ACA (Triagem) Imuno-ELISA

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1 MS BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Hanly, J.G.: Antiphospholipid syndrome: an overview. CMAJ;16 (13): , Nash, M.J., Camilleri, R.S., Kunka, S., Mackie, I.J., Machin, S.J., Cohen, H.: The anticardiolipin assay is required for sensitive screening for antiphospholipid antibodies. J Thromb Haemost; 2: , Miyakis, S., Lockshin, M.D., Atsumi, T., Branch, D.W.et al.: International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost; 4: , Naess, I.A., Christiansen, S.C., Cannegieter, S.C., Rosendaal, F.R. and Hammerstroem, J.: A prospective study of anticardiolipin antibodies as a risk factor for venous thrombosis in a general population (the HUNT study). J Thromb Haemost; 4: 44-9, Degroot, P.G. and Derksen, R.H.W.M.: The importance of measuring anticardiolipin antibodies. J Thromb Haemost; 4: 41 43, Lim, W.: Antiphospholipid antibody syndrome. American Society of Hematology, Hematology 09: , Devreese, K. and Hoylaerts, M.F.: Challenges in the Diagnosis of the Antiphospholipid Syndrome. Clin Chem; 56 (6): , 10.. Espinosa, G. and Cervera, R.: Clinical Management of Antiphospholipid Syndrome-Related Thrombosis. Op Autoimm J; 2: 67-75, Tripodi, A., Groot, P.G., Pengo, V.: Antiphospholipid syndrome: laboratory detection, mechanisms of action and treatment. J Int Med; Keeling, D., Mackie, I., Moore, G.W., Greer, I.A., Greaves, M. and British Committee for Standards in Haematology: Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome. British J Haem; 157: 47-5, 12. Imuno-ELISA ACA (Triagem) Kit para a determinação qualitativa de anticorpos IgA, IgG e IgM Anti-cardiolipina (ACA) no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative determination of IgA, IgG and IgM anti-cardiolipin (ACA) antibodies in human serum by enzyme immunoassay (ELISA). Kit para determinación cualitativa de anticuerpos IgA, IgG y IgM anticardiolipina (ACA) en el suero humano por enzimoinmunoensayo (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones Edição I: Rev. 11/12 EC R E P WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax Obelis S.A. Boulevard Général Wahis Brussels, BELGIUM Phone. +(32) Fax : +(32) SAC

2 01 1 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA Os anticorpos anti-fosfolípides são um grupo heterogêneo de auto anticorpos contra os fosfolipídios carregados negativamente. São principalmente detectados através do teste de anti-cardiolipina (ACA), do teste falso positivo para a sífilis ou do teste do anticoagulante lúpico. Estes três testes detectaram anticorpos relacionados, embora não necessariamente idênticos. Além disso, mais do que um destes testes pode ser por vezes necessário para identificar anticorpos anti-fosfolípides. O teste ELISA constitui um método altamente sensível para a detecção de anticorpos anti-fosfolípides. A presença de anticorpos anti-cardiolipina ajuda a identificar pacientes em risco de trombose venosa e/ou arterial, muitas vezes acompanhada por trombocitopenia, constituindo uma síndrome conhecida como síndrome anti-fosfolípides. Isto ocorre mais comumente em pacientes com lupus eritematoso sistêmico (LES), ou com doenças semelhantes ao lupus, em que os critérios para o LES não são preenchidos. Existe a presença de níveis elevados de anticorpos anticardiolipina na trombose, perda fetal, trombocitopenia e em diversos outros distúrbios. Foram encontrados níveis reduzidos de anticorpos anti-cardiolipina numa série de alterações clínicas, não relacionados com a síndrome antifosfolípides. Por conseguinte, os níveis reduzidos destes anticorpos são de importância limitada. Os anticorpos anti-cardiolipina da classe IgG e IgA parecem estar mais proximamente associados à síndrome antifosfolípides do que os anticorpos da classe IgM. No entanto, os anticorpos IgM parecem responder melhor ao tratamento. Podem ser identificados níveis baixos de anticorpos IgM em outras doenças autoimunes, como a artrite reumatoide, a Síndrome de Sjögren primária, o lupus eritematoso induzido por drogas, a doença de Lyme e a Sífilis. O Imuno-ELISA ACA (Triagem) da WAMA é um teste imunoenzimático para a triagem da presença de anticorpos de classe IgA, IgG e IgM anti-cardiolipina no soro humano, para a avaliação do risco de trombose em indivíduos com Lupus Eritematoso Sistêmico (LES) ou doenças semelhantes ao lupus. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados de cardiolipina (fase sólida). Quando anticorpos anti-cardiolipina específicos, de classe IgA e/ou IgG e/ou IgM estão presentes na amostra de soro, eles ligam-se às proteínas da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-iga/igg/igm humana de cabra marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos específicos presentes. Um substrato (TMB) é adicionado, cuja presença de anticorpos é detectada pela mudança de cor na reação. Uma solução stop para bloqueio da reação enzimática é adicionada e a absorbância da reação é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos é proporcional à intensidade da cor da reação. Os resultados são expressos em unidades ELISA por mililitro (UE/mL) e informados como reagentes ou não reagentes. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígeno purificado de cardiolipina (12 tiras removíveis com cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (2 frascos) 3. Conjugado anti-iga/igg/igm humana de cabra marcada com peroxidase (1 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (1 x 60 ml) 6. Solução Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador-ACA (1 x 1,75 ml). Soro Controle Negativo (1 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso R E F E determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígeno purificado de cardiolipina (24 tiras removíveis com cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (4 frascos) 3. Conjugado anti-iga/igg/igm humana de cabra marcada com peroxidase (2 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (2 x 60 ml) 6. Solução Stop (2 x 15 ml) Reactividad cruzada también se ha estudiado en individuos con otras enfermedades autoinmunes, cuyos resultados se muestran en la tabla abajo: Condición Nº de Pacientes Nº de Reactivos Enfermedad celíaca 0 Tiroiditis de Hashimoto 0 Artritis Reumatoide 1 LES 1 Vasculitis 0 ADNdc 3 TOTAL 4 5 (10,5%) LIMITACIÓN DEL USO Ÿ Lo test Imuno-ELISA ACA (Triaje) de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, el diagnóstico no se puede hacer sólo con el resultado de ACA, siempre considerando la información clínica del paciente y los resultados de otras pruebas de laboratorio. Ÿ Los pacientes con sífilis activo o suero positivo pueden mostrar niveles altos de ACA. Pruebas de confirmación de la sífilis deben realizarse si hay evidencia clínica o de laboratorio. Ÿ Una variedad de enfermedades infecciosas puede conducir a resultados reactivos transitorios para ACA. En estes casos, nueva muestra se debe probar después de un intervalo apropiado. Ÿ Pruebas de tres clases de inmunoglobulinas para ACA siempre debería llevarse a cabo, ya que la realización de la investigación de una sola clase de anticuerpo para ACA pueden dar lugar a falsos resultados negativos. Ÿ Los anticuerpos anti-cardiolipina también se ha asociado a síndromes neurológicos como trastornos isquémicos transitorios y migraña. Ÿ Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. Ÿ La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 ºC. 2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja del kit. 3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa. 4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles. 5. Lo Imuno-ELISA ACA (Triaje) contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, anti-h (excepto el Suero Control Positivo) y antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar los tests.. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad. 13. No reutilizar cualquier uno de los reactivos. 14. Desechar el material siguiendo regulaciones locales. 15. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y eliminación de los materiales. TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones.

