ICTR 2004 CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM RESÍDUOS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL Costão do Santinho Florianópolis Santa Catarina

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1 ICTR 2004 CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM RESÍDUOS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL Costão do Santinho Florianópolis Santa Catarina FERMENTAÇÃO DE XILOSE A ETANOL PELA LEVEDURA PICHIA STIPITIS CBS 5774 Hellen Cristiane Maciel Cunha Teresa Cristina Brazil de Paiva Flávio Teixeira da Silva PRÓXIMA Realização: ICTR Instituto de Ciência e Tecnologia em Resíduos e Desenvolvimento Sustentável NISAM - USP Núcleo de Informações em Saúde Ambiental da USP

2 FERMENTAÇÃO DE XILOSE A ETANOL PELA LEVEDURA Pichia stipitis CBS 5774 Hellen Cristiane Maciel Cunha 2, Teresa Cristina Brazil de Paiva 3 e Flávio Teixeira da Silva 3,4 Faculdade de Engenharia Química de Lorena FAENQUIL Rodovia Lorena-Itajubá Km 74,5 Lorena São Paulo Tel (12) Fax (12) flavio@debiq.faenquil.br Resumo O objetivo deste trabalho foi o estudo da produção de etanol pela levedura Pichia stipitis CBS 5774, utilizando-se xilose como substrato em meio sintético sob condições microaeróbicas e em diferentes concentrações (20 g L -1, 40 g L -1, 50 g L -1, 60 g L -1, 80 g L -1 e 100 g L -1 ). As fermentações foram efetuadas em Erlenmeyer de 125 ml, a partir de um meio contendo levedura, xilose, nutrientes e sais minerais dissolvidos em 50 ml de água destilada estéril, sem ajuste prévio de ph. Os frascos foram agitados a 150 rpm em um shaker a 30 C com uma concentração inicial de células de 0,4 g L -1, durante 108 h. As quantidades de xilose consumida e de etanol formado foram determinadas por CLAE usando-se uma coluna Aminex HPX-87H (BioRad). O crescimento celular foi monitorado através de uma curva de calibração que relacionou massa de biomassa seca e densidade ótica (600 nm) das células em suspensão. Os resultados mostraram que, durante o processo fermentativo, o ph do meio diminuiu de 5,9 para valores próximos de 4,0, o crescimento celular e a produção de etanol atingiram máximos com 96 h e 36 h de fermentação, respectivamente, independente da concentração inicial de xilose empregada. O rendimento máximo de etanol (Yp/s = 0,26 ± 0,01) foi obtido a partir das fermentações iniciadas com 40 g L -1 e 50 g L -1 de xilose. A produtividade volumétrica máxima de etanol foi 0,81 g L -1 h -1, obtida a partir de 100 g L -1 de xilose. Palavras-chave: Xilose, fermentação, etanol, Pichia stipitis. 2 Aluna de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Materiais da FAENQUIL 3 Prof(a). Dr(a). do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial da FAENQUIL 4 Prof. Dr. do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Materiais da FAENQUIL 2209

