AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA CLÍNICA E MICROBIANA DE

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1 Braz J Periodontol - September volume 23 - issue 03 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA CLÍNICA E MICROBIANA DE DOIS PROTOCOLOS TERAPÊUTICOS PERIODONTAIS Clinical and microbial efficacy of two periodontal therapeutic protocols José Roberto Cortelli 1, Juliana Guimarães Santos 2, Taís Browne de Miranda 3, Diego Faria Querido 4, Davi Romeiro Aquino 1, Sheila Cavalca Cortelli 1, Fernando de Oliveira Costa 5 1 Professor-assistente Núcleo de Pesquisa Periodontal UNITAU 2 Bióloga e Técnica de laboratório CEPEO UNITAU 3 Assistente de pesquisa CEPEO UNITAU 4 Bolsista Iniciação Cientifica Odontologia UNITAU 5 Professor-adjunto de Periodontia - UFMG Recebimento: 09/07/13 - Correção: 12/08/13 - Aceite: 28/08/13 RESUMO O objetivo principal deste ensaio clínico randomizado foi o de avaliar a efetividade clínica e microbiana da terapia de raspagem dental realizada por quadrante em relação a raspagem dental em estágio único. Para responder este objetivo foram incluídos 20 indivíduos com periodontite crônica avançada distribuídos aleatoriamente em 2 grupos a saber: Grupo 1 (10 indivíduos-raspagem Quadrante), Grupo 2 (10 indivíduos-raspagem Estágio Único). Mensurações longitudinais foram realizadas durante todo o ensaio confrontando parâmetros clínicos de profundidade de sondagem e nível de inserção clínica para avaliação das terapias. Análise microbiana quantitativa (qpcr) da espécie A. actinomycetemcomitans e P. gingivalis em função do evento raspagem dental foi realizada em toda a população do estudo nas etapas pré raspagem [] e pós raspagem []. As amostras intrassulculares para a análise do qpcr foram coletadas dos cinco dentes com maior evidência de atividade de doença periodontal ou seja, com as maiores profundidades de sondagem associadas a perda de inserção clínica. Os dados obtidos foram analisados por teste t pareado (p<0.05). Os resultados mostraram que em ambos os grupos houve uma melhora clínica tanto do parâmetro profundidade de sondagem quanto do nível de inserção clinica, já para a frequência dos patógenos testados verificou-se que similarmente ocorreu redução microbiana nos dois grupos investigados. Após análise dos dados conclui-se que ambos protocolos terapêuticos aqui investigados foram eficazes tanto clínica quanto microbiologicamente. UNITERMOS: Periodontite Crônica, Terapia, Bactérias. R Periodontia 2013; 23: INTRODUÇÃO A periodontite crônica, uma das patologias periodontais, caracteriza-se por ser uma doença infecciosa resultante de inflamação dos tecidos de suporte dos dentes e perda de inserção conjuntiva. Esta patologia ocorre frequentemente em adultos e senis, mas pode ser encontrada em jovens (AAP, 1999). Das inúmeras espécies microbianas que podem ser identificadas na cavidade bucal humana, muitas habitam as bolsas periodontais de indivíduos com periodontite crônica (Paster et al., 2006). Embora sofram a influencia de fatores locais e sistêmicos, algumas destas bactérias tem sido apontadas como o agente etiológico primário para a instalação e desenvolvimento desta patologia. Dentre estas espécies bacterianas destacam-se Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens e Peptostreptococcus micros entre outras (Socransky & Haffajee 2002; Nishihara & Koseki, 2004; Cortelli et al., 2005; Feng & Weinberg, 2006). A terapia periodontal visa diretamente controlar e, quando possível, eliminar fatores causais responsáveis pela doença. Inicialmente os métodos de higiene bucal praticados pelo paciente devem ser considerados e, frequentemente, 24 An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN

2 reeducados quando a eficiência destes procedimentos não são observadas. Além disso, a intervenção profissional no sentido de eliminar placa e cálculo também é primordial. Logo, o sucesso terapêutico está no restabelecimento da saúde periodontal e na prevenção de uma futura progressão da doença (Kinane et al., 2008). Procedimentos mecânicos profissionais visando à modificação do biofilme dental e a eliminação de irritantes locais são procedimentos básicos na terapia periodontal inicial e têm sido executados em uma sistemática de sessões semanais. Todavia, nem todos os pacientes ou todos os sítios periodontais respondem favoravelmente a terapia mecânica convencional. Pela natureza infecciosa da doença periodontal outras estratégias mecânicas bem como o uso coadjuvante de antibióticos sistêmicos ou antissépticos bucais tem sido propostos. Logo, a proposta deste estudo do tipo ensaio clínico randomizado foi avaliar a eficácia clínica e microbiana de dois protocolos terapêuticos periodontais, a saber, de raspagem e alisamento radicular por quadrante em relação ao protocolo raspagem em estágio único também designado por Quirynen et al., (1995) One-stage full-mouth disinfection em indivíduos portadores de periodontite crônica avançada. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo foi previamente submetido e posteriormente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Taubaté sob número 490/10. Os participantes da pesquisa foram devidamente esclarecidos e informados sobre o estudo, e incluídos após a anuência do mesmo que o fez assinando o termo de consentimento livre e esclarecido. AMOSTRAGEM A população incluída foi selecionada por meio de uma amostra de conveniência dos indivíduos que buscaram tratamento odontológico na clínica de pós-graduação da Universidade de Taubaté, sendo arrolados consecutivamente os indivíduos acessíveis até a composição dos grupos. Neste sentido, os 2 grupos experimentais, designados Grupo Raspagem Quadrante e Grupo Raspagem Estágio Único foram compostos por 10 indivíduos cada. TERAPIA PERIODONTAL Grupo 1 (Raspagem Quadrante) Foram realizados procedimentos de raspagem dental por quadrante (30 min. por quadrante) com intervalos semanais entre as sessões. Grupo 2 - (Raspagem Estágio Único) Foram realizados procedimentos de raspagem dental em estágio único (24 horas) divididos em duas sessões (60 min. por sessão) em An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN dois dias consecutivos com a inclusão da aplicação de gel de CHX (1%) nas bolsas após a raspagem. Escovação lingual por 1 min. com gel de CHX (1%), e bochecho no início e ao final de cada sessão com CHX 0.2% por 30 segundos (sendo a forma de gargarejo nos últimos 10 segundos). E uso caseiro de CHX 0.2% por 60 dias após o termino da raspagem em estágio único. Os procedimentos de raspagem dental em ambos os grupos foram realizados com curetas tipo Gracey e McCall e limas tipo Hirschfield. Quatro jogos independentes de raspadores foram utilizados para cada grupo alocado. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO Os indivíduos potencialmente aptos a participar do estudo foram os que preencheram os seguintes requisitos: (1) ter recebido diagnóstico de periodontite crônica avançada (Armitage, 1999); (2) presença de no mínimo 20 dentes naturais em boca; (3) ter entre 30 e 55 anos de idade; (4) não ter realizado tratamento periodontal seis meses antecedentes ao início do estudo. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Foram excuídos indivíduos com história de doenças sistêmicas e fazendo uso de antibióticos ou antissépticos 3 meses antecedentes ao início do estudo. Indivíduos apresentando dentes com envolvimento de bifurcação ou trifurcação classe II ou classe III; portadores de próteses removíveis e aparelho ortodôntico também foram excluídos. EXAMES CLÍNICOS PERIODONTAIS Os participantes foram submetidos a exame periodontal completo em dois momentos [] para estabelecimento do diagnóstico periodontal; [] 90 dias após o término da intervenção da raspagem. As mensurações de profundidade de bolsa e avaliação do nível de inserção clínica foram obtidas em todos os dentes presentes (exceto os terceiros molares) com sonda periodontal manual (PCPUNC 15 Hu-friedy Mfg Co Inc. Chigago IL). AVALIAÇÃO MICROBIANA Análise microbiana quantitativa das espécies A. actinomycetemcomitans e P.gingivalis foram realizadas em toda a população do estudo nas etapas pré raspagem [] e pós raspagem []. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISE MICROBIANA As amostras intrassulculares foram coletadas das faces Mesio-Vestibulares do cinco dentes com maior evidencia de 25

