ANCA (Triagem) Imuno-ELISA

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1 MS BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Hagen, E.C., Ballieux, B.E., van Es, L.A. et al.: Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies: a review of the antigens involved, the assays, and the clinical and possible pathogenetic consequences. Blood; 81: , Stegeman, C.A.: Anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) levels directed against proteinase 3 and myeloperoxidase are helpful in predicting disease relapse in ANCA-associated small vessel vasculitis. Nephrol Dial Transplant;17: 77-80, Wiik, A.: Autoantibodies in vasculitis. Arthritis Res Ther.; 5(3): , Coen A Stegeman: Predictive value of antineutrophil cytoplasmic antibodies in small-vessel vasculitis: is the glass half full or half empty? J Rheumatol, 32 (11): 75-77, Selga, D.: Diagnostic and prognostic aspects of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in systemic vasculitis. Department Nephrology Clinical Sciences in Lund University, Sweden, doctoral dissertation, May 18, Mukhtyar, C., Flossmann, O., Hellmich, B. et al.: Outcomes from studies of antineutrophil cytoplasm antibody associated vasculitis: a systematic review by the European League Against Rheumatism systemic vasculitis task force. Ann Rheum Dis; 67: , 08. Imuno-ELISA ANCA (Triagem) Kit para a determinação qualitativa de anticorpos Anti-Citoplasma de Neutrófilos (ANCA), com especificidade para a proteinase 3 (PR3) e mieloperoxidase (MPO), no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative determination of Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA), specific for proteinase 3 (PR3) and myeloperoxidase (MPO), in human serum by enzyme linked immunoassay (ELISA). Kit para la determinación cualitativa de Anticuerpos Anticitoplasma de Neutrófilos (ANCA), específicos para proteinasa 3 (PR3) y mieloperoxidasa (MPO), en el suero humano mediante inmunoensayo enzimático (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones Edição I: Rev. 11/12 EC R E P WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax Obelis S.A. Boulevard Général Wahis Brussels, BELGIUM Phone. +(32) Fax : +(32) SAC

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA A presença de anticorpos Anti-Citoplasma de Neutrófilos (ANCA) em pacientes com vasculite foi observada pela primeira vez em 1982 por Davies. Os ANCAs são um grupo de autoanticorpos dirigidos contra as proteínas contidas nos grânulos dos neutrófilos. Estes anticorpos podem ser detectados por imunofluorescência indirecta, em neutrófilos fixados em etanol, produzindo padrões de coloração característicos. Existem dois tipos de ANCA (p e c-anca) presentes em pacientes com vasculite de pequenos vasos. O p-anca ocorre em vasculites, tais como a glomerulonefrite, a Síndrome de Churg-Strauss, a poliarterite nodosa, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatóide. O principal antígeno para o p-anca é a mieloperoxidase (MPO). Outros antígenos alvo, como a elastase de leucócitos humanos e a lactoferrina, têm sido igualmente associados ao padrão de fluorescência do p-anca. Podem também ser produzidos anticorpos anti-mpo através de medicamentos, como a hidralazina, a clozapina e o L-triptofano. A exposição profissional a fatores ambientais, como o pó de sílica, pode provocar uma glomerulonefrite progressiva anti-mpo positiva. A medição dos ANCAs específicos para MPO constitui uma ferramenta importante para a avaliação de subtipos clínicos no âmbito das vasculites sistêmicas. O c-anca é principalmente direcionado contra a proteinase 3 (Pr3). Alguns dos antígenos menores que podem levar a reações de c-anca são a elastase e a catepsina. A PR3 é uma serina proteinase neutral, localizada nos grânulos azurófilos dos neutrófilos. Os anticorpos contra o antígeno PR3 são marcadores da Granulomatose de Wegener (GW), uma vasculite sistêmica necrosante. Diversos estudos estabeleceram uma correlação direta entre os níveis de anticorpos anti-pr3 e a fase ativa de GW. A concentração do soro anti-pr3 aumenta dramaticamente durante as exacerbações da doença (frequência de 90%), sendo as recaídas normalmente acompanhadas por aumentos significativos de títulos. A presença de c-anca é também indicadora de outras doenças, como a glomerulonefrite necrosante imune idiopática, e de doenças inflamatórias intestinais, como a colite ulcerativa. O Imuno-ELISA ANCA (Triagem) da WAMA é um teste imunoenzimático para a triagem da presença de anti-mpo e anti- PR3 (ANCA) no soro humano. A especificidade dos resultados positivos pode ser identificada pela determinação individual de anticorpos anti-mpo e anti-pr3. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados de PR3 e MPO (fase sólida). Quando anticorpos anti-mpo ou anti-pr3 específicos estão presentes na amostra de soro, eles ligam-se às proteínas da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-igg humana de cabra marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos anti-mpo ou anti-pr3 presentes. Um substrato (TMB) é adicionado, cuja presença de anticorpos é detectada pela mudança de cor na reação. Uma solução stop para bloqueio da reação enzimática é adicionada e a absorbância da reação é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos é proporcional à intensidade da cor da reação. Os resultados são expressos em unidades ELISA por mililitro (UE/mL) e informados como reagentes ou não reagentes. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com com antígenos MPO e PR3 purificados (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (2 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (1 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (1 x 60 ml) 6. Solução Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador-ANCA (1 x 1,75 ml) 8. Soro Controle Negativo (1 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso R E F E determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com com antígenos MPO e PR3 purificados (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (4 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (2 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (2 x 60 ml) 6. Solução Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador-ANCA (2 x 1, 75 ml) 8. Soro Controle Negativo (2 x 1,75 ml) ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No se demostró una injerencia significativa de las siguientes sustancias en las concentraciones indicadas: hemoglobina (hasta 2 g/l), bilirrubina (hasta 342 µmol/l) y el factor reumatoideo (hasta 100 UE/ml). LÍMITE DE DETECCIÓN Lo límite de detección de lo test se determinó como 3.3 UE/mL basado en 60 replicas del "blank" y 10 replicas para cada una de las seis muestras con bajos niveles de anticuerpos. LIMITACIÓN DEL USO Lo test Imuno-ELISA ANCA (Triaje) de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, debido a la posibilidad de falso resultado reactivos y interferencias con otras enfermedades, resultados repetidamente reactivos siempre debe interpretarse con información clínica del paciente con los resultados de otras pruebas de laboratorio. Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja del kit. 3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa. 4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles. 5. Lo Imuno-ELISA ANCA (Triaje) contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, anti-h (excepto el Suero Control Positivo) y antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar los tests. 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad. 13. No reutilizar cualquier uno de los reactivos. 14. Desechar el material siguiendo regulaciones locales. 15. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y eliminación de los materiales. TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones.

3 17 02 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 177 muestras de suero obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 56 eran positivos y 121 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de lo Imuno-ELISA ANCA (Triaje) de WAMA en comparación con el Kit IMUNO-CON ANCA de WAMA. Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100 Verdaderos Positivos RESULTADO 55 Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Negativos Negativos ,21 95,9 Reactividad cruzada también se ha estudiado en individuos portadores de otras enfermedades autoinmunes o reactivas para auto-anticuerpos, cuyos resultados se muestran en la tabla abajo: Cabe señalar que el ANCA puede ocurrir en pacientes con diversos trastornos del tejido conectivo. Condición Número de Pacientes Número de Reactivos Vasculitis no asociada a ANCA 24 1 Enfermedad celíaca 8 0 Enfermedad de Crohn 10 0 Colitis Ulcerosa 6 0 Tiroiditis de Hashimoto 8 0 Artritis Reumatoide 8 1 ENA Positivo * - Anti-La Anti-Ro Anti-Sm Anti-RNP 8 0 TOTAL 96 5 (5,2%). * Anticuerpos contra antígenos nucleares extraíbles PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intraensayo se determiné mediante el ensayo 2 muestras de sueros, un reactivo y un no-reactivo, en replicas. Muestras Positivas Alta Baja Número de Veces Promedia de las Absorbancias 36,67 6,54 Desviación Estándar 2,70 0,47 7,38% 7,31% b. Precisión Interensayo c. La precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestras de suero, un reactivo y otro no reactiva, en replicas, siendo 10 réplicas para cada lote y por operadores diferentes. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 36,41 6,75 Desviación Estándar 2,50 0,37 6,88% 5,60% RECUPERACIÓN Muestras con concentraciones conocidas de ANCA se mezcla con diluciones apropiadas de otras muestras positivas con cantidades conocidas de ANCA. Los niveles de ANCA se determina a partir de las muestras y calculado el por ciento de recuperación calculado a partir de los valores obtenidos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla: Muestra 1 Muestra 2 UE/mL UE/mL % Recuperación Mezcla (UE/ml) (UE/ml) Esperado Observado Observados/Esperados Mezcla 1 9,3 91,4 51,2 50,3 98,2 Mezcla 2 9,3 34,6 22,4 21,9 97,8 Mezcla 3 34,6 59,1 48,3 46,9 97,1 9. Soro Controle Positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8ºC. SOLUÇÃO DE LAVAGEM (2): Dissolver o conteúdo (pó) de 1 frasco em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 µl. Manter entre 2-8ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (- 25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. DILUENTE DE AMOSTRA (5): pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4). Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. CALIBRADOR-ANCA (7): pronto para uso. Produzido de soro humano contendo ANCA. A concentração em UE/mL e a data de vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. O uso do Calibrador-ANCA é para determinar resultados qualitativos e valores em unidades. O Calibrador-ANCA deve ser sempre utilizado em cada ensaio realizado. SORO CONTROLE NEGATIVO (8): pronto para uso. Soro humano negativo para ANCA. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém conservante. SORO CONTROLE POSITIVO (9): pronto para uso. Soro humano positivo para ANCA. Usar puro, ou seja, não diluído. A concentração em UE/mL e a data do vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a - ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta de 5 µl e 1000 µl e ponteiras. Água deionizada para diluição do tampão de lavagem. Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Lavadora de microplaca. Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 1 cavidade para o calibrador-anca (7), 1 cavidade para o soro controle negativo (8) e 1 cavidade para o soro controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o blank, a qual conterá somente 100 µl do diluente de amostra (5). 2. Preparar diluição das amostras a serem testadas a 1:101 (5 µl da amostra µl do diluente de amostra (5)). 3. Dispensar 100 µl do calibrador-anca (7), soro controle negativo (8), soro controle positivo (9) e amostras (1:101) nas cavidades da microplaca. Usar uma cavidade para o blank se a leitura for monocromática, dispensando nesta 100 µl do diluente de amostra (5). Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades.

