EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum spp. L.)

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1 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum spp. L.) Cassiana de Oliveira 1, Roberson Dibax 2, Aurea Ferriani Portes 3, João Carlos Bespalhok Filho 4. 1 Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2 Doutor em Agronomia pela Universidade Federal do Paraná, Pesquisador da Universidade Federal do Paraná (Curitiba, PR); 3 Doutora em Agronomia pela Universidade Federal do Paraná, Profª co-orientadora da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 4 Doutor em Agricultura pela Nagoya University, Prof. orientador da Universidade Federal do Paraná (Curitiba, PR). Endereço para correspondência: João Carlos Bespalhok Filho: bespa@ufpr.br RESUMO: A cana-de-açúcar tem grande importância econômica já que pode ser usada como matéria prima para a fabricação de rapadura, melado, aguardente, açúcar e etanol. Devido este fator, cada vez mais o melhoramento genético vem sendo estudado, para tanto é preciso de protocolos eficientes para sua multiplicação in vitro. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da auxina 2,4-D sobre a indução de calos embriogênicos para a variedade RB Além disso, avaliar diferentes concentrações de 2,4-D na manutenção dos calos embriogênicos e verificar se houve formação de brotações com a citocinina BAP para a variedade RB As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 C. Os resultados foram satisfatórios e revelaram que todos os tratamentos com 2,4-D têm a capacidade de formar calos embriogênicos. Observou-se que em 40 dias de cultivo estes calos embriogênicos ainda apresentam capacidade de formar brotações e todos os tratamentos utilizados formaram brotações. Quanto ao aumento da quantidade de massa embriogênica, percebeu-se que não há necessidade de grande quantidade de auxina na manutenção dos calos embriogênicos, já que todos os tratamentos tiveram, em média, o mesmo crescimento. PALAVRAS-CHAVE: fitorreguladores, 2,4-D, BAP, embriogênese indireta. ABSTRACT: The sugarcane has great economic importance since it can be used as raw material for the manufacture of brown sugar, molasses, brandy, sugar and ethanol. Because of this factor, more breeding is being studied, for both protocols is necessary for its efficient in vitro multiplication. The aim of this study was to evaluate the effect of 2,4-D on embryogenic callus induction for variety RB Moreover, to evaluate different concentrations of 2,4-D in the maintenance of embryogenic callus and see if there shoot formation with BAP for variety RB Cultures were maintained in a growth chamber with a temperature of 25 ± 2 C. The results were satisfactory and showed that all treatments with 2,4-D have the capacity to form embryogenic callus. It was observed that in 40 days of these embryogenic calli still have the ability to form shoots and all treatments formed shoots. As for the increased amount of embryogenic mass, it was noted that there is need for large amounts of auxin in the maintenance of embryogenic callus, since all treatments had, on average, the same growth KEYWORDS: phytoregulators, 2,4-D, BAP, indirect embryogenesis. 1

2 INTRODUÇÃO A cana-de-açúcar (Saccharum spp. L.) é uma gramínea perene de clima tropical que tem um aspecto importante, tanto social quanto econômico no Brasil, já que é utilizada para a produção de açúcar, álcool, alimentos, entre outros produtos (SILVA, et al., 2009). Em decorrência disso, sua multiplicação deve ser rápida e livre de doenças, o que ocorre na micropropagação. Um dos caminhos do cultivo in vitro é a embriogênese somática indireta, que envolve a formação de embriões a partir de tecidos somáticos (RAEMARKERS et al., 1995). As células somáticas não são naturalmente embriogênicas, o que torna necessário uma fase de indução para que essas células adquiram competência embriogênica (NAMASIVAYAM, 2007). Esta via, portanto, requer a desdiferenciação das células, ou seja, o desenvolvimento de calos que vão originar células embriogênicas determinadas com a capacidade de totipotência. Diversos fatores estão envolvidos neste processo como a utilização de reguladores de crescimento, o efeito do genótipo, o tipo de explante, os meios de cultura e as condições de cultivo (SILVA et al., 2009). As auxinas são as principais reguladoras de crescimento utilizadas para a indução de calos embriogênicos. A auxina natural ácido indolacético (AIA) é rapidamente oxidada in vitro, por isso não é adequada para meios de cultura (REIS et al., 2007). Para substituir a AIA é comumente utilizada a auxina sintética 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D). Depois que os calos já adquiriram a capacidade da totipotência, é necessário a utilização de outros reguladores no meio de cultura para que estas células se diferenciem em brotações. Para promover essas brotações são necessárias as citocininas, que são hormônios que estimulam a divisão celular, regulando o crescimento do vegetal. Dentre as citocininas, o 6- bencilaminopurina (BAP) tem sido muito eficaz para promover a multiplicação em diversas espécies (ROGALSKI et al., 2003). No entanto, após muito tempo de subcultivos no meio de cultura com 2,4-D os calos embriogênicos perdem a capacidade de formarem brotações. Neste sentido, este estudo procura estabelecer o tempo em média que os calos embriogênicos continuam com essa capacidade e a concentração adequada de 2,4-D para a formação de calos embriogênicos das variedades RB e RB