3 Introdução Etanol pode ser usado na substituição de combustíveis fósseis, como a gasolina e o óleo diesel, com a vantagem de ser obtido a partir de fontes renováveis de energia, não contribuindo para a emissão de dióxido de carbono na atmosfera e, conseqüentemente, para o aquecimento global e poluição atmosférica (Von Sivers e Zacchi, 1995, p. 43; Hahn-Hägerdal, 1996, p. 195; Alvo et al., 1996, p. 61; Von Sivers e Zacchi, 1996, p. 131; Grassi, 1998, p. 829, Olsson e Hahn-Hägerdal, 1996, p. 312; Nigam, 2002, p. 107). Os materiais lignocelulósicos são considerados matérias-primas abundantes e renováveis e são ricos em açúcares, que podem ser fermentados a etanol. O bagaço de cana é um resíduo fibroso obtido pelo processamento da cana-de-açúcar, sendo um dos principais sub-produtos lignocelulósicos da agroindústria brasileira. É freqüentemente citado na literatura como o material lignocelulósico mais promissor para a obtenção de açúcares, que podem ser transformados em etanol ou outros compostos químicos (Saska e Oser, 1995, p. 517), já que é uma boa fonte de xilose (Dominguez et al., 1996, p. 49). Em 2001 foram produzidas no Brasil 347 milhões de toneladas de cana de açúcar (Buys, 2002, p. 40), que foram convertidos em açúcar e álcool, gerando quantidades superiores a 63 a 98 milhões de toneladas de bagaço. Esse bagaço tem sido utilizado principalmente dentro das próprias usinas como fonte de vapor e energia, pois substitui o óleo combustível no processo de aquecimento das caldeiras. Mesmo assim, ainda existe um grande excedente que não é utilizado, causando sérios problemas de estocagem e de poluição ambiental. Martin et al. (2001, p. 361) estimaram que as usinas de açúcar e álcool podem liberar de 30% a 50% do bagaço produzido para usos alternativos empregando-se a tecnologia já existente, para a produção de compostos de maior valor econômico, como o etanol (Castro et al., 1995, p. 93; Deschamps et al., 1996, p. 171). Assim, o bagaço de cana pode ser utilizado para a produção de álcool combustível, propiciando uma suplementação à produção convencional de até 15% (Notícias FAPESP, 1998). Os materiais lignocelulósicos são compostos principalmente de celulose, hemicelulose e lignina, sendo que aproximadamente 70% da massa seca desses materiais é constituída de carboidratos (Martinez et al., 2000, p. 526; Lewin e Goldstein, 1991, p. 37). Xilose é o açúcar predominante na fração hemicelulósica de madeiras duras e resíduos agrícolas, como o bagaço de cana, e constitui de 10 a 40% da biomassa lignocelulósica. Logo, tanto do ponto de vista econômico quanto do ambiental, a fração de xilose deve ser fermentada a etanol (Hahn-Hägerdal et al., 1991, p. 131). As leveduras Candida shehatae, Pachysolen tannophilus e Pichia stipitis são conhecidas como as leveduras mais eficientes para a fermentação de xilose a etanol (Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, p. 313; Hahn-Hägerdal et al., 1991, p. 196; McMillan, 1994, p. 413; Roberto et al., 1991, p. 16; Parekh et al., 1988, p. 660; Meyrial et al., 1997, p. 423; Eken-Saraçoglu e Arslan, 2000, p. 855; Prior et al., 1989, p. 21), sendo esta última a mais promissora para aplicação industrial, devido a sua capacidade de fermentar xilose rapidamente com alto rendimento de etanol, sem aparentemente produzir xilitol como subproduto (Gulati et al., 1996, p. 253; Nigam, 2002, p. 108). Xilose e seus oligômeros podem ser obtidos em bons rendimentos a partir do pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a vapor, como demonstrado em trabalhos prévios (Cunha, 1999, p. 54; Silva, 1995, p. 62; Cunha e Silva, 2001, p. 2210