3 17 02 Muestras Clinicas probadas con el Imuno-ELISA ACA (Triaje), cuyos resultados muestran la incidencia de estos anticuerpos en varios grupos de estudio, como se muestra en la siguiente tabla: Grupos de Pacientes Nº de Pacientes Nº de Reactivos % de Reactivos Síndrome antifosfolípido (SAF) ,7 LES sin confirmación de APS 1 12,5 Enfermedad celíaca 0 0,0 Tiroiditis de Hashimoto 0 0,0 Artritis Reumatoide 1 12,5 Normal 5 3 3,5 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST Sensibilidad analítica: El límite de detección de la prueba se determinó como 5,2 UE/mL. En un estudio de 302 muestras de suero obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 172 eran positivos y 130 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de Imuno-ELISA ACA (Triaje) de WAMA. Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100 Verdaderos Positivos RESULTADO 172 Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Negativos Negativos ,4 94,9 PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intraensayo se determiné mediante el ensayo 2 muestras de sueros, un reactivo y un noreactivo, en replicas. Muestras Positivas Alta Baja Número de Veces Promedia de las Absorbancias 25,52 5,7 Desviación Estándar 1,45 0,33 5,67% 5,65% b.precisión Interensayo c.la precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestras de suero, un reactivo y otro no reactiva, en replicas, siendo 10 réplicas para cada lote y por operadores diferentes. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 25,3 5,91 Desviación Estándar 1,5 0,36 6,11% 6,22 % RECUPERACIÓN Muestras con concentraciones conocidas de ACA, en el rando de lo calibrador, se mezclaron con diluciones apropiadas de otras muestras positivas con cantidades conocidas de ACA. Los niveles de ACA se determina a partir de las muestras y calculado el por ciento de recuperación calculado a partir de los valores obtenidos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla: Muestra Gama Teste % Recuperacion 1 43,4-39,3 100,0 112,3 2 41,7-332,2 7,6 110,6 3 4,9-399,5 97,6 110, ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No se demostró una injerencia significativa de las siguientes sustancias en las concentraciones indicadas: Hemoglobina (hasta 2 g/l), bilirrubina (hasta 342 µmol/l) y Factor reumatoideo (hasta 100 UE/mL), trygliceryde (hasta 37 mmol/l) y colesterol (hasta 13 mmol/l). 7. Calibrador-ACA (2 x 1,75 ml). Soro Controle Negativo (2 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Ÿ MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-ºC. Ÿ SOLUÇÃO DE LAVAGEM (2): Dissolver o conteúdo (pó) de 1 frasco em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 L. Manter entre 2-ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Ÿ CONJUGADO ANTI-IgA/IgG/IgM HUMANA DE CABRA MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2- ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Ÿ SUBSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2- ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. Ÿ DILUENTE DE AMOSTRA (5): pronto para uso. Estável entre 2-ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Ÿ SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4). Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Ÿ CALIBRADOR-ACA (7): pronto para uso. Produzido de soro humano contendo ACA. A concentração em UE/mL e a data de vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2- ºC. O uso do Calibrador-ACA é para determinar resultados qualitativos e valores em unidades. O Calibrador- ACA deve ser sempre utilizado em cada ensaio realizado. Ÿ SORO CONTROLE NEGATIVO (): pronto para uso. Soro humano negativo para ACA. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém conservante. Ÿ SORO CONTROLE POSITIVO (9): pronto para uso. Soro humano positivo para ACA. Usar puro, ou seja, não diluído. A concentração em UE/mL e a data do vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-ºC. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2 - ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2- ºC por 4 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a - ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Ÿ Micropipeta de 5 µl e 1000 µl e ponteiras. Ÿ Água deionizada para diluição do tampão de lavagem. Ÿ Agitador de microplaca. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Ÿ Lavadora de microplaca. Ÿ Papel absorvente. Ÿ Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm.

4 De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 1 cavidade para o calibrador-aca (7), 1 cavidade para o soro controle negativo () e 1 cavidade para o soro controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o blank, a qual conterá somente 100 µl do diluente de amostra (5). 2. Preparar diluição das amostras a serem testadas a 1:101 (5µL da amostra + 500µL do diluente de amostra (5). 3. Dispensar 100µL do calibrador-aca (7), soro controle negativo (), soro controle positivo (9) e amostras (1:101) nas cavidades da microplaca. Usar uma cavidade para o blank se a leitura for monocromática, dispensando nesta 100µL do diluente de amostra (5). Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 7. Lavar a placa 4 vezes com a solução de lavagem (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µL de solução de lavagem (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 3 vezes este procedimento (total de 4 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio.. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 100µL do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir as etapas 6 a. 12. Dispensar 100µL do substrato cromógeno (TMB) (4) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, protegendo da luz. 14. Bloquear a reação dispensando 100µL da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank, dentro de 30 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 100µL do calibrador-aca (7), controle negativo (), controle positivo (9), amostras (1:101) e blank (leitura monocromática) nas respectivas cavidades. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 4 vezes com solução de lavagem (2). 4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5. Pipetar 100µL do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 7. Repetir as etapas 3 e 4.. Pipetar 100µL do substrato cromógeno (4) em cada cavidade da placa, exceto no blank. Haverá mudança na cor da reação onde houver peroxidase. 9. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a T.A. por 30 minutos. Protegendo da luz 10. Pipetar 100µL da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 30 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A A CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. Determinar la concentración de las muestras a través de la siguiente ecuación: D.O. de la Muestra D.O. de lo Calibrador x UE/mL de lo Calibrador = UE/mL de la Muestra Advertencia: Se recomienda que los resultados cualitativos se reportan como "REACTIVO" o "NO REACTIVO". Las muestras con resultados iguales o superiores a UE/mL se consideran Reactiva. VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del "blank", que contiene solamiente lo diluyente de muestra, debe ser inferior a 0,3 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de lo Calibrador debe ser igual o superior a 0.2, de lo contrario, la prueba debe repetirse. La concentración de lo controle negativos debe ser inferior a 10 UE/mL. La D.O. de lo calibrador debe ser mayor que el D.O. del control negativo y menor que el D.O. del control positivo. Lo control positivo debe tener valores en el rango indicado en la etiqueta de la botella. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS REACTIVO: concentración de la muestra > UE/ml. NO REACTIVO: concentración de la muestra < UE/ml. IMPORTANTE: 1. Los valores anteriores son sólo un guía para interpretación de los resultados. Es recomendable que cada laboratorio establecer su propio rango de referencia. VALORES ESPERADOS La incidencia de la clase de anticuerpos en Lupus Eritematoso Sistémico se muestra en la tabla siguiente: Clase de anticuerpos IgG IgA IgM Cualquiera de las clases Incidência Incidencia de ACA en varias condiciones clínicas se muestra en la siguiente tabla: Condicion Clínica Asociada con ACA Incidência Trombosis venosa recurrente 2-71 Aborto espontáneo recurrente 2-64 Mielitis transversa 50 Anemia hemolítica 3 Trombocitopenia Oclusión arterial Hipertensión pulmonar - 40

5 Preparar dilución de muestras a ser testeadas a 1:101 (5 µl de muestra µl de la muestra diluyente (5). 3. Dispensar 100 µl de lo calibrador ACA (7), suero control negativo (), suero control positivo (9) y muestras (1:101 ) en los pocillos de la placa de microtitulación. Usar 1 pocillo para el blank, si la lectura es monocromático, dispensando 100μl de diluyente de muestra (5). Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación.. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 4 vezes con la solución de lavado (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 3 veces este procedimiento (total de 4 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados.. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir los pasos 6 al. 12. Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (TMB) (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a 37 C durante 30 minutos, protegerlo de la luz. 14. Bloquear la reacción dispensando 100μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 30 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 100μl del calibrador ACA (7) control negativo (), control positivo (9), muestras (1:101), y blank (lectura monocromatica) en sus respectivos pocillos. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 4 vezes con solución de lavado (2). 4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7. Repetir los passos 3 y 4.. Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Cambio de color aparecerá donde está presente la enzima peroxidasa. 9. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Protegido de la luz 10. Dispensar 100 µl de la Solución Stop (6) en cada uno de los pocillos de la microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 30 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle pos. Calibrador A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. Determinar a concentração das amostras através da seguinte equação: D.O da Amostra x UE/mL do Calibrador = UE/mL da Amostra D.O do Calibrador Atenção: Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam informados como REAGENTES ou NÃO REAGENTES. As amostras com resultados superiores ou iguais a UE/mL são consideradas Reagentes. VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente o diluente de amostra, deve ser menor do que 0,3 a 450 nm. O valor da D.O. do Calibrador deve ser igual ou superior a 0,2, caso contrário o teste deve ser repetido. A concentração do controle negativo deve ser inferior a 10 UE/mL. A D.O. do Calibrador deve ser superior à D.O. do controle negativo e inferior à D.O. do controle positivo. O controle positivo deve estar dentro da faixa indicada na etiqueta do frasco INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS REAGENTE :concentração da amostra > UE/mL. NÃO REAGENTE :concentração da amostra < UE/mL. IMPORTANTE:Os valores acima servem apenas como orientação para a interpretação dos resultados. É recomendável que cada laboratório determine seus próprios valores de referência normais. VALORES ESPERADOS A incidência de classe de anticorpos no Lupus Eritematoso Sistêmico é apresentada no quadro abaixo: Classe de Anticorpos Incidência IgG IgA IgM 5-33 Qualquer das classes 53 Incidência de ACA em várias condições clínicas é apresentada no quadro abaixo: Condição Clínica Associada a ACA Incidência Trombose Venosa Recorrente 2-71 Aborto Espontâneo Recorrente 2-64 Mielite Transversa 50 Anemia Hemolítica 3 Trombocitopenia Oclusão Arterial Hipertensão Pulmonar - 40

6 05 14 Foram testadas amostras clínicas com o Imuno-ELISA ACA (Triagem), cujos resultados demonstram a incidência desses anticorpos nos vários grupos estudados, conforme é mostrado no quadro abaixo: Grupos de Pacientes Nº de Pacientes Nº de Reagentes % de Reagentes Síndrome Anti-Fosfolípides (APS) ,7 LES sem confirmação de APS 1 12,5 Doença Celíaca 0 0,0 Tireoidite de Hashimoto 0 0,0 Artrite Reumatóide 1 12,5 Normais 5 3 3,5 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE SENSIBILIDADE ANALÍTICA O limite de detecção do teste foi determinado como 5,2 UE/mL. Em um estudo realizado com 302 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais 172 eram positivas e 130 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ACA (Triagem) da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Positivos RESULTADO 171 Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Negativos Negativos ,42 94,9 PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 25,52 5,7 Desvio Padrão 1,45 0,33 5,67% 5,65% b. Precisão Inter-Ensaio c. A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em replicatas, sendo 10 replicas para cada lote estudado e por operadores diferentes. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 25,3 5,91 Desvio Padrão 1,5 0,36 6,11% 6,22% RECUPERAÇÃO Amostras com concentrações conhecidas de ACA, na faixa do calibrador, foram misturadas com diluições apropriadas de outras amostras positivas com quantidades conhecidas de ACA. Foram então determinados os níveis de ACA das amostradas misturadas e calculado a porcentagem de recuperação a partir dos valores obtidos. Os resultados são mostrados na tabela a seguir: Amostra Faixa Teste % Recuperação 1 43,4-39,3 100,0 112,3 2 41,7-332,2 7,6 110,6 3 4,9-399,5 97,6 110, 6. Solución Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador ACA (2 x 1,75 ml). Suero control negativo (2 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS Ÿ MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente ( - 25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2 - C. Ÿ SOLUCIÓN DE LAVADO (2): Disolver el contenido (en polvo) de 1 botella en 1000 ml de agua destilada o desionizada. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente 350 μl. Conservar entre 2 y C. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Ÿ CONJUGADO ANTI-IGA/IGG/IGM HUMANA DE CABRA MARCADA CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2 - C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Ÿ SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2 - C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. Ÿ DILUYENTE DE MUESTRA (5): listo para usar. Estable entre 2 - C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Ÿ SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Estable C hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. Ÿ CALIBRADOR ACA (7): Listo para usar. Producido de sueros humanos que contiene ACA. La concentración en UE/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 y C. Lo uso de Calibrador ACA es para determinar resultados cualitativos y los valores en unidades. El Calibrador ACA deben utilizarse siempre en cada prueba realizada. Ÿ SUERO DE CONTROL NEGATIVO (): listo para usar. Suero humano negativo para ACA. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2 - C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene conservante. Ÿ SUERO DE CONTROL POSITIVO (9): Listo para usar. Suero humano positivo para ACA. Usar puro, en otras palabras, no diluido. La concentración en UE/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 - C. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2 - ºC). ESPECÍMENES Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2- ºC, por 4 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a - ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO Ÿ Micropipeta de 5μl y 100μl y puntas de pipeta. Ÿ Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Ÿ Agitador de microplaca. Lector de micro placa con filtro de 450 nm. Ÿ Lavador de microplaca. Ÿ Papel absorbente. Ÿ Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 1 pocillo para el Calibrador ACA () y 1 pocillo para el suero control positivo (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 100μl de diluyente de muestra (5).

7 13 06 R E F ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA Los anticuerpos antifosfolípidos es un grupo heterogéneo de autoanticuerpos contra los fosfolípidos cargados negativamente. Principalmente, son detectados por prueba de anti-cardiolipina (ACA) prueba, de la prueba de sífilis falsos positivos hasta la prueba o test de anticoagulante lúpico. Estas tres pruebas detectaran anticuerpos relacionados, aunque no necesariamente idénticos. Además, más de una de estas pruebas puede ser necesario para identificar anticuerpos anti-fosfolipidos. La prueba de ELISA es un método altamente sensible para la detección de anticuerpos antifosfolípidos. La presencia de anticuerpos anti-cardiolipina ayuda a identificar a los pacientes en riesgo de tromboembolia venosa y/o trombosis arterial, que suele ir acompañada de la trombocitopenia, constituyendo un síndrome conocido como síndrome antifosfolípido. Esto ocurre con mayor frecuencia en los pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), o con enfermedad similar al lupus, en que los criterios para el LES no se cumplen. Los niveles elevados de anticuerpos anticardiolipina se encuentran en trombosis, pérdida fetal, trombocitopenia y en varios otros trastornos. Niveles más bajos de anticuerpos anti-cardiolipina se encontraron en una serie de cambios clínicos, no relacionados con el síndrome antifosfolípido. Por lo tanto, los niveles reducidos de estos anticuerpos son de escasa importancia. Los anticuerpos anti-cardiolipina IgG e IgA están más asociados con el síndrome antifosfolípido que los anticuerpos IgM. Sin embargo, los anticuerpos IgM parecen responder mejor al tratamiento. Bajos niveles de anticuerpos de tipo IgM se encuentran en otras enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide, síndrome de Sjögren primario, lupus eritematoso inducido por medicamentos, la enfermedad de Lyme y la sífilis. Lo Imuno-ELISA ACA (Triaje) de WAMA es una prueba inmunoenzimática, para la triaje la presencia de anticuerpos clase IgA, IgG e IgM anti-cardiolipina en el suero humano, para la evaluación del riesgo de trombosis en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) o enfermedades similares al lupus. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de micrititulación se recubren con antígeno purificado de cardiolipina (fase sólida). Cuando anticuerpos anti-cardiolipina específicos, de clase IgA y/o IgG y/o IgM están presentes en la muestra de suero, se ligan a las proteínas de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugando anti-iga/igg/igm humana de cabra marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos especificos presentes. Un sustrato (TMB) es adicionado, el cual detecta la presencia de anticuerpos a través del cambio de color en la reacción. Una solución stop para bloquear la reacción enzimática es adicionada y se mide la absorbancia de la reacción a 450 nm). La concentración de anticuerpos es directamente proporcional a la intensidad de la reacción. Los resultados se expresan en unidades ELISA por mililitro (UE/mL) y se reportan como reactivo o no reactivo. PRESENTACIÓN DEL KIT R E F E - 96 determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos purificados de cardiolipina (12 tiras extraíbles con pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (2 botellas) 3. Conjugado anti-iga/igg/igm humana de cabra marcada con peroxidasa (1 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (1 x 60 ml) 6. Solución Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador ACA (1 x 1,75 ml). Suero control negativo (1 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos purificados de cardiolipina (24 tiras extraíbles con pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (4 botellas) 3. Conjugado anti-iga/igg/igm humana de cabra marcada con peroxidasa (2 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (2 x 60 ml) ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi demonstrada interferência significativa para as seguintes substâncias nas concentrações indicadas: Hemoglobina (até 2g/L), Bilirrubina (até 342 µmol/l) e Fator Reumatóide (até 100 UE/mL), Triglicérides (até 37 mmol/l) e Colesterol (até 13 mmol/l). Foi também estudado a reatividade cruzada em indivíduos portadores de outras doenças autoimunes, cujos resultados são mostrados no quadro abaixo: Condição Nº de Pacientes Nº de Reagentes Doença Celíaca 0 Tireoidite de Hashimoto 0 Artrite Reumatóide 1 LES 1 Vasculite 0 dsdna 3 TOTAL 4 5 (10,5%) LIMITAÇÕES DE USO Ÿ O teste Imuno-ELISA ACA (Triagem) da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Entretanto, o diagnóstico não pode ser feito somente com o resultado do ACA, devendo sempre ser considerado as informações clínicas do paciente e os resultados de outros testes laboratoriais. Ÿ Pacientes com sífilis ativa ou soropositivos podem apresentar níveis elevados de ACA. Testes confirmatórios para sífilis deveriam ser realizados se houver evidências clínicas ou laboratoriais. Ÿ Uma variedade de doenças infecciosas pode levar a resultados transitórios reagentes para ACA. Nesses casos nova amostra deveria ser testada após um intervalo apropriado. Ÿ Testes para as três classes de imunoglobulinas para ACA deveriam ser sempre realizados, uma vez que a realização da pesquisa de uma única classe de anticorpo para ACA pode levar a resultado falso negativo. Ÿ Os anticorpos anti-cardiolipina têm também sido associados com síndromes neurológicas tais como distúrbios isquêmicos transitórios e enxaqueca. Ÿ Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Ÿ Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados reagentes podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. Ÿ A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA ACA (Triagem) contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, anti-h e antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar os testes.. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições.