3 MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de Plantas do Setor de Ciências Agrárias do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil. Todas as culturas in vitro respectivas a cada experimento foram mantidas em sala de crescimento, sob luz fluorescente branca fria com densidade de fluxo fotossintético de 40 µmol.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 25 ± 2 C. As culturas foram realizadas em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e 2 cm de altura, contendo 30 ml de meio de cultura e vedadas com filme PVC, ou em frascos de vidro de 6 cm de diâmetro e 9 cm de altura, contendo 40 ml de meio de cultura cada um e vedados com tampa de polipropileno rígido. Todos os meios de cultura tiveram o ph ajustado em 5,7 e foram autoclavados durante 20 min a 120 C. O meio de cultura utilizado nestes experimentos foi o MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) modificado para cana-de-açúcar (MSC), suplementado com arginina, cisteína, ácido cítrico e caseína hidrolisada (anexo 01), sendo diferentes apenas as concentrações dos fitorreguladores usados. INDUÇÃO DA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA Foram utilizadas folhas imaturas (cilindros de aproximadamente 2 x 10 cm) de cana-deaçúcar da variedade RB Os palmitos, contendo os meristemas apicais, foram levados à câmara de fluxo laminar onde foi realizado a desinfecção por 1min em etanol 70% (v/v), em seguida foram enxaguados com água estéril três vezes. Logo depois, ficaram por 20 min em hipoclorito de sódio 2% (v/v) e lavados, novamente, em água estéril por três vezes. Em uma placa de Petri, foram retiradas as folhas mais externas dos palmitos, com o auxilio de um bisturi. Após este procedimento, foram feitos cortes transversais de aproximadamente 3-5 mm nos palmitos para obtenção dos explantes. Em seguida, os explantes foram embebidos em cisteína 50 mg.l -1 autoclavada a fim de minimizar a oxidação. Os explantes foram colocados em meio de cultura com as seguintes concentrações de 2,4-D: 1; 3; 9 e 16 mg.l -1. Sendo, portanto, quatro tratamentos com dez repetições e com cinco explantes por repetição. Os explantes foram incubados em sala de crescimento com temperatura controlada descrita acima, porém, no escuro para diminuir a oxidação, durante 60 dias. Nesta etapa, avaliou-se a formação e as características dos calos, com vista ao processo embriogênico. 3

