescentes de espigas citaram que o acréscimo de grãos, por acarretar aumento dos CNF e redução dos CF, pode afetar os parâmetros cinéticos estimados pelos sistemas in vitro (cultura em batelada ou sistema fechado), principalmente, o acúmulo de metabólitos (ácidos orgânicos) em taxas elevadas ao ambiente de incubação, ou até mesmo a exaustão de outros nutrientes pode inibir a ação fermentativa, embora ainda existam nutrientes potencialmente digestíveis. Para o caso específico da técnica de produção de gás, a proporção molar dos AGV s produzidos pode também afetar a taxa na qual os gases são produzidos, em resposta à adição de carboidratos disponíveis, pois a fermentação acética tem

26 25 comportamento diferente da fermentação de propionato sobre a produção de gás (Beuvink & Spoesltra, 1992). A redução do período de latência com a inclusão de amido reflete o efeito da digestão mais rápida do amido em relação a fibra, principal componente da forragem, indicando que este alimento é mais fermentável que a forragem (Wascheck et al., 2010). Assumindo taxa de digestão média do amido de 0,20 h -1, cerca de cinco horas após o início da incubação praticamente todo o amido potencialmente digerível teria sido degradado pela microbiota ruminal, afetando com isso os tempos iniciais de leitura dos gases e, com isso, a latência. O período de latência tem sido descrito como o tempo decorrido após a inoculação da amostra para que o processo de digestão se inicie de fato, onde eventos associados a hidratação da amostra, aderência da microbiota ruminal ao substrato e a retirada de componentes resistentes a digestão ocorreria no ambiente de incubação (Mertens, 2005). Elevados períodos de latência tendem a ser observados quando se usa a técnica in vitro de produção de gases para amostras com elevado teor de FDN, elevado grau de lignificação e baixo teor de CNF. Quando se utilizou a glicose como fonte de energia suplementar verificou-se efeito quadrático (P<0,05) sobre a taxa de digestão (C) da forragem e período de latência (L) (Tabela 3). Tabela 3. Volume final de gás (VF), taxa de digestão (C), e período de latência (L) em função da glicose substituindo a forragem usando o modelo unicompartimental de Schofield et al., (1994). Parâmetros Níveis de Glicose (%) Valor P EPM L Q C VF 1 22,932 23,030 24,910 23,165 0,761 0,469 0,259 0,150 C 2 0,021 0,017 0,021 0,037 0,001 <0,001 <0,001 0,381 L 3 8,320 0,341 0,001 0,001 1,137 0,001 0,008 0,189 R 2 0,99 0,98 0,95 0,82 1 ml/100mg de MS, 2 em h -1, 3 em h -1, valores de R 2 obtidos para o ajuste do modelo aos dados observados. L = Linear; Q = Quadrático e C = Cúbico. O volume total de gás não foi influenciado pelos níveis de glicose adicionados, diferentemente do observado para a inclusão do amido. Entretanto, deve ser

27 GAS ml Gas ml GAS Predito ml GAS ml 26 salientado que foi utilizado o modelo unicompartimental (Schofield et al., 1994) o qual não se ajustou adequadamente aos dados observados especialmente para os maiores níveis de glicose, conforme coeficiente de determinação, o qual variou de 0,99 a 0,82 para os níveis zero e 30%, respectivamente. Desta forma, provavelmente a falta de adequação do modelo unicompartimental para estimar os parâmetros cinéticos colaborou para a não identificação dos efeitos dos níveis de inclusão de glicose sobre o VF, conforme pode ser observado (figura 1). (a) (b) Glicose 0% GAS Observado GAS Predito Glicose 10% Gas Observado Gas Predito Tempo (h) Tempo (h) (c) (d) Glicose 20% Gas obser 10 5 Gas Predito Tempo (h) Glicose 30% Gas obser 10 GAS Predito Tempo (h) FIGURA 1. Perfil de produção de gás para os dados observados (círculos) e ajustados (linha contínua) pelo modelo unicompartimental para os níveis de zero (a), 10 (b), 20 (c) e 30% (d) de glicose adicionada aos frascos de incubação. A adição de glicose promoveu alteração significativa no perfil de produção de gás (Figura 1), especialmente nos níveis 20 e 30% de glicose, caracterizando desta forma o que se chama de diauxia (Brock et al., 1994), o qual tem sido descrito como a ocorrência de duas curvas de crescimento microbiano na mesma curva (alimento, substrato). Este fenômeno ocorre pela presença de dois substratos com diferentes