4 289; Cunha et al., 2001, p. 26), com rendimentos da ordem de 60% relativos à massa inicial de xilana presente no bagaço. Entretanto, esses carboidratos fermentescíveis presentes no hidrolisado obtido no pré-tratamento são acompanhados de produtos de degradação de carboidratos e lignina, que são inibidores potenciais de processos fermentativos, que utilizam carboidratos como substratos (Cunha, 1999, p. 15; Cunha e Silva, 2001). Um dos aspectos dos trabalhos que estão sendo desenvolvidos em nosso laboratório está relacionado ao entendimento de como esses compostos afetam os processos fermentativos. Porém, uma das etapas preliminares deste estudo requer o estabelecimento de metodologia relacionada à produção de etanol a partir de meios sintéticos contendo xilose, para em seguida, iniciar-se o trabalho com o hidrolisado produzido a partir do pré-tratamento de bagaço de cana por explosão a vapor. Desta forma, neste trabalho foi investigada a produção de etanol pela levedura Pichia stipitis CBS 5774, utilizando-se meio sintético de xilose em diferentes concentrações sob condições microaeróbicas. Materiais e Métodos Microrganismo e preparo do inóculo A levedura Pichia stipitis (CBS 5774) foi obtida do Central Bureau Voor Schimmelcultures (CBS) The Netherlands e gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Nei Pereira Júnior do Departamento de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) A levedura foi conservada a 4 C, em ágar inclinado contendo extrato de levedura (1,5 g L -1 ); uréia (1,25 g L -1 ); KH 2 PO 4 (1,10 g L -1 ) e xilose (20,0 g L -1 ). Duas alçadas de células foram transferidas do meio sólido para um frasco Erlenmeyer de 1000 ml contendo 500 ml de meio de cultura contendo extrato de levedura (1,5 g L -1 ); extrato de malte (1,5 g L -1 ); peptona (2,5 g L -1 ) e xilose (5,0 g L -1 ). Os frascos foram agitados a 150 rpm por um período entre horas a 30 C. Após este tempo, as células da levedura foram centrifugadas a 2000 rpm e ressuspensas em água destilada estéril. Essa suspensão foi utilizada para inocular os frascos contendo o meio de fermentação sendo a concentração inicial de inóculo em cada frasco de aproximadamente 0,4 g L -1. Fermentação As fermentações foram efetuadas em meios de cultura contendo peptona (3,5 g L -1 ); extrato de levedura (3,0 g L -1 ); K 2 HPO 4 (2,0 g L -1 ); MgSO 4 7H 2 O (1,0 g L -1 ) e (NH 4 ) 2 SO 4 (1,0 g L -1 ) (Tran e Chambers, 1986, p. 843). Xilose em diferentes concentrações (20 g L -1, 40 g L -1, 50 g L -1, 60 g L -1, 80 g L -1 e 100 g L -1 ) foram preparadas separadamente dos frascos contendo meio de cultura e adicionadas antes da inoculação dos microrganismos. Os meios e as soluções de xilose foram autoclavados a 0,5 atm por 10 min. As fermentações foram conduzidas em frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 50 ml de meio líquido, agitados a 150 rpm em shaker a 30 C. Amostras foram retiradas em intervalos de 12 horas para avaliação do ph, crescimento celular, consumo de xilose e produção de etanol. Determinação do crescimento celular e do ph O crescimento celular foi determinado através de uma curva de calibração que relacionou densidade ótica (600 nm) e massa de biomassa seca das células em suspensão. O ph foi determinado em potenciômetro B374 (Micronal). 2211

5 Determinação do consumo de xilose e da produção de etanol As quantidades de xilose consumida e de etanol formado foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em um cromatógrafo Shimadzu CTO-6A em um detector de Índice de Refração, utilizando-se uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) acoplada a duas pré-colunas: uma catiônica e outra aniônica (Bio-Rad) a 45 C e, como eluente, H 2 SO 4 0,005 mol L -1 a um fluxo de 0,6 ml min -1 (Cunha, 1999, p. 41). As amostras analisadas foram previamente filtradas em cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18 (Waters). Determinação do rendimento e da produtividade de etanol produzido nas fermentações As fermentações de xilose utilizando-se a levedura P. stipitis foram monitoradas para a determinação de rendimento e da produtividade volumétrica de etanol (Stambury et al., 1995, p. 52). Para os cálculos foram utilizadas as seguintes fórmulas: Rendimento de etanol: Y p/s = -Δp/Δs = P f - P i / S f - S i onde: S i e S f correspondem às concentrações inicial e final de xilose; P i e P f correspondem às concentrações inicial e final de etanol. Produtividade volumétrica de etanol: Qp = Δp/Δt = P f - P i / t 12 12h onde: P i e P f correspondem às concentrações inicial e final de etanol; t 12 12h corresponde à produtividade nas últimas doze horas de processo. Resultados As fermentações de xilose a etanol por Pichia stipitis CBS 5774 foram feitas sem o ajuste prévio de ph, cujo valor inicial variou de 5,70 a 5,82. Entretanto, após o início das fermentações, observou-se uma diminuição gradativa do ph, que atingiu um patamar próximo de 4,0 após 36 h de fermentação, independentemente da concentração inicial de substrato. A variação da quantidade de xilose consumida e do etanol formado em função do tempo de fermentação é mostrada pelas curvas da figura 1, para as diferentes concentrações iniciais de substrato. Para todas as fermentações, o crescimento celular foi muito rápido nas primeiras 36 h, caracterizando a fase exponencial do processo, que coincidiu com o ápice da produção de etanol (figura 1). O aumento do tempo de fermentação proporcionou o crescimento mais lento das células (fase estacionária), que foi acompanhado por morte celular e consumo do etanol formado (figura 1). Os resultados mostraram que a xilose foi totalmente consumida em 24 h, para as fermentações efetuadas com concentrações iniciais de substrato entre 20 g L -1 e 50 g L -1. Para os experimentos que utilizaram concentrações iniciais de xilose entre 60 g L -1 e 80 g L -1, esse tempo aumentou para 36 h, atingindo 60 h quando a concentração inicial de xilose foi de 100 g L -1. Por outro lado, a concentração de etanol produzida atingiu um máximo em 36 h de processo. O aumento do tempo de fermentação proporcionou o consumo de parte do etanol formado, consumo este mais acentuado para as fermentações efetuadas com concentração inicial de xilose de 20 g L -1, na qual todo o etanol produzido foi consumido para a formação de outros produtos, com 72 h de processo fermentativo. 2212