4 MULTIPLICAÇÃO DOS CALOS Para a multiplicação dos calos embriogênicos, foram comparadas as concentrações 0, 1, 2 e 3 mg.l -1 do mesmo fitorregulador (2,4-D), no entanto, a variedade usada foi a RB Foram feitas cinco repetições por tratamento, com dez explantes por placa. Os calos utilizados nesta etapa já foram subcultivados por duas vezes em meio MSC com as suplementações descritas e com 3 mg.l -1 de 2,4-D. Cada explante consistiu em um aglomerado de calos de aproximadamente 4mm² e com peso aproximado de 13mg, e foram repicados para o meio MSC já descrito com as concentrações de 2,4-D descritas. Após vinte dias avaliou-se a expansão em milímetros, peso e aspectos morfológicos dos calos. INDUÇÃO DE BROTAÇÕES Para induzir as brotações foi usado o meio MS adicionado o fitorregulador BAP na concentração de 0,5 mg.l -1. Cada explante constituiu em um aglomerado de calos de aproximadamente 4mm² e com peso aproximado de 13mg da variedade RB As repetições foram feitas de acordo com o tratamento usado na multiplicação dos calos, ou seja, cada tratamento com 2,4-D teve cinco repetições com dez aglomerados de calos por repetição. Este tratamento ficou dez dias no escuro e dez dias sob iluminação na sala de crescimento. Após vinte dias avaliou-se a formação de brotações. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL O delineamento estatístico utilizado foi inteiramente casualizado. Para comparação de médias, os dados foram submetidos ao Testes de Tukey a 5% de probabilidade, pelo programa estatístico Sisvar. RESULTADOS E DISCUSSÃO A formação de estruturas globulares semelhantes a embriões somáticos (figura 01) foi visualizada em todos os tratamentos. Percebeu-se que todas as concentrações do 2,4-D não obtiveram diferença significativa ao avaliar a formação de calos embriogênicos pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Este resultado indica que as quantidades comparadas deste fitorregulador para a formação de calos embriogênicos são suficientes e todas tiveram resposta positiva na formação de calos embriogênicos da variedade RB

5 Figura 01. Calos embriogênicos de cana-de-açúcar. (A) A seta aponta para a parte indiferenciada da massa. (B) A seta aponta para estruturas globulares semelhantes a embriões somáticos. Barra = 0,5 mm Quanto à oxidação dos explantes, o tratamento contendo 9 mg.l-1 proporcionou a maior taxa de oxidação (44%), no entanto quando aplicado o teste de Tukey percebeu-se que os tratamentos não tiveram diferença significativa, como pode ser observado na figura 02. Figura 02. Porcentagem da formação de calos embriogênicos e de oxidação dos explantes de cana-deaçúcar da variedade RB de acordo com a concentração da auxina 2,4-D. As médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Na primeira avaliação da multiplicação dos calos, após vinte dias, não foi observado nenhuma regeneração e não houve aumento da massa embriogênica. Depois desta avaliação, repicou-se de novo para novos meios de cultura com as mesmas quantidades de reguladores e após vinte dias foi feita nova avaliação. Já na segunda avaliação, ao pesar cada explante de todos os tratamentos, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos 1, 2 e 3 mg.l-1 de 2,4-D, sendo as porcentagens encontradas de, respectivamente, 99 %, 107 % e 97 %. No entanto, notou-se que 5

6 também no tratamento com 0 mg.l -1 as massas embriogênicas tiveram um pequeno aumento de tamanho comparado aos outros tratamentos, de 78%. Percebeu-se que todos os tratamentos tiveram formação de embriões, até mesmo no tratamento controle. Esta formação de embriões no tratamento controle pode ser explicado pela ação residual da auxina presente no meio de cultura anterior. Contudo, Mesquita em 1999, também constatou que houve a formação de calos em folhas de lechieira (Litchi chinensis) quando não houve suplementação de reguladores de crescimento ao meio de cultura. Todos os explantes do tratamento sem o 2,4-D apresentaram oxidação, por liberarem compostos fenólicos nas células danificadas com o corte. Ho e Vasil (1983), ao estudarem a formação de calos embriogênicos no clone de cana-de-açúcar, obtiveram resultados semelhantes aos encontrados neste estudo, onde todos os tratamentos com a auxina tiveram formação de calos. Em 1995, Raemakers et al. relataram que em monocotiledôneas, como a cana-de-açúcar, a embriogênese primária é exclusivamente induzida em meio contendo auxinas, o que se comprovou neste estudo. De acordo com Grattapaglia e Machado (1990), as auxinas como o 2,4-D são essenciais para estimular a formação de calos, mesmo em baixas concentrações. Isto também pode ser observado neste experimento, pois os três tratamentos com presença da auxina tiveram formação de embriões. Ao verificar a presença de brotações nestes tratamentos, percebeu-se que somente no tratamento com 0 mg.l -1 de 2,4-D houve presença de pequenas brotações, o que comprova que esta auxina não desempenha o papel de formar brotações e sim de formar calos embriogênicos. O resultado destes tratamentos pode ser visto na figura 03, onde percebe-se que no tratamento com 0 mg.l -1 de 2,4-D não houve formação de massa embriogênica e sim, de pequenas brotações, enquanto que o tratamento com 3 mg.l -1 foi o que apresentou maior formação de embriões e maior quantidade de massa. Figura 03. Formação de calos embriogênicos e brotações da cana-de-açúcar, sob diferentes concentrações de 2,4-D. Barra = 1 cm 6

7 De acordo com Silveira et al., em 2004, a presença de reguladores de crescimento, como o 2,4-D, no meio de cultura induz a multiplicação de células, o que pode ser comprovado neste estudo já que houve aumento da massa embriogênica na presença desta auxina. Com a avaliação da regeneração, foi observado que todos os tratamentos apresentaram mais de 80% de formação de brotações, enquanto que no tratamento com 0 mg.l -1 da auxina houve apenas 4 % de brotação, como pode ser observado na figura 04. Figura 04. Porcentagem de regeneração e de oxidação dos explantes de cana-de-açúcar de acordo com a concentração da auxina 2,4-D. As médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. O tratamento que veio do meio com 0 mg.l -1 de 2,4-D apresentou maior taxa de oxidação. Watt e colabores (2009), depois de doze semanas de cultivo de calos embriogênicos de cana-de-açúcar do genótipo 88H0019, estes apresentaram aumento do número de embriões, provavelmente devido a exposição prolongada ao 2,4-D. Este resultado mostra que, assim como neste experimento, após vários subcultivos os calos ainda apresentaram capacidade embriogênica, ou seja, podem formar brotações. Cidade et al. (2006) perceberam que após o terceiro mês de cultivo, na presença de 2,4-D, houve perda significativa da capacidade regenerativa dos calos para a variedade RB Este resultado mostra a necessidade de continuar este estudo, para verificar por quanto tempo ainda a variedade RB continua com sua capacidade regenerativa. Cidade e colaboradores (2006) relatam ainda que estes resultados restringem a utilização de calos da variedade RB como tecidos-alvo para transformação genética aos três primeiros meses de subcultivo, de forma que a baixa eficiência de regeneração, não comprometa a obtenção de plantas a partir de células transformadas. 7

8 CONCLUSÃO A partir dos resultados de indução de embriogênese somática indireta pode-se concluir que: Todos os tratamentos analisados com a auxina 2,4-D têm a capacidade de formar calos embriogênicos para a variedade RB de cana-de-açúcar. Após quatro subcultivos os calos embriogênicos ainda formavam brotações e todas as quantidades comparadas tiveram a mesma taxa de formação de brotações. Não é necessária uma maior quantidade de auxina do que as testadas neste trabalho na manutenção de calos embriogênicos da variedade RB855156, já que todos os tratamentos tiveram, em média, a mesma quantidade de crescimento. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CENTELLAS, A. Q.; FORTES, G. R. L.; MULLER, N. T. G.; ZANOL, G. C.; FLORES, R.; GOTTINARI, R. A. Efeito de auxinas sintéticas no enraizamento in vitro da macieira. Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília, v.34, n.2, p , CIDADE, D. A. P.; GARCIA, R. O.; DUARTE, A. C.; SACHETTO-MARTINS, G.; MANSUR, E. Morfogênese in vitro de variedades brasileiras de cana-de-açúcar. Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília, v.41, n.3, p , GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. IN: TORRES, A.C.: CALDAS, L.S. Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasilia. ABCTP/EMBRAPA- CNPH, p , HEERDT, E. Indução da embriogênese somática em cana-de-açúcar f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento) Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, HO, W. J.; VASlL, I. K. Somatic embryogenesis in sugarcane (Saecharurn officinarum L.) The growth of and plant regeneration from embryogenic cell suspension cultures. Annals of Botany, v.51, p , LAMEIRA, O. A.; PINTO, J. E. B. P.; CARDOSO, M. G.; GAVILANES, M. L. Efeito de Thidiazuron na indução e manutenção de calos de erva-baleeira (Cárdia verbenácea L.). Ciência Rural. Santa Maria, v. 27, n. 1, p ,

9 MAGALHÃES, J. S.; SANTOS, M. D. M.; CUNHA FILHO, F. N.; BLUMER, L.; GUERRA, M. P.; TORRES, A. C. Indução de embriogênese somática em genótipos de batata-doce. Horticultura Brasileira. Campinas, v. 24, n. 1, p.79-83, MESQUITA, A.C. Estabelecimento in vitro de lechieira (Litchi chinenesis Sonn.) através do cultivo de segmentos foliares e nodais e análise bioquímica de calos. Dissertação de Mestrado, Curso de Pós-graduação em Agronomia, UFLA, Lavras, MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plantarum. Copenhagen, v. 15, p , NAMASIAVAYAM, P. Acquisition of embryogenic competence during somatic embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands, v. 90, p. 1-8, RAEMARKERS, C. J. J. M.; JACOBSEN, E.; VISSER, R. G. F. Secondary somatic embryogenesis and applications in plant breeding. Euphytica. Netherlands, v. 81, n. 1, p , REIS, I. N. R. S.; LAMEIRA, O. A.; CORDEIRO, I. M. C. C. Efeito do 2,4-D na indução de calos in vitro de Paricá (Schizolobium parahyba var. amazonicum (Huber ex Ducke) Barneby). Revista Brasileira de Biociências. Porto Alegre, v. 5, supl. 2, p , ROGALSKI, M.; GUERRA, M. P.; DA SILVA, A. L. Multiplicação in vitro da ameixeira santa rosa : efeito da citocinina BAP. Revista Brasileira de Fruticultura. Jaboticabal, v. 25, n. 2, p , SAHOO, Y.; PATTNAIK, S.K.; CHAND, P.K. Plant regeneration from callus cultures of Morus indica L. derived from seedlings and mature plants. Scientia Horticulturae. v.69, n.1/2, p.85-98, SILVA, M. M. A.; HERCULANO, L.; CARNEIRO, F. W. O.; WILLADINO, L.; CAMARA, T. Efeito da luminosidade na formação de embriões somáticos de cana-de-açúcar in vitro. In: Jornada de Ensino, Pesquisa e Extensão da UFRPE, 9, 2009, Pernambuco. Anais Jornada de Ensino, Pesquisa e Extensão da UFRPE. Pernambuco, SILVEIRA, V.; BALBUENA, T. S.; SANTA-CATARINA, C.; FLOH, E. I. S.; GUERRA, M. P.; HANDRO, W. Biochemical changes during zygotic embryogenesis in Pinus taeda L. Plant Growth Regulation, v.44, n.2, p ,

10 WATT, M. P.; BANASIAK, M.; REDDY, D.; ALBERTSE, E. H.; SNYMAN, S. J. In vitro minimal growth storage of Saccharum spp. Hybrid (genotype 88H0019) at two stages of direct somatic embryogenic regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands, v.96, p ,

11 Anexo 01. COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA MSC (MURASHIGE e SKOOG, 1962) MODIFICADO PARA CANA-DE-AÇÚCAR Componentes MS Subst. Inorgânicas (mg L -1 ) NH 4 NO KNO H 3 BO 3 6,2 KH 2 PO KI 0,83 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 CoCl 2. 6 H 2 O 0,025 CaCl 2. 2 H 2 O 440 Mg SO 4. 7 H 2 O 370 Mn SO 4. H 2 O 16,90 ZnSO 4. 7 H 2 O 8,6 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 FeSO 4. 7 H 2 O 27,80 Na 2 EDTA 37,30 K 2 SO 4 KCl (NH 4 ) 2 SO 4 Subst. orgânicas Arginina (mg.l -1 ) 50 Ác. Nicotínico (mg.l -1 ) 0,5 Ác. Cítrico (mg.l -1 ) 0,15 Piridoxina (mg.l -1 ) 0,5 Glicina (mg.l -1 ) 2 Tiamina (mg.l -1 ) 1 Mio-inositol (mg.l -1 ) 100 Cisteína (mg.l -1 ) 50 Caseína Hidrolizada (mg.l -1 ) 500 Agar (g.l -1 ) 6 Sacarose (g.l -1 ) 30 ph 5,8 11