3 atividade de doença periodontal. Para maiores detalhes ver Cortelli et al., Extração do DNA A extração do DNA genômico foi realizada com auxílio do kit PureLink Genomic DNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seguindo as instruções do fabricante. O material foi previamente homogeneizado em agitador mecânico por 60 seg. e 500 µl da amostra foi centrifugada (3 min. x rpm). Após remoção do sobrenadante, 180 μl de PureLink Genomic Digestion Buffer e 20 μl de Proteinase K foram adicionados ao pellet formado e cada minitubo foi incubado à 55ºC por 90 min. Após estes procedimentos, 20 μl de RNase A foi adicionado ao lisado, esta solução foi agitada e incubada por 2 min. à temperatura ambiente. Em seguida, 200 μl de PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer e 200 μl de etanol (100%) foram adicionados e o minitubo agitado por 5 seg. até a formação de uma solução homogênea. Ao término deste processo, todo o lisado (aproximadamente 640 μl) foi transferido para um coluna (contendo membrana de sílica - PureLink Spin Column ) acoplado a um tubo de coleção, e este conjunto foi centrifugado à rpm por 1 min.. Em seguida, foram realizadas duas lavagens da membrana com 500 μl de Wash Buffer 1 ( rpm por 1 min.) e Wash Buffer 2 ( rpm por 3 min.). Finalmente, 100 μl de PureLink Genomic Elution Buffer foi utilizado na eluição do DNA fixado na membrana de sílica. DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO MICROBIANA (REAL TIME PCR - QPCR) Confecção do primer e condições da qpcr O primer empregado foi desenhado de acordo com a sequência específica do microrganismo (tanto para A. actinomycetemcomitans quanto P.gingivalis). A busca das sequências alvo desejadas foi feita por consulta ao NCBI Nucleotide Search ( O software Primer 3 ( foi utilizado para a confecção dos primers e a cepa padrão para a confecção do primer de A.a foi a ATCC P.g foi (ATCC 33277). PCR em tempo real foi empregada com o sistema de detecção SYBR Green. A concentração do primer, bem como, as condições ideais para que ocorresse o processo de amplificação (concentrações dos reagentes / determinação das temperaturas envolvidas) foram previamente estabelecidas. A quantificação do microrganismo em análise foi realizada por comparação do Ct, ciclo no qual a fluorescência se torna detectável acima fluorescência de fundo (background), e é inversamente proporcional ao logaritmo do número de moléculas iniciais alvo obtido das amostras com os valores de Ct determinados de uma curva padrão construída com amostras (concentrações) conhecidas de DNA. Em adição, controles positivos e negativos foram empregados no estudo. RESULTADOS Foram incluídos no presente estudo 20 indivíduos, sendo 13 mulheres e 7 homens (38,43 ± 8,87 anos de idade). A tabela 1 mostra a distribuição da população de acordo com o tratamento periodontal realizado. Os parâmetros clínicos profundidade de bolsa e o nível clínico de inserção foram avaliados no momento, previamente aos procedimentos de raspagem dental por quadrante ou em estágio único e no momento, ou seja, em 90 dias após o termino da terapia periodontal. Tabela 1.- A tabela mostra a distribuição da população estudada por tipo de tratamento (raspagem quadrante ou raspagem em estágio único) Grupo 1 n=10 Raspagem quadrante Grupo 2 n=10 Raspagem em estágio único Profundidade de bolsa Nível clínico de inserção Profundidade de bolsa Nível clínico de inserção 4,70 ± 0,70 3,11 ± 1,16 5,24 ± 2,08 3,66 ± 2,04 4,30 ±0,50 2,26 ± 0,93 5,66 ±1,86 3,76 ±1,94 Teste t pareado p=0,0423 p=0,0376 p=0,0223 p=0, An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN

4 DISCUSSÃO O objetivo básico do tratamento da periodontite crônica é a remoção do biofilme dental mineralizado ou não, alterando o ambiente ecológico supra/subgengival e restabelecendo a saúde periodontal. Isto tem sido tradicionalmente realizado a partir de procedimentos de raspagem e alisamento radicular combinado com os cuidados caseiros de higienização bucal realizado de forma eficaz pelo paciente. Os efeitos benéficos desta forma de tratamento periodontal na redução das bolsas periodontais e no ganho de inserção conjuntiva foram demonstrados em vários estudos (Eberhard et al., 2008; Lang et al., 2008; Suvan, 2005; van der Weijden & Timmerman, 2002). Este estudo mostrou que em ambos os parâmetros avaliados ocorreu uma melhora clínica estatisticamente significativa após a raspagem. Muito se discute atualmente sobre a importância de se determinar o perfil microbiológico de pacientes portadores de doença periodontal. No entanto, como a etiologia da doença periodontal é fundamentalmente infecciosa, decorrente da colonização de inúmeras bactérias específicas, a identificação desses patógenos pode ser fundamental para o estabelecimento de um correto diagnóstico e posterior plano de tratamento. Particularmente nesse estudo, onde o perfil da doença periodontal foi estabelecido pelo exame clínico, e pelo exame radiográfico auxiliar, nos propusemos avaliar por meio de qpcr a presença dos patógenos periodontais A. actinomycetemcomitans e P. gingivalis. As figuras de 1 a 4 mostram as reduções microbianas observadas entre o momento inicial e 90 dias após a raspagem. Figura 2 Grupo raspagem em estágio único em relação ao patógeno P. gingivalis antes e após o tratamento periodontal Figura 3 Grupo raspagem quadrante em relação ao patógeno A. actinomycetemcomitans antes e após o tratamento periodontal Figura 4 Grupo raspagem quadrante em relação ao patógeno P. gingivalis antes e após o tratamento periodontal Figura 1 Grupo raspagem em estágio único em relação ao patógeno A. actinomycetemcomitans antes e após o tratamento periodontal An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN Indivíduos adultos com saúde periodontal parecem não apresentar níveis subgengivais detectáveis de A.actinomycetemcomitans, enquanto estudos realizados em indivíduos com periodontite crônica demonstram uma ocorrência deste patógeno de 10% a 50% (Papapanou et 27

5 al., 1997; Lie et al., 1998). A periodontite crônica é a forma de doença periodontal destrutiva mais comum em adultos, embora possa acometer indivíduos jovens. A patologia, em geral, progride lentamente e apresenta relação com a presença de irritantes locais o que se mostra compatível com a severidade da doença (AAP, 1999). A. actinomycetemcomitans pode ainda ser detectado em proporções variáveis em quadros de gengivite em que há exclusivamente o acometimento dos tecidos de proteção do elemento dentário. Nosso estudo mostrou que este patógeno foi reduzido de forma significante em ambos os grupos. E, esta redução microbiana acompanhou a melhora dos parâmetros clínicos investigados. P. gingivalis é um patógeno periodontal anaeróbio, gram-negativo e desempenha um papel relevante no desenvolvimento e na manutenção da doença periodontal. Quando o indivíduo aloca este microrganismo este pode causar destruição tecidual e óssea alveolar em função de um número elevado de fatores de virulência. Além disso este patógeno parece ter um papel importante na progressão dos casos de periodontite crônica, logo sua extinção pode ser fundamental no sucesso clínico do tratamento periodontal (Dzink et al., 1988). Como observado para o patógeno A. actinomycetemcomitans esta bacteria também apresentou redução estatísticamente significativa após o tratamento periodontal em ambos os grupos. site from each patient. All clinical and microbial data were analyzed by t student test (p<0.05) and the results showed that both periodontal