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The antiphospholipid antibodies is a heterogeneous group of auto antibodies against the negatively-charged phospholipids. They are primarily detected though the anti-cardiolipin (ACA) test, through syphilis false positive test or through lupus anticoagulant test. These three tests detected related antibodies, though not necessarily identical. In addition, more than one of these tests may be necessary to identify anti-phospholip antibodies. The ELISA test is a highly sensitive method for the detection of antiphospholipid antibodies. The presence of anti-cardiolipin antibodies helps identify patients at risk of venous and/or arterial thrombosis, often accompanied by thrombocytopenia, constituting a syndrome known as antiphospholipid syndrome. This occurs most commonly in patients with systemic lupus erythematosus (SLE), or with disease similar to lupus, in which the criteria for the LES are not met. Elevated levels of anti-cardiolipin antibodies are found in thrombosis, fetal loss, thrombocytopenia and in various other disorders. Lower levels of anti-cardiolipin antibodies were found in a series of clinical changes, not related to the antiphospholipid syndrome. Therefore, the reduced levels of these antibodies are of limited importance. The anti-cardiolipin IgG and IgA antibodies are more closely associated with the antiphospholipid syndrome than with the IgM antibodies. However, IgM antibodies seem to respond better to treatment. Low levels of IgM antibodies are found in other autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis, primary Sjogren syndrome, systemic lupus erythematosus induced by drugs, Lyme disease and syphilis. The Imuno-ELISA ACA (Screening) from WAMA is an immunoenzymatic test, for screening the presence of IgA, IgG and IgM anti-cardiolipin antibodies in human serum, for the risk assessment of thrombosis in patients with Systemic Lupus Erythematosus (SLE) or diseases similar to lupus. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with purified cardiolipin antigen (solid phase). When specific IgA and/or IgG and/or IgM anti-cardiolipin antibodies are present in the serum sample, they bind to the solid phase proteins. Material not bound is removed by washing. A goat anti-human IgA/IgG/IgM conjugated to peroxidase will bind to the specific antibodies. A substrate (TMB) is added, which detects the presence of antibodies through the change of color in the reaction. A stop solution to block the enzymatic reaction is added and the reaction absorbance is measured at 450 nm. The concentration of antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. The results are expressed as ELISA units per milliliter (EU/mL) and reported as reactive or nonreactive. KIT PRESENTATION R E F E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with purified cardiolipin antigen (12 removable strips with wells each) 2. Washing solution - powder (2 bottles) 3. Goat anti-human IgA /IgG/IgM conjugate marked with peroxidase (1 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (1 x 15 ml) 5. Sample Diluent (1 x 60 ml) 6. Stop Solution (1 x 15 ml) 7. ACA Calibrator (1 x 1.75 ml). Negative Serum Control (1 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (1 x 1.75 ml) 10. Instructions for use R E F E determinations 1. Microplate with wells coated with purified cardiolipin antigen (24 removable strips with wells each) 2. Washing solution - powder (4 bottles) 3. Goat anti-human IgA /IgG/IgM conjugate marked with peroxidase (2 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (2 x 15 ml) 5. Sample Diluent (2 x 60 ml) 6. Stop Solution (2 x 15 ml) 7. ACA Calibrator (2 x 1,75 ml) EU/mL), triglycerides (up to 37 mmol/l) and cholesterol (up to 13 mmol/l). Cross-reactivity was also studied in individuals with other autoimmune diseases, whose results are shown in the table below: Condition Number of Patients Number of Reagents Celiac Disease Hashimoto's thyroiditis Rheumatoid arthritis SLE Vasculitisds DNA TOTAL 4 5 (10,5%) LIMITATIONS OF USE The test Imuno- ELISA ACA (Screening) from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. However, the diagnosis cannot be made only with the result of ACA, always considering the clinical information of the patient and the results of other laboratory tests. Patients with active or serum positif for syphilis may show high levels of ACA. Confirmatory tests for syphilis should be performed if there is clinical or laboratory evidence. A variety of infectious diseases can lead to transitory reactive results for ACA. In such cases new sample should be tested after an appropriate interval. Tests for the three immunoglobulins classes for ACA should always be carried out, as the realization of the research of a single class of antibody for ACA can lead to false-negative result. The anti-cardiolipin antibodies has also been associated with neurological syndromes such as transient ischemic disorders and migraine. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false reactive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2 - ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA ACA (screening) contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, anti-h and Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the same care when disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature ( -25ºC) before starting the test.. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Do not it reuse any one of the reagents. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions.