TRATAMENTO DE EFLUENTE CONTAMINADO COM ÓLEO DIESEL EMPREGANDO CULTURA MISTA

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1 TRATAMENTO DE EFLUENTE CONTAMINADO COM ÓLEO DIESEL EMPREGANDO CULTURA MISTA 1 Thamayne Valadares de Oliveira, 2 Carlos Alberto Vieira de Almeida, 3 Cynara Reis Aguiar, 4 Vicelma Luiz Cardoso 1 1 Discente do curso de Engenharia Química da UFU/MG 2 Bolsista PIBEG/UFU, discente do curso de Engenharia Química da UFU/MG 3 Professora do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará Campus Limoeiro do Norte. 4 Professora da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 1,2,4 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP vicelma@ufu.br RESUMO - A contaminação provocada por combustíveis derivados de petróleo tem causado grandes prejuízos ao meio ambiente. Muitas pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de remediar e prevenir tais danos utilizando diversas técnicas. O uso de microrganismos com o intuito de degradar poluentes ambientais ou prevenir a poluição através do tratamento de rejeitos é uma alternativa tecnológica bastante promissora. Neste trabalho optou-se por estudar a biodegradação de um efluente contendo óleo diesel, por via anaeróbia, utilizando uma cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato. Inicialmente foi realizada a adaptação da cultura mista enriquecida com Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) ao efluente contaminado com óleo diesel e a seguir foi realizado um planejamento composto central para estudar a influência das concentrações de óleo diesel, NH 4 Cl e biosurfactante na remoção de Hidrocarboneto Total de Petróleo (TPH). Com a otimização do processo empregando a técnica de superfície de resposta obteve-se um ponto de máximo nas seguintes condições experimentais: 1,15% de óleo diesel, 0,06% de biosurfactante e 2,92 g/l de cloreto de amônio. Palavras-chave: bactérias redutoras de sulfato, óleo Diesel, biodegradação. INTRODUÇÃO A contaminação por hidrocarbonetos monoaromáticos, tais como benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (orto-, meta-, para-) denominados de BTEX, que são os constituintes mais solúveis e mais móveis da fração do óleo diesel e da gasolina é uma grande preocupação. O benzeno, por ser comprovadamente carcinogênico, é considerado o mais tóxico dentre os BTEX. Em contato com a água os compostos BTEX se dissolvem parcialmente, sendo os primeiros contaminantes a atingir o lençol freático (Silva et al., 2002; Vieira, 2004). O uso de microrganismos com o intuito de degradar poluentes ambientais ou prevenir a poluição através do tratamento de rejeitos é uma alternativa tecnológica bastante promissora e vem sendo desenvolvida por inúmeros pesquisadores (Atlas, 1995). Várias técnicas de tratamento biológico utilizam microbiota aeróbia que, em geral, é extremamente sensível à presença de compostos químicos tóxicos e à salinidade elevada. As bactérias redutoras de sulfato (BRS) são microrganismos anaeróbios estritos que utilizam o íon sulfato (SO 4 2- ) como aceptor final de elétrons durante a digestão anaeróbia, produzindo H 2 S (Postgate, 1984). As BRS são facilmente adaptáveis a ambientes contaminados com hidrocarbonetos de petróleo sendo capazes de degradá-los (Kleikemper et al., 2002). Muitos pesquisadores têm mostrado a eficácia de microrganismos anaeróbios em degradar BTEX e hidrocarbonetos poli-aromáticos (PAH) (Boopathy, 2004; Karthikeyan e Bhandarti, 2001). O consumo de n-alcanos como o único substrato orgânico foi demonstrado em experimentos quantitativos, utilizando uma nova cultura de um tipo mesofílico de bactérias redutoras de sulfato sob estrita ausência de ar (Widdel et al., 1999). Neste trabalho objetivou-se adaptar uma cultura mista de bactérias anaeróbias enriquecida com bactérias redutoras de sulfato em concentração crescente de óleo diesel; avaliar a capacidade da cultura em biodegradar um efluente sintético contendo óleo diesel e otimizar as condições operacionais empregando a técnica de superfície de resposta para a remoção de hidrocarbonetos total de petróleo (TPH). MATERIAIS E MÉTODOS

2 Óleo Diesel e Biosurfactante O óleo diesel empregado neste trabalho foi obtido de um único posto de abastecimento de combustível (BR Distribuidora de Combustível) da cidade de Uberlândia - MG, sendo armazenada uma única amostra em dois galões de 5 litros, sob refrigeração a 4 ± 1 o C. O biosurfactante utilizado foi cedido pelo Centro de Tecnologia Mineral (CETEM), tendo sido fornecido pela Janeil Biosurfactante Company Sample JBR-425, constituído de 25% raminolipídeo purificado. Adaptação da Cultura Foi utilizada uma cultura mista de bactérias anaeróbias provenientes da água de produção de Carmópolis - RJ, enriquecida com BRS através de cultivos sucessivos. A cultura foi adaptada e mantida em meio Postgate E modificado (Postgate, 1984), composto pelas substâncias mencionadas a seguir em g/l: H 2 PO 4 0,5; NH 4 Cl 1,0; CaCl 2.2H 2 O 0,67, MgCl 2.7H 2 O 1,83; Na 2 SO 4 1,0; FeSO 4.7H 2 O 0,5; Agar 1,9; extrato de levedura 1,0; ácido ascórbico 0,1; solução de lactato de sódio (50%) 7,0 ml e solução de resarzurina (0,025%) 4 ml/l. O ph do meio foi ajustado para 7,8 ± 0,1. Após o preparo do meio, sob fluxo de nitrogênio, foram distribuídos volumes de 40 ml em frascos de penicilina de 50 ml de capacidade, vedados com tampas de borracha e lacres metálicos a fim de garantir a condição de anaerobiose. Em seguida, os meios foram autoclavados a 1 atm por 20 minutos. 17 experimentos realizados, adotando o tempo de biodegradação de 30 dias. Tabela 1 - Valores reais das variáveis do processo. Níveis Var Descriminação - α α X 1 Óleo Diesel (%) 0,15 0,5 1,5 2,5 2,85 X 2 NH 4 Cl (g/l) 0,30 1,0 3,0 5,0 5,7 X 3 Biosurfactante(%) 0 0,007 0,027 0,047 0,054 Tabela 2 - Matriz de Planejamento. N o. Exp. Óleo Diesel (%) NH 4 Cl (g/l) Biosurfactante (%) 1 0,5 1,0 0, ,5 1,0 0, ,5 5,0 0, ,5 5,0 0, ,5 1,0 0, ,5 1,0 0, ,5 5,0 0, ,5 5,0 0, ,15 3,0 0, ,85 3,0 0, ,5 0,3 0, ,5 5,7 0, ,5 3,0 0, ,5 3,0 0, ,5 3,0 0, ,5 3,0 0, ,5 3,0 0,027 Planejamento Experimental Depois da cultura aclimatada aplicou-se o planejamento experimental. Foi escolhido o Planejamento Composto Central (PCC) devido ao número de variáveis e a necessidade de obter uma estimativa de parâmetros de uma superfície de segunda ordem. Foram estudadas três variáveis em dois níveis acrescidos de três réplicas centrais mais seis experimentos no ponto axial totalizando 17 experimentos. O alfa de ortogonalidade foi de 1,353. Na Tabela 1 estão apresentadas as variáveis e seus respectivos níveis codificados. Os experimentos foram realizados em frascos de penicilina de 50 ml contendo 40 ml de meio Postgate E (Postgate, 1984) modificado, sem lactato de sódio e Agar-agar. Cada frasco foi inoculado 4 ml de cultura aclimatada e as concentrações das variáveis correspondentes ao número do experimento. Os frascos foram dispostos numa mesa sob agitação de 150 rpm, a 30 o C ± 2 o C por 30 dias. A Tabela 2 apresenta a matriz do planejamento com as condições operacionais dos Análise de Hidrocarboneto Total de Petróleo (TPH) Após o tempo de incubação, o conteúdo dos frascos foi acidificado com HCl 1N até ph próximo de 2. Foram retiradas alíquotas de 10 ml para a análise de Hidrocarboneto Total de Petróleo (TPH) no espectrofotômetro de infravermelho Horiba OCMA-350, empregando o solvente S-316. Esta análise é adequada para medir hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, independente da sua faixa de carbono. A luz emitida na faixa do infravermelho é usada para irradiar o extrato e medir a concentração de TPH. Durante a análise, absorbâncias associadas com as configurações CH, CH 2 e CH 3 são medidas em um comprimento de onda próximo de 3,4 µm. RESULTADOS E DISCUSSÕES A adaptação consistia em inocular os frascos de penicilina contendo meio Postgate E modificado, com 4 ml de cultura e concentrações crescentes de óleo diesel, variando de 0,25% (v/v)

3 a 5% (v/v). Os frascos foram incubados em estufa a 30 ± 2 o C. A Tabela 3 apresenta o crescimento da cultura microbiana no meio Postgate E modificado (Postgate, 1984) contendo diferentes concentrações iniciais de óleo diesel. O crescimento foi observado pelo escurecimento do meio pela formação de precipitado negro de FeS, após uma semana de incubação em estufa a 30 ± 1 o C. O critério de aumento da concentração de óleo diesel empregado foi relacionado com o crescimento da cultura; caso fosse positivo repicava-se a cultura previamente aclimatada em meio contendo maior concentração do combustível. Tabela 3 - Ensaio para aclimatação da cultura microbiana a diferentes concentrações de óleo Diesel. Concentração de Óleo Diesel Crescimento (% v/v de contaminante) 0,25% ,5% ,0% ,0% ,0% ,0% ,0% crescimento positivo observado pela formação de precipitado negro de FeS. Experimento realizado em triplicata. Terminada a fase de adaptação da cultura ao óleo diesel, esta foi cultivada em condição de supressão da fonte de carbono mais facilmente assimilável (lactato de sódio), constituinte do meio Postgate E modificado. Observou-se que a cultura não só suportou a total deleção do lactato, mas sobretudo, foi capaz de crescer às custas do óleo diesel, como principal fonte de carbono e energia, conforme mostra a Tabela 4. Tabela 4 - Ensaio para aclimatação da cultura microbiana ao crescimento na ausência de lactato de sódio. Concentração de Lactato de Sódio (50%) Concentração de Óleo Diesel (v/v) Crescimento 50% 5% % 5% crescimento positivo - observado pela formação de precipitado negro de FeS. Experimento realizado em triplicata. Foi observado, durante todo o período de aclimatação, que houve crescimento em todas as fases, sem efeito inibitório relacionado ao aumento da concentração do óleo diesel e à ausência de lactato de sódio. Os resultados experimentais de remoção de TPH em função da concentração de óleo diesel, NH 4 Cl e biosurfactante definidos no PCC, propiciaram a construção da superfície de resposta apresentada na Figura 1. Com a realização da regressão múltipla dos mesmos no software Statistica 7, obteve-se a Equação 1 com as variáveis significativas codificadas (X 1 - concentração de óleo diesel, X 2 - concentração de NH 4 Cl e X 3 - concentração de biossurfactante) para a remoção de TPH. Foram considerados significativos os parâmetros com nível de significância (p) do teste t de Student menores a 10%. O coeficiente de correlação (R 2 ) de 0,94, indica um ajuste adequado dos dados experimentais na resposta remoção, frente à equação empírica proposta, ou seja, 94% da variabilidade dos dados foram explicados pela Equação 1. Cabe ressalta que para todos os experimentos foram realizados testes de controle (sem adição de microrganismos), no qual a remoção de TPH máxima obtida foi de 2%. Os valores correspondentes a remoção de TPH foram calculados considerando as perdas abióticas. Remoção de TPH = 73,89 5,18X 1 + 4,33X 3 6,01X ,40X 2 (1) Constata-se através da Equação 1 que as concentrações de óleo diesel e de biosurfactante foram as variáveis que mais influenciaram na resposta. Observa-se que a combinação de baixas concentrações de óleo diesel e altas concentrações de biosurfactante resulta numa maior remoção de TPH. Foi realizada uma análise canônica utilizando a técnica de superfície de resposta. Para tanto foi feita uma translação de eixos da origem para o ponto estacionário e posteriormente, a transformação das variáveis para a forma canônica. Este procedimento foi realizado utilizando um algoritmo feito no software Maple VI release 4. A partir da obtenção das raízes características (todas foram negativas) da matriz planejamento, constatou-se que o ponto estacionário para a remoção de TPH era um ponto de máximo. Sendo assim os valores da resposta maximizada de X 1, X 2 e X 3 na forma codificada são, respectivamente, -0,35, -0,04 e 1,353. Utilizando as equações de codificação obtêm-se os valores das concentrações das variáveis: X 1 = 1,15% de óleo diesel; X 2 = 2,92 g/l de NH 4 Cl e X 3 = 0,06 % de biosurfactante. Nestas condições a remoção de TPH obtida experimentalmente foi de 80,5 %. Como forma de ilustrar os efeitos das variáveis na biodegradação do óleo diesel pelas bactérias redutoras de sulfato com relação à remoção de TPH são apresentadas nas Figuras 1, 2 e 3 as superfícies de resposta relacionando as variáveis duas a duas com a remoção de TPH.

4 Analisando as superfícies de resposta das Figuras 1, 2 e 3, observa-se o comportamento da remoção de TPH com relação às variáveis do processo. A Figura 1 mostra que para valores de concentração de óleo diesel abaixo do ponto central, assim como para valores de concentração de NH 4 Cl próximo ao ponto central, a remoção de TPH aumenta. A Figura 2 apresenta as variáveis que mais influenciaram na remoção, nota-se que para valores na concentração de óleo diesel abaixo do ponto central e para maiores quantidades de biosurfactante a remoção de TPH aumenta. Já na Figura 3, para concentrações de NH 4 Cl próximo do ponto central e para maiores concentrações de biosurfactante a remoção de TPH é maior Figura 3 - Superfície de resposta para remoção de NH 4 Cl e de biosurfactante na forma codificada. Os resultados do PCC mostraram que a cultura mista enriquecida com BRS propiciou remoção de TPH de até 79,1% e no ponto otimizado a remoção foi de 80,5%. Estudos em solos mostraram que em condição de redução de sulfato, bactérias anaeróbias degradaram o TPH com percentual de remoção de 61% (Boopathy, 2004). CONCLUSÕES Figura 1 - Superfície de resposta para remoção de óleo diesel e de NH 4 Cl na forma codificada Neste trabalho, pode-se comprovar que o processo de adaptação da cultura mista enriquecida com BRS foi satisfatório. Como conseqüência da otimização utilizando a técnica de superfície de resposta, no processo de biodegradação do efluente contendo óleo diesel, conduziu as seguintes condições das variáveis operacionais: concentrações de óleo diesel de 1,15%, concentração de biosurfactante de 0,06% e concentração de NH 4 Cl de 2,92 g/l. Nestas condições a remoção de TPH foi de 80,5%. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Figura 2 - Superfície de resposta para remoção de óleo diesel e concentração de biosurfactante na forma codificada. ATLAS, R.M., Petroleum biodegradation and oil spill bioremediation, Marine pollution bulletin, 31 (4-12), BOOPATHY, R., Anaerobic biodegradation of no. 2 diesel fuel in soil: a soil column study, Bioresource technology, 94, KARTHIKEYAN, R., BHANDARI, A., Anaerobic biotransformation of aromatic and polycyclic aromatic hydrocarbons in soil microcosms: A review, Journal of hazardous substance research, 3, KLEIKEMPER, J., SCHROTH, M.H., SIGLER, W.V., SCHMUCKI, M., BERNASCONI, S.M., ZEYER, J., Activity and diversity of sulphate-reducing bacteria in a petroleum hydrocarbon-contaminated aquifer, Applied and environmental microbiology, 6 (4),

5 POSTGATE, J.R., The sulphate-reducing bacteria, Cambridge University Press, Cambridge, London. 2 nd edition. SILVA, R.L.B., BARRA, C.M., MONTEIRO, T.C.N., BRILHANTE, O.M., Estudo da contaminação de poços rasos por combustíveis orgânicos e possíveis conseqüências para a saúde pública no Município de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, Cad. Saúde Pública, 18 (6), VIEIRA, P.A., Avaliação da biodegradação de efluente contendo óleo diesel e gasolina empregando culturas mistas, PPGEQ/ Faculdade de Engenharia Química da UFU, Uberlândia - MG. (Dissertação de Mestrado). WIDDEL, F., FUKUIL, M., HARMS, G., RABUS, R., SCHRAMM, A., ZENGLER, K., BOREHAM, C., WILKES, H., Anaerobic degradation of oil hydrocarbons by sulphate-reducing and nitrate-reducing bacteria. Microbial biosystems: New frontiers, Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology, Atlantic Canada society for microbial ecology, Halifax, Canadá.