28 27 preferências pela microbiota ruminal ou pela presença de nutrientes poliméricos e solúveis que apresentam diferentes taxas de digestão. Desta forma, procurando identificar isso, optou-se por usar o modelo bicompartimental (Schofield et al., 1994), tendo sido observado melhor ajuste do mesmo em comparação ao modelo unicompartimental, proporcionado R 2 de 0.99 para todos os níveis de glicose utilizados (tabela 4; Figura 2). Tabela 4. Parâmetros cinéticos da digestão da forragem em função da glicose substituindo a forragem (modelo bicompartimental de Schofield et al., 1994). Parâmetros Níveis de Glicose % VF ,030 7,463 C ,466 0,253 L 2 8,324 0,325 1,542 1,271 Vf2 1 22,931 23,034 20,964 19,135 C2 3 0,021 0,0175 0,0175 0,017 Vf total 1 22,936 23,033 25,009 26,590 R 2 0,99 0,98 0,99 0,99 1 ml/100mg de MS, 2 em h -1, 3 em ml.h -1, valores de R 2 obtidos para o ajuste do modelo aos dados observados; Volume final de gás para a fração de rápida digestão (Vf1), taxa de digestão da fração de rápida digestão (C1), período de latência (L), volume final de gás para a fração de lenta digestão (Vf2), taxa de digestão da fração de lenta digestão (C2) e volume total de gás (Vf1 + Vf2) Uma vez que o modelo bicompartimental se ajustou apenas aos perfis de produção de gás dos maiores níveis de glicose (20 e 30%), não foi realizada análise estatística, no entanto percebe-se o aumento numérico do volume final de gás (Vf total) com a substituição de glicose, diferente do apresentado na tabela 3 usando o modelo unicompartimental.

29 GAS ml GAS ml GAS ml GAS ml 28 (a) (b) Glicose 0% Gas Pred GAS Obser Tempo (h) Glicose 10% Gas Pred GAS Obser Tempo (h) (c) (d) 30 Glicose 20% 30 Glicose 30% 20 Gas Pred 20 Gas Pred 10 GAS Obser 10 GAS Obser Tempo (h) Tempo (h) Figura 2. Perfil de produção de gás para os dados observados (círculos) e ajustados (linha contínua) pelo modelo bicompartimental para os níveis com zero (a), 10 (b), 20 (c) e 30% (d) de glicose adicionada aos frascos de incubação. A não observação de aumento da taxa de digestão da MS pela adição de amido poderia ser mascarada pelos efeitos negativos da adição de amido sobre a digestão da MS da forragem, os quais não seriam possíveis de detecção pelo sistema de monitoramento da produção de gás bem como pelos modelos matemáticos usados, já que os gases de ambas os componentes seriam gerados simultaneamente ao longo da incubação. Desta forma, objetivando avaliar o efeito dos níveis de amido e glicose sobre a digestão da FDN, considerando as limitações da técnica in vitro de produção de gases, foi avaliado o desaparecimento da FDN em 3 tempos de incubação: 24, 48 e 96 horas. Para a digestão da FDN utilizando o amido, verificou-se redução linear (P<0,05) da digestão no tempo de 24 horas após a inoculação, entretanto, não foi observado efeito nos tempos de 48 e 96 horas (tabela 5). A inibição da digestão da FDN no tempo 24 horas pode ter sido causada pelo efeito do amido sobre o crescimento de

30 29 microrganismos que o digerem, os quais provavelmente competiram por nutrientes essenciais ao metabolismo com os organismos celulolíticos (Hungate, 1966). Ao mesmo tempo, o aumento da disponibilidade de carboidratos solúveis (glicose, maltose) resultantes da digestão do amido pode favorecer o seu uso direto pelos organismos celulolíticos e, portanto, ter algum efeito negativo na síntese de enzimas relacionadas à digestão de celulose. Esse mecanismo tem sido verificado em vários microrganismos, onde a presença do produto final da via metabólica ou do nutriente no meio de cultivo, inibe a expressão de genes associados a digestão de um polímero complexo ou da sua síntese pelo organismo. A elevação da concentração de carboidratos solúveis também pode inibir os mecanismos associados à aderência ao substrato (Brock et al., 1994), os quais são necessários a digestão dos componentes insolúveis, especialmente da parede celular vegetal (celulose e hemicelulose). A não observação de diferença na digestão da FDN nos tempos 48 e 96 horas indica que houve recuperação da atividade celulolítica com o decorrer da incubação, sendo o efeito inibitório do amido apenas transitório. Tabela 5. Valores médios de mínimos quadrados para a digestão in vitro da FDN nos tempos de incubação de 24 (Dig24), 48 (Dig48) e 96 horas (Dig96) em função da substituição da forragem por amido. Tempo Níveis de Amido (%) Valor p EPM L Q C Dig24 16,184 12,334 10,325 6,976 3,857 0,014 0,901 0,725 Dig48 60,148 58,166 64,463 56,532 3,822 0,799 0,466 0,236 Dig96 73,533 72,548 70,630 71,790 1,924 0,131 0,283 0,361 EPM= Erro padrão da média; L= Linear; Q= Quadrática; C= Cúbica Diferente do observado para o amido, o aumento da concentração de glicose no meio de incubação causou redução linear (P<0,05) da digestão da FDN em todos os tempos avaliados (tabela 6). Ou seja, o uso de elevadas concentrações de glicose no meio de cultivo causa efeitos negativos prolongados na digestão da FDN.