4 Lavar a placa 4 vezes com a solução de lavagem (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µl de solução de lavagem (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 3 vezes este procedimento (total de 4 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 100µL do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir as etapas 6 a Dispensar 100µl do substrato cromógeno (TMB) (4) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, protegendo da luz. 14. Bloquear a reação dispensando 100µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank, dentro de 30 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 100 µl do calibrador-anca (7), controle negativo (8), controle positivo (9), amostras (1:101) e blank (leitura monocromática) nas respectivas cavidades. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 4 vezes com solução de lavagem (2). 4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5. Pipetar 100 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 7. Repetir as etapas 3 e Pipetar 100 µl do substrato cromógeno (4) em cada cavidade da placa, exceto no blank. Haverá mudança na cor da reação onde houver peroxidase. 9. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a T.A. por 30 minutos. Protegendo da luz 10. Pipetar 100 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 30 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle pos. Calibrador A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. Determinar la concentración de las muestras a través de la siguiente ecuación: D.O. de la Muestra x UE/mL de lo Calibrador = UE/mL de la Muestra D.O. de lo Calibrador Advertencia: Se recomienda que los resultados cualitativos se reportan como "REACTIVO" o "NO REACTIVO". Las muestras con resultados iguales o superiores a UE/mL se consideran Reactiva. VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del "blank", que contiene solamiente lo diluyente de muestra, debe ser inferior a 0,3 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de lo Calibrador debe ser igual o superior a 1.0, de lo contrario, la prueba debe repetirse. La concentración de lo controle negativos debe ser inferior a 10 UE/mL. La D.O. de lo calibrador debe ser mayor que el D.O. del control negativo y menor que el D.O. del control positivo. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS REACTIVO : concentración de la muestra > UE/ml. NO REACTIVO : concentración de la muestra < UE/ml. IMPORTANTE: 1. Los valores anteriores son sólo un guía para interpretación de los resultados. Es recomendable que cada laboratorio establecer su propio rango de referencia. 2. Valores superiores a UE/ml debe ser analizada para determinar la especificidad (MPO/p-ANCA o PR3/c-ANCA) y los niveles de anticuerpos. VALORES ESPERADOS Los valores esperados en una población normal es negativo. Sin embargo, 4% de los individuos aparentemente sanos asintomáticos pueden probar reactivo para anticuerpos anti-mpo. Estudios recientes muestran que los pacientes diagnosticados con artritis reumatoide, poliartritis crónica, enfermedad indiferenciada del tejido conectivo y LES, contienen anticuerpos anti-mpo o p-anca. La terapia inmunosupresora, la iniciación o cambio de lo tratamiento no debe comenzar sólamente con la base de resultado reactivo de anticuerpo anti MPO, sino de observaciones clínicas cuidadosas. La siguiente tabla muestra la frecuencia de ANCA específica PR3 y MPO en el suero de 112 pacientes con vasculitis asociada a ANCA. Incidencia de anti-pr3 y anti-mpo de Vasculitis Asociada a ANCA Presencia de anticuerpos Granulomatosis de Poliangeítis Síndrome de Churg- Wegener microscópica Strauss ANCA reactiva por IFI 78% 59% 67% Anti-PR3 Reactivo 90% 0% 10% Anti-MPO Reactivo 0% 62% 17% Muestras Clinicas probadas con el Imuno-ELISA ANCA (Triaje), cuyos resultados muestran la incidencia de estos anticuerpos en varios grupos de estudio, como se muestra en la siguiente tabla: Grupos de Pacientes Número de Pacientes Número de Reactivos % de Reactivos Enfermedades asociadas Glomerulonefritis ,0 Granulomatosis de Wegener ,9 ANCA (+) indiferenciado ,9 Enfermedades Control Vasculitis no asociada a ANCA ,2 Enfermedad Inflamatoria Intestinal ,0 Lupus Eritematoso Sistémico ,4 Artritis Reumatoide ,5 Otras enfermedades autoinmunes ,0 Normales Sanos ,3

5 15 04 contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 3 veces este procedimiento (total de 4 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir los pasos 6 al Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (TMB) (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a 37 C durante 30 minutos, protegerlo de la luz. 14. Bloquear la reacción dispensando 100μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 30 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 100μl del calibrador ANCA (7) control negativo (8), control positivo (9), muestras (1:101), y blank (lectura monocromatica) en sus respectivos pocillos. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 4 vezes con solución de lavado (2). 4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7. Repetir los passos 3 y Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Cambio de color aparecerá donde está presente la enzima peroxidasa. 9. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Protegido de la luz 10. Dispensar 100 µl de la Solución Stop (6) en cada uno de los pocillos de la microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 30 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A Determinar a concentração das amostras através da seguinte equação: D.O da Amostra x UE/mL do Calibrador = UE/mL da Amostra D.O do Calibrador Atenção: Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam informados como REAGENTES ou NÃO REAGENTES. As amostras com resultados superiores ou iguais a UE/mL são consideradas Reagentes. VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente o diluente de amostra, deve ser menor do que 0,3 a 450 nm. O valor da D.O. do Calibrador deve ser igual ou superior a 1,0, caso contrário o teste deve ser repetido. A concentração do controle negativo deve ser inferior a 10 UE/mL. A D.O. do Calibrador deve ser superior à D.O. do controle negativo e inferior à D.O. do controle positivo. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS REAGENTE: concentração da amostra > UE/mL. NÃO REAGENTE: concentração da amostra < UE/mL. IMPORTANTE: 1. Os valores acima servem apenas como orientação para a interpretação dos resultados. É recomendável que cada laboratório determine seus próprios valores de referência normais. 2.Valores superiores a UE/mL deveriam ser testados para determinar a especificidade (MPO/p-ANCA ou PR3/c-ANCA) e os níveis de anticorpos. VALORES ESPERADOS Os valores esperados numa população normal são não reagentes. No entanto, 4% dos indivíduos assintomáticos aparentemente saudáveis podem apresentar testes reagentes para anticorpos anti-mpo. Estudos recentes revelam que os pacientes diagnosticados com artrite reumatóide, poliartrite crónica, doença indiferenciada do tecido conjuntivo e LES, contêm anticorpos anti-mpo ou p-anca. A terapia imunosupressora, a iniciação ou a alteração do tratamento não deve ser começada apenas com base no resultado reagente do anticorpo anti-mpo, mas sim em observações clínicas cuidadosas. A seguinte tabela ilustra a frequência do ANCA específico PR3 e MPO no soro de 112 pacientes com vasculite associada ao ANCA. Incidência do anti-pr3 e anti-mpo nas Vasculites Associadas à ANCA Granulomatose de Poliangeíte Síndrome de Churg- Presença de Anticorpos Wegener Microscópica Strauss ANCA reagente por IFI 78% 59% 67% Anti-PR3 reagente 90% 0% 10% Anti-MPO reagente 0% 62% 17% Foram testadas amostras clínicas com o Imuno-ELISA ANCA (Triagem), cujos resultados demonstram a incidência desses anticorpos nos vários grupos estudados, conforme é mostrado no quadro abaixo: Grupos de Pacientes Nº de Pacientes Nº de Reagentes % de Reagentes Doenças Associadas Glomerulonefrite ,0 Granulomatose de Wegener ,9 ANCA (+) indiferenciado ,9 Doenças Controle Vasculite não associadas a ANCA ,2 Doença Inflamatória Intestinal ,0 Lupus Eritomatoso Sistêmico ,4 Artrite Reumatóide ,5 Outras Doenças Autoimunes ,0 Normais Saudáveis ,3 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 177 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais 56 eram positivas e 121 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ANCA (Triagem) da WAMA em comparação com o Kit IMUNO-CON ANCA da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100

6 05 14 Verdadeiros Positivos RESULTADO 55 Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Negativos Negativos ,21 95,9 Foi também estudado a reatividade cruzada em indivíduos portadores de outras doenças autoimunes ou reagentes para auto-anticorpos, cujos resultados são mostrados no quadro abaixo. Salienta-se que o a ANCA pode ocorrer em pacientes com diversos distúrbios do tecido conjuntivo. Condição Nº de Pacientes Nº de Reagentes Vasculite não associada a ANCA 24 1 Doença Celíaca 8 0 Doença de Crohn 10 0 Colite Ulcerativa 6 0 Tireoidite de Hashimoto 8 0 Artrite Reumatóide 8 1 ENA Positivo* - Anti-La Anti-Ro Anti-Sm Anti-RNP 8 0 TOTAL 96 5 (5,2%) * Anticorpos contra Antígenos Nucleares Extraíveis PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 36,67 6,54 Desvio Padrão 2,70 0,47 7,38% 7,31% a. Precisão Inter-Ensaio b. A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em replicatas, sendo 10 replicas para cada lote estudado e por operadores diferentes. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 36,41 6,75 Desvio Padrão 2,50 0,37 6,88% 5,60% RECUPERAÇÃO Amostras com concentrações conhecidas de ANCA foram misturadas com diluições apropriadas de outras amostras positivas com quantidades conhecidas de ANCA. Foi então determinado os níveis de ANCA das amostras misturadas e calculado a porcentagem de recuperação a partir dos valores obtidos. Os resultados são mostrados na tabela a seguir: Mistura Amostra 1 Amostra 2 UE/mL UE/mL % Recuperação (UE/mL) (UE/mL) Esperada Obtida Obtida/Esperada Mistura 1 9,3 91,4 51,2 50,3 98,2 Mistura 2 9,3 34,6 22,4 21,9 97,8 Mistura 3 34,6 59,1 48,3 46,9 97,1 ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi demonstrada interferência significativa para as seguintes substâncias nas concentrações indicadas: Hemoglobina (até 2g/L), Bilirrubina (até 342 µmol/l) e Fator Reumatóide (até 100 UE/mL). 8. Suero control negativo (2 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente ( - 25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2-8 C. SOLUCIÓN DE LAVADO (2): Disolver el contenido (en polvo) de 1 botella en 1000 ml de agua destilada o desionizada. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente 350 μl. Conservar entre 2 y 8 C. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. DILUYENTE DE MUESTRA (5): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. CALIBRADOR ANCA (7): Listo para usar. Producido de sueros humanos que contiene ANCA. La concentración en UE/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 y 8 C. Lo uso de Calibrador ANCA es para determinar resultados cualitativos y los valores en unidades. El Calibrador ANCA deben utilizarse siempre en cada prueba realizada. SUERO DE CONTROL NEGATIVO (8): listo para usar. Suero humano negativo para ANCA. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene conservante. SUERO DE CONTROL POSITIVO (9): Listo para usar. Suero humano positivo para ANCA. Usar puro, en otras palabras, no diluido. La concentración en UE/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2-8 C. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). ESPECÍMENES Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a - ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO Micropipeta de 5μl y 100μl y puntas de pipeta. Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de micro placa con filtro de 450 nm. Lavador de microplaca. Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 1 pocillo para el Calibrador ANCA (7), 1 pocillo para lo suero control negativo (8) y 1 pocillo para el suero control positivo (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 100μl de diluyente de muestra (5). 2. Preparar dilución de muestras a ser testeadas a 1:101 (5 µl de muestra µl de la muestra diluyente (5)). 3. Dispensar 100 µl de lo calibrador ANCA (7), suero control negativo (8), suero control positivo (9) y muestras (1:101 ) en los pocillos de la placa de microtitulación. Usar 1 pocillo para el blank, si la lectura es monocromático, dispensando 100μl de diluyente de muestra (5). Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 4 vezes con la solución de lavado (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el

7 13 06 R E F ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA La presencia de Anticuerpos Anticitoplasma de Neutrófilos (ANCA) en pacientes con vasculitis fue observado por primera vez en 1982 por Davies. ANCA es un grupo de autoanticuerpos dirigidos contra proteínas contenidas en los gránulos de los neutrófilos. Estos anticuerpos pueden ser detectados por inmunofluorescencia indirecta, en los neutrófilos fijados en etanol, produciendo padroned de coloración conocidas. Hay dos tipos de ANCA (p y c-anca), que están presentes en pacientes con vasculitis de pequeños vasos. La p-anca ocurre en vasculitis, como la glomerulonefritis, síndrome de Churg-Strauss, la poliarteritis nodosa, lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide. Lo principal antígeno para lo p-anca es la mieloperoxidasa (MPO). Otros antígenos objectivo, como la elastasa de leucocito humano y lactoferrina, también se han asociado con el patrón de fluorescencia de lo p-anca. Anti-MPO anticuerpos también pueden ser producidas por los medicamentos, como la hidralazina, clozapina y L-triptófano. La exposición ocupacional a los factores ambientales, como polvo de sílice puede conducir a una glomerulonefritis progresiva anti-mpo positiva. La medición de los ANCAs específicos para MPO constituye un instrumento importante para la evaluación de subtipos clínicos en el contexto de vasculitis sistémicos. Lo c-anca se dirigen principalmente contra la proteinasa 3 (Pr3). Elastasa y catepsina son algunos de los antígenos menores que pueden llevar a reacciones de c-anca. LA PR3 es una serina proteinasa neutral, ubicado en granulos azurofilos de los neutrófilos. Los anticuerpos contra el antígeno PR3 son marcadores de la Granulomatosis de Wegener (GW), vasculitis sistémica necrotizante. Varios estudios han establecido una correlación directa entre los niveles de anti-pr3 anticuerpos y la fase activa de GW. La concentración de suero anti-pr3 aumenta dramaticamente durante las exacerbaciones de la enfermedad (frecuencia de 90%), siendo las recidivas suelen ir acompañados por aumentos significativos en los títulos. La presencia de c-anca también es indicadora de otras enfermedades, tales como glomerulonefritis necrosante inmune idiopática y las enfermedades inflamatorias intestinales, como la colitis ulcerativa. Lo Imuno-ELISA ANCA (Triaje) de WAMA es una prueba inmunoenzimática para la triaje de la presencia de anti- MPO y anti-pr3 (ANCA) en suero humano. La especificidad de los resultados positivos pueden ser identificados por determinación individual de anticuerpos anti-mpo y anti-pr3. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de micrititulación se recubren con antígeno purificado de PR3 y MPO (fase sólida). Cuando anticuerpos especificos anti-mpo y anti-pr3 están presentes en la muestra de suero, se ligan a las proteínas de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugando anti-igg humana de cabra marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos anti-mpo y anti-pr3. Un sustrato (TMB) es adicionado, el cual detecta la presencia de anticuerpos a través del cambio de color en la reacción. Una solución stop para bloquear la reacción enzimática es adicionada y se mide la absorbancia de la reacción a 450 nm). La concentración de anticuerpos es directamente proporcional a la intensidad de la reacción. Los resultados se expresan en unidades ELISA por mililitro (UE/mL) y se reportan como reactivo o no reactivo. LIMITE DE DETECÇÃO O limite de detecção do teste foi determinado como 3,3 UE/mL com base em 60 replicatas do blank e 10 replicatas de cada uma de seis amostras com baixos níveis de anticorpos. LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA ANCA (Triagem) da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Entretanto, devido a possibilidade de falsos resultados reagentes e interferência com outras doenças, resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados reagentes podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA ANCA (triagem) contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, anti-h e antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. PRESENTACIÓN DEL KIT R E F E - 96 determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos purificados MPO y PR3 (12 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (2 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana de cabra marcada con peroxidasa (1 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (1 x 60 ml) 6. Solución Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador ANCA (1 x 1,75 ml) 8. Suero control negativo (1 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos purificados MPO y PR3 (24 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (4 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana de cabra marcada con peroxidasa (2 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (2 x 60 ml) 6. Solución Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador ANCA (2 x 1,75 ml)

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The presence of Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA) in patients with vasculitis was observed for the first time in 1982 by Davies. ANCA is a group of autoantibodies directed against proteins contained in the neutrophils granules. These antibodies can be detected through indirect immunofluorescence, in neutrophils fixed in ethanol, producing stains of known patterns. There are two types of ANCA (p and c-anca), which are present in patients with vasculitis of small vessels. The p-anca occurs in vasculitis, such as glomerulonephritis, Churg-Strauss syndrome, polyarteritis nodosa, systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. The main antigen for the p-anca is the myeloperoxidase (MPO). Other target antigens, such as the human leukocyte elastase and lactoferrin, have also been associated with the pattern of fluorescence of p-anca. Anti-MPO antibodies can also be produced through medicines, such as hydralazine, clozapine and L-tryptophan. The occupational exposure to environmental factors, such as silica dust, can lead to positive anti-mpo progressive glomerulonephritis. The measurement of ANCAs for MPO constitutes an important tool for the evaluation of clinical subtypes in the context of systemic vasculitis. The c-anca is mainly directed against proteinase 3 (Pr3). Elastase and cathepsin are some of the minor antigens that can lead to reactions of c-anca. The PR3 is a neutral serine proteinase, located in azurophilic granules of neutrophils. The antibodies against the antigen PR3 are markers of Wegener's granulomatosis (WG), a systemic necrotizing vasculitis. Several studies have established a direct correlation between the levels of anti-pr3 antibodies and the active phase of GW. The concentration of serum anti-pr3 increases dramatically during the exacerbations of the disease (frequency of 90 % ), being the relapses usually accompanied by significant increases in titers. The presence of c-anca is also indicator of other diseases, such as idiopathic immune necrotizing glomerulonephritis, and intestinal inflammatory diseases, such as ulcerative colitis. The Imuno-ELISA ANCA (Screening) from WAMA is an immunoenzymatic test for screening for the presence of anti-mpo and anti-pr3 (ANCA) in human serum. The specificity of positive results can be identified by individual determination of antibodies anti-mpo and anti-pr3. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with purified PR3 and MPO antigens (solid phase). When specific anti-mpo or anti-pr3 antibodies are present in the serum sample, they bind to proteins from the solid phase. Material not bound is removed by washing. A goat anti-human IgG conjugated to peroxidase will bind to the anti-mpo and anti-pr3 antibodies present. A substrate (TMB) is added, which detects the presence of antibodies through the change of color in the reaction. A stop solution to block the enzymatic reaction is added and the reaction absorbance is measured at 450 nm. The concentration of antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. The results are expressed as ELISA units per milliliter (EU/mL) and reported as reactive or non-reactive. DETECTION LIMIT The detection limit for the test was determined as of 3.3 EU/mL based on 60 replicates of blank and 10 replicates for each one of six samples with low levels of antibodies. LIMITATIONS OF USE The test Imuno- ELISA ANCA (Screening) from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. However, due to the possibility of false results reagents and interference with other diseases, results repeatedly reactive should always be interpreted with clinical information from the patient and with the results of other laboratory tests. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false reactive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA ANCA (screening) contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, anti-h and Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the same care when disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature ( -25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Do not it reuse any one of the reagents. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. KIT PRESENTATION R E F E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with purified MPO and PR3 antigen (12 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (2 bottles) 3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (1 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (1 x 15 ml) 5. Sample Diluent (1 x 60 ml) 6. Stop Solution (1 x 15 ml) 7. ANCA Calibrator (1 x 1.75 ml) 8. Negative Serum Control (1 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (1 x 1.75 ml) 10. Instructions for use R E F E determinations 1. Microplate with wells coated with purified MPO and PR3 antigen (24 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (4 bottles) 3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (2 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (2 x 15 ml) 5. Sample Diluent (2 x 60 ml) 6. Stop Solution (2 x 15 ml) 7. ANCA Calibrator (2 x 1.75 ml) 8. Negative Serum Control (2 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (2 x 1.75 ml) 10. Instructions for use

9 11 08 True Positives RESULTS 55 False True Falses Sensitivity Especificity Positives Negatives Negatives ,21 95,9 Cross-reactivity was also studied in individuals carrier of other autoimmune diseases or reactive to auto-antibody, whose results are shown in the table below: It should be noted that the ANCA can occur in patients with various disorders of the connective tissue. Condition Number of Patients Number of Reagents Non ANCA associated vasculitis 24 1 Celiac Disease 8 0 Crohn's disease 10 0 Ulcerative Colitis 6 0 Hashimoto's thyroiditis 8 0 Rheumatoid arthritis 8 1 ENA Positive * - Anti-La Anti-Ro Anti-Sm Anti-RNP 8 0 TOTAL 96 5 (5.2%) * Antibodies against extractable nuclear antigens PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of sera, one reactive and one non-reactive, in replicates. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 36,67 6,54 Deviation Standard 2,70 0,47 7,38% 7,31% a. Inter-Assay Precision b. The inter-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one reactive and another not reactive, in replications, being 10 replicas for each lot and by different operators. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 36,41 6,75 Deviation Standard 2,50 0,37 6,88% 5,60% RECOVERY Samples with known concentrations of ANCA were mixed with appropriate dilutions of other positive samples of known ANCA amounts. The levels of ANCA were determined from the mixed samples and the percent recovery calculated from the values obtained. The results are shown in the table below: Mixture Sample 1 Sample 2 EU/mL EU/mL % Recovery (EU/ml) (EU/ml) Expected Observed Observed/Expected Mixture Mixture Mixture ANALYTICAL SPECIFICITY It was not demonstrated significant interference for the following substances at the indicated concentrations: Hemoglobin (up to 2g/L), bilirubin (up to 342 µmol/l) and rheumatoid factor (up to 100 EU/mL). REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature ( 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. WASH SOLUTION (2): Dissolve the contents (powder) of 1 bottle in 1000 ml of distilled or deionized water. During each wash cycle, each well must be washed filled with approximately 350µL. Keep at 2-8ºC. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. GOAT ANTI-HUMAN IgG LABELED WITH PEROXIDASE (3): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE (TMB) (4): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. SAMPLE DILUENT (5): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains sulfuric acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. ANCA CALIBRATOR (7): ready to use. Made from human sera containing ANCA. The concentration in EU/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. The use of ANCA Calibrator is to determine qualitative results and values in units. The ANCA Calibrator must always be used in each test performed. NEGATIVE SERUM CONTROL (8): ready for use. Negative human serum to ANCA. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains preservative. POSITIVE SERUM CONTROL (9): ready to use. Positive human serum to ANCA. Use it as is (do not dilute it). The concentration in EU/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at ºC. Frozen specimens must be carefully homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freeze and thawing as this may lead to false results. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Micropipette of 5 µl and 1000 µl and tips. Deionized water for dilution of the wash buffer Microplate shaker. Incubator at 37 C. Microplate reader with 450nm filter. Microplate washer. Absorbent paper. Container for material disposal PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the established plan for the plate distribution, use 1 well for the ANCA Calibrator (7), 1 well for the negative serum control (8) and 1 well for the positive serum control (9). Use 1 well for the "blank", which will contain only 100 µl of the sample diluent (5). 2. Prepare dilution of samples to be tested at 1:101 (5 µl of sample µl of the sample diluent (5)). 3. Pipette 100 µl of the ANCA calibrator (7), negative serum control (8), positive serum control (9) and samples (1:101) in the wells of the microtitre plate. Use a well for the "blank" if the reading is monochromatic, dispensing 100µ l of the sample diluent (5). Use individual tips for each sample, to avoid contamination.. 4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at room temperature for 30 minutes. 6. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid contamination between the cavities. 7. Wash the plate 4 times with the Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of the Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 3 times (total of 4 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or

10 09 10 automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 9. Pipete 100µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank. 10. Cover the plate with adhesive foil and incubate at room temperature for 30 minutes. 11. Repeat the steps 6 to Pipete 100µl of the chromogen substrate (TMB) (4) into each of the cavity wells, except on the blank. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 13. Incubate at 37 C for 30 minutes,protecting from light. 14. Block the reaction by dispensing 100µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the blank. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 15. Read the abosrbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank within 30 minutes. NOTE: it is recommended to use a dual wavelength using a reference filter of 630 nm when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 100 µl of the ANCA calibrator (7), negative control (8), positive control (9), samples (1:101) and "blank" (monochrome reading) in their respective cavities. 2. Mix for 30 seconds and incubate at room temperature for 30 minutes. 3. Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 4 times with wash solution (2). 4. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 5. Pipette 100µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 6. Mix for 30 seconds and incubate at room temperature for 30 minutes. 7. Repeat the steps 3 and Pipete 100µl of the chromogen substrate (4) into each of the cavity wells, except on the blank. Change in reaction color will occur wherever peroxidase is found. 9. Mix for 30 seconds and incubated at room temperature for 30 minutes. Protected from light 10. Pipette 100µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. 11. Mix for 30 seconds. 12. Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength (450/630 nm), within 30 minutes. A B C D E F G H EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPILATE 1 Blank Neg. Coltrol Pos. Control Calibrator A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the O.D readings are used without subtracting. If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation of results. Determine the concentration of the samples through the following equation: Warning: It is recommended that the qualitative results are reported as "REACTIVE" or "NOT REACTIVE". The samples with results equal to or above EU/mL are considered Reactive. TEST VALIDATION: The test is valid if: The O.D. of the blank,which contains only the sample diluent, mus be less than 0.3 at 450 nm. The value of O.D. of the Calibrator must be equal to or greater than 1.0, otherwise the test must be repeated. The concentration of negative control must be less than 10 EU/mL. The O.D. of the Calibrator must be greater than the O.D. of the negative control and lower the O.D. of the positive control. INTERPRETATION OF THE RESULTS REACTIVE : concentration of the sample > EU/mL. NON-REACTIVE : concentration of the sample < EU/mL. IMPORTANT: 1. The above values are provided only as guidance for the interpretation of results. It is recommended that each laboratory establish its own reference range. 2. Values higher than EU/ml should be tested to determine the specificity (MPO/p-ANCA or PR3/c-ANCA) and antibody levels. EXPECTED VALUES The expected values in a normal population is negative. However, 4% of apparently healthy asymptomatic individuals can test reactive for anti-mpo antibodies. Recent studies show that patients diagnosed with rheumatoid arthritis, chronic polyarthritis, undifferentiated disease of the connective tissue and SLE, have anti-mpo or p-anca antibodies. The immunosuppressive therapy, initiation or change of treatment should not start only on the basis of reactive result of anti-mpo antibody, but on careful clinical observations. The following table illustrates the frequency of ANCA specific PR3 and MPO in the serum of 112 patients with ANCA associated vasculitis. Incidence of anti-pr3 and anti-mpo in ANCA Associated Vasculitis Presence of antibodies Wegener's Microscopic Churg-Strauss granulomatosis polyangiitis Syndrome ANCA reactive through IFI 78% 59% 67% Anti-PR3 reactive 90% 0% 10% Anti-MPO reactive 0% 62% 17% Clinical samples were tested with the Imuno-ELISA ANCA (Screening), whose results show the incidence of these antibodies in several groups studied, as shown in the table below: Groups of Patients Number of Patients SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 177 samples of serum obtained from a reference laboratory, of which 56 were positive and 121 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ANCA (Screening) from WAMA in comparison to the Kit IMUNO-CON ANCA from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 Number of Reagents % of Reagents Associated Diseases Glomerulonephritis Wegener's granulomatosis ANCA ( +) undifferentiated Control Diseases Non ANCA associated vasculitis Inflammatory Intestinal Disease Systemic Lupus Erythematosus Rheumatoid arthritis Other autoimmune diseases Health Normals O.D of the Sample x UE/mL of the Calibrator = UE/mL of the Sample O.D. of the Calibrator