6 Figura 1. Cinética da produção de etanol (t) e do consumo de xilose ( ) por Pichia stipitis CBS 5774 para diferentes concentrações de substrato. 2213

7 Tabela 1. Concentração máxima de etanol produzido, concentração de xilose residual, rendimento de etanol, rendimento de células e produtividade volumétrica obtidos com 36 h de fermentação a partir de diferentes concentrações iniciais de xilose. Concentração inicial de xilose (g L -1 ) Máxima concentração de etanol (g L -1 ) Xilose residual (g L -1 ) Yp/s (g g -1 ) a Yx/s (g g -1 ) a Qp a 20 4,04 0 0,25 ± 0,01 0,23 ± 0,01 0,11 ± 0, ,20 0,02 0,26 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,22 ± 0, ,88 0 0,27 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,28 ± 0, ,80 0,11 0,21 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,45 ± 0, ,08 0,17 0,24 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,55 ± 0, ,08 0,13 0,23 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,81 ± 0,01 Símbolos: a : valor determinado no ponto de máxima produção de etanol. Yp/s: rendimento de etanol produzido a partir da xilose consumida. Yx/s: rendimento de células produzidas a partir da xilose consumida. Qp: produtividade volumétrica de etanol (12 12 horas). Discussão du Preez et al. (1986, p. 360) estudaram a fermentação de xilose a etanol em meio sintético, utilizando-se P. stipitis CSIR-Y633, em experimentos com ph controlado entre 4,0 e 5,5 e obtiveram rendimentos de etanol entre 0,42 e 0,45 g g -1. Observaram também que, para fermentações com ph controlado em 6,5, o rendimento de etanol diminuiu para 0,37 g g -1. Em estudos semelhantes, Roberto et al. (1994, p. 56) concluíram que o ph exerceu pouca influência sobre os parâmetros fermentativos quando utilizou-se Pichia stipitis CBS Os rendimentos de etanol foram de 0,34 g g -1 e 0,37 g g -1 para fermentações com ph controlado em 6,0 e ph 4,5, respectivamente, enquanto que a produtividade volumétrica foi de 0,9 g L -1 h -1 para todas as fermentações efetuadas em ph fixos na faixa de 4,0-6,0. Os rendimentos de etanol obtidos nesse trabalho foram muito próximos, independentemente da concentração inicial de substrato, variando de 0,21 a 0,27 g g -1 (tabela 1). Esses resultados foram inferiores aos encontrados na literatura (du Preez et al., 1986, p. 360; Roberto et al., 1994, p. 56) e podem ser justificados pelo fato de as fermentações terem sido efetuadas sem o controle de ph, que variou ao longo das fermentações de 5,5 a 4,0, devido à formação de ácidos durante o processo. Por outro lado, a produtividade volumétrica de etanol (Qp) foi diretamente proporcional à concentração inicial de substrato (tabela 1), atingindo um valor máximo de 0,81 g L -1 h -1, para a fermentação efetuada com 100 g L -1 de xilose, resultado próximo daquele reportado por Roberto et al. (1994, p. 56). O objetivo deste trabalho não foi obter altos rendimentos de etanol, mas estabelecer condições mínimas de fermentação para os ensaios preliminares voltados ao estudo da ação inibitória dos produtos de degradação dos carboidratos e 2214

8 da lignina presentes nos hidrolisados produzidos a partir de materiais lignocelulósicos. Conclusões As concentrações máximas de etanol foram obtidas com 36 h de processo fermentativo para todas as concentrações de xilose testadas. Os máximos rendimentos foram obtidos com 40 g L -1 e 50 g L -1 de xilose, Yp/s = 0,26 ± 0,01. A máxima produtividade volumétrica de etanol foi 0,81 g L -1 h -1, obtida com 100 g L -1 de xilose. Estes resultados já estão sendo utilizados no estudo da ação inibitória dos produtos de degradação dos carboidratos e da lignina presentes nos hidrolisados produzidos a partir de bagaço de cana. Agradecimentos Os autores agradecem à FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro (Processo 00/ ). Referências bibliográficas VON SIVERS, M.; ZACCHI, G. A techno-economical comparison of three processes for the production of ethanol from pine. Bioresource Technology, v. 51, p , HAHN-HÄGERDAL, B. Ethanolic fermentation of lignocellulose hydrolysates. A minireview. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 57/58, p , ALVO, P.; SAVOIE, P.; TREMBLAY, D.; ÉMOND, J.P.; TURCOTTE, G. A systems approach for the evaluation of ethanol production based on forages. Bioresource Technology, v. 56, p , VON SIVERS, M.; ZACCHI, G. Ethanol from lignocellulosics: a review of the economy. Bioresource Technology, v. 56, p , GRASSI, G. Modern bioenergy in the European Union. In: Sustainable agriculture for food, energy and industry. In: INTERNATIONAL CONFERENCE. Braunschweig, Alemanha, v.2, p OLSSON, L.; HAHN-HÄGERDAL, B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production. Enzyme and Microbial Technology, v. 18, p , NIGAM, J.N. Bioconversion of water-hyacinth (Euchhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to motor fuel ethanol by xylose-fermenting yeast. Journal of Biotechnology, v. 97, p , SASKA, M.; OSER, E. Aqueous extraction of sugarcane bagasse hemicelulose and production of xylose syrup. Biotechnology and Bioengineering, v. 45, p ,

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11 Abstract This study investigates the production of ethanol by the yeast Pichia stipitis CBS 5774, using xylose-containing synthetic medium at different concentrations under microaerobic conditions. The culture medium contained nutrients and salts and xylose concentrations of 20 g L -1, 40 g L -1, 50 g L -1, 60 g L -1, 80 g L -1 and 100 g L -1. The yeasts were growth in 125 ml Erlenmeyer flasks containing 50 ml of liquid medium with no previous ph adjustment. The flasks were agitated at 150 rpm on a shaker at 30 C with a cell concentration of 0.4 g L -1 during 108 h. Xylose and ethanol were determined by HPLC in a Aminex HPX-87H column (BioRad), using a refractive index detector. Dry cell weight was estimated using a calibration between weight and optical density (600 nm). The results showed that the initial ph decreased from 5.9 to 4.0. The maximum cell growth was obtained at 96 h and the maximum ethanol concentrations were obtained at 36 h, for all tested xylose concentrations. The maximum overall yields were obtained in liquid medium with 40 g L -1 and 50 g L -1 of xylose, Yp/s = 0.26 ± The maximum volumetric productivity was 0.81 g L -1 h -1 and was obtained with 100 g L -1 of xylose in liquid medium. Keywords: Xylose, fermentation, ethanol, Pichia stipitis. 2218