treatment exhibited good results. Then, we concluded that both treatments provide clinical and microbial benefits for all included patients. UNITERMS: Chronic Periodontitis; therapy; bacteria AGRADECIMENTO Este estudo foi suportado pelo projeto número CNPq / Edital Universal CONCLUSÃO Após a realização do presente estudo e analisando os seus resultados podemos concluir que ambos os protocolos terapêuticos aqui propostos foram eficazes tanto clínica quanto microbiologicamente. Logo, estas duas modalidades terapêuticas podem ser empregadas em indivíduos com periodontite crônica. ABSTRACT The aim of this randomized clinical trial was to evaluate the effectiveness of clinical and microbial effects of scaling and root planing using quadrant debridement or full-mouth debridement. A total of 20 patients diagnosed severe chronic periodontitis were enrolled in this survey: Ten subjects were allocated in quadrant debridement group and 10 subjects in full-mouth debridement group. Longitudinal clinical measurements such as periodontal pocket depth as well as clinical attachment loss were investigated at baseline and at 90 days in both therapies. Also, microbial analysis were performed by qpcr to detect the presence of A. actinomycetemcomitans and P. gingivalis. We collected subgingival samples of 5 severe 28 An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Academia Americana de Periodontia. Annals of Periodontology 1999; 4: Paster BJ, Olsen I, Aas JA, Dewhirst FE. The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral sites. Periodontol ; 42: Socransky SS, Haffajee AD. Dental biofilms: difficult therapeutic targets. Periodontology ; 28: Nishihara T, Koseki T. Microbial etiology of periodontitis. Periodontol ; 36: Cortelli JR, Cortelli SC, Jordan S, Haraszthy VI, Zambon JJ. Prevalence of periodontal pathogens in Brazilians with aggressive or chronic periodontitis. J Clin Periodont 2005; 32: Feng Z, Weinberg A. Role of bacteria in health and disease of periodontal tissues. Periodontol ; 40: Kinane DF, Lindhe J, Trombelli L. Chronic periodontitis. In: Lindhe J, Lang NP, Karring T editors. Clinical periodontology and implant dentistry, 5th edn. Oxford: Blackwell Publishing Ltd, 2008: Quirynen M, Bollen CM, Vandekerckhove BN, Dekeyser C, Papaioannou W, Eyssen H. Full- vs. partialmouth disinfection in the treatment of periodontal infections: Short term clinical and microbiological observations. J Dent Res 1995; 74: Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Annals of Periodontology 1999; 4: Eberhard J, Jepsen S, Jervoe-Storm PM, Needleman I, Worthington HV. Full-mouth disinfection for the treatment of adult chronic periodontitis. Cochrane Database Syst Rev 2008: 23: CD Lang NP, Tan WC, Krahenmann MA, Zwahlen M. A systematic review of the effects of full-mouth debridement with and without antiseptics in patients with chronic periodontitis. J Clin Periodontol 2008: 35: Suvan JE. Effectiveness of mechanical nonsurgical pocket therapy. Periodontol : 37: van der Weijden GA, Timmerman MF. A systematic review on the clinical efficacy of subgingival debridement in the treatment of chronic periodontitis. J Clin Periodontol 2002: 29(Suppl.3): Papapanou PN, Baelum V, Luan WM, Madianos PN, Chen X, Fejerskov O et al. Subgingival microbiota in adult chines: prevalence and relation to periodontal disease progression. J Periodontol 1997; 68(7): Lie MA, van der Weijden GA, Timmerman MF, Loos BG, van Steenbergen TJ, van der Velden U. Oral microbiota in smokers and non-smokers in natural and experimentally-induced gingivitis. J Clin Periodontol 1998; 25(8): Dzink JL, Socransky SS, Haffajee AD. The predominant cultivable microbiota of active and inactive lesions of destructive periodontal diseases. J Clin Periodontol 1988; 15: Endereço para correspondência José Roberto Cortelli Rua Expedicionário Ernesto Pereira, 110 CEP: Taubaté SP Telefone: + 55(12) jrcortelli@uol.com.br An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN