HISTÓRIA DA NEMATOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA DPV49-NEMATOLOGIA PROFESSORA MARIA AMELIA DOS SANTOS SEGUNDO SEMESTRE LETIVO DE 2002 Registros mais antigos: HISTÓRIA DA NEMATOLOGIA 1553 a.c., no antigo Egito, "Papyrus ebers" faz menção a Ascaris lumbricoides (vermes intestinais - lombriga) e Dracunculus medinensis (parasito do homem, vive nos braços e pernas, causando intensa dor e inflamação, conhecido como serpente de fogo) 1250 a.c., na Bíblia Sagrada, faz menção a Dracunculus medinensis. 350 a.c., na antiga Grécia, Aristóteles escreveu sobre nematóides parasitos de animais. Fatos históricos: BORELLUS (1656) descobriu vermes no vinagre, Turbatrix aceti (nematóide de vida livre). TYSON (1683) estudou a anatomia de nematóide e descreveu um ovo de nematóide. NEEDHAM (1743) descobriu um nematóide parasitando as raízes de trigo, Anguina tritici. Este foi o primeiro relato de um nematóide causando doença em planta. LINNAEUS (1767), SCOPOLI (1777) e STEINBUCH (1799) também registraram Anguina tritici e notaram que também atacava outros cereais, além do trigo. LEIDY (1851) realizou o primeiro registro de nematóides de vida livre. BERKELEY (1855) trabalhando na Inglaterra, constatou galhas em raízes de pepino, causadas por nematóide. KUHN (1857) descreveu o nematóide Ditylenchus dipsaci atacando bulbos de cardo (Dipsacus fullonum). Na época denominou-o de Anguillula dipsaci. SCHACHT (1858) foi o primeiro a observar nematóides formadores de cistos em beterrabaaçucareira e, mais tarde, SCHMIDT (1871) observou e descreveu a espécie Heterodera schachtii em beterraba. Esta doença estimulou os cientistas europeus a estudar práticas de controle, incluindo o uso de químicos como o bissulfito de carbono (CS 2 ), que foi o primeiro nematicida (fumigação do solo) eficiente relatado por KUHN (1871). BASTIAN (1866) - Inglaterra - escreveu "Monograph of the Anguillulidae" que marcou o início da ciência da Nematologia, apresentando possibilidades de coleta intensiva no solo e nos tecidos vegetais bem como em água doce e salina. BUTSCHLII (1873) descreveu detalhadamente a morfologia de nematóides de vida livre e indicou muitas das características que são usadas atualmente na diferenciação de gêneros e espécies. De MAN (1876) - Holanda - financeiramente independente realizou monografia taxonômica. JOBERT (1878) descreveu o nematóide do cafeeiro na província do Rio de Janeiro. DE MAN (1880) descreveu o nematóide Pratylenchus pratensis. GOELDI (1887) publicou a descrição da espécie Meloidogyne exigua atacando raízes de cafeeiro na província do Rio de Janeiro. STRUBELL (1888) e SCHMIDT (1871) publicaram descrições detalhadas (estudo morfológico) e história da vida de Heterodera schachtii. MAY (1888) - Meloidogyne spp - primeiro fitonematóide descrito

2 SCRIBNER (1889) descreveu uma doença nos tubérculos de batata por nematóide, espécie hoje conhecida como Pratylenchus brachyurus. RITZEMA-BOS (1891) relatou o nematóide foliar Aphelenchoides fragariae em morangueiro. ATKISON (1892) observou que em cultivo de algodoeiro com a presença de nematóides causadores de galhas, apresentava aumento de incidência e severidade da murcha causada pelo fungo Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum. COBB (1893) encontrou nematóide parasitando raízes de bananeira, denominando-o como Tylenchus similis. ZIMMERMANN (1898) encontrou em Java, Tylenchus similis atacando cafeeiro. COBB (1907) - propôs que fitonematóides e nematóides vida-livre fossem removidos da Helmintologia (parasitos do homem e animais) e colocados em um novo ramo da ciência a ser conhecido como Nematologia. HELMINTHOLOGICAL SOCIETY OF WASHINGTON - fundada em RAHM (1928 e 1929) - Pratylenchus coffeae no Brasil. FUCHS ( ) trabalhou com nematóides associados com insetos. COBB (1918) - escreveu um manual de laboratório "Estimating the nema population of soil" que formou a base para a maioria dos métodos e equipamentos utilizados na Nematologia atualmente, para separar nematóides do solo e prepará-lo para estudo microscópico. A habilidade microscópica de COBB associada à habilidade artística de CHAMBERS estabeleceram uma nova era na Nematologia, fundamentando a nossa atual ciência em todo o mundo. COBB trabalhou de 1890 a Em 1932, STEINER continuou o trabalho de COBB com quem antes trabalhava junto. COBB morreu aos 73 anos de idade. As investigações de Cobb valeram-lhe o título de Pai da Nematologia nos Estados Unidos". GOODEY (1933) - Inglaterra: livro Plant Parasitic Nematodes in the diseases they cause. FILIPJEV (1934) - Rússia: livro Nematodes that are of importance for agriculture. CARVALHO (1942) acusou Tylenchulus semipenetrans em citros cultivados em municípios paulistas e em material proveniente do Rio de Janeiro. CHITWOOD (1949) - separou o gênero Meloidogyne de Heterodera e desde então, o gênero mais estudado é Meloidogyne por conter as espécies mais importantes. GOFFART (1951) - Europa: resumo de estudos de fitonematóides. GOODEY (1951) - 2 o livro: Soil and fresh water nematodes. GOODEY (1951) - FAO - Inglaterra: Promoção de curso e simpósio de nematologia internacional. STEINER (1951) - Beltsville, USA: chega ao Brasil em 02 de janeiro de 1951 à convite do IAC passou a ensinar nematologia aos técnicos brasileiros. Um esforço do Dr. Olavo José Boock pois não encontrou nematologistas no Brasil para ajudá-lo a resolver o problema dos danos provocados pelos nematóides em seus campos de batata do programa de melhoramento na década de 40. Entre os que receberam orientação do Dr. Steiner, no Primeiro Curso de Nematologia de Plantas no Brasil, no IAC, estavam o Dr. Jair Corrêa de Carvalho, do Instituto Biológico de São Paulo (IB), já falecido, e o Dr. Luiz Gonzaga E. Lordello, do Departamento de Zoologia da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", da Universidade de São Paulo. SOCIETY OF EUROPEAN NEMATOLOGISTS - fundada em Responsável pela edição do periódico Nematologica. LORDELLO ( ) - estudos nematológicos nos Estados Unidos após ter estudado com o Dr. Steiner em sua visita ao Brasil. MOUNTAIN (1955) - desenvolveu um método de cultivo de nematóides sob condições estéreis e provou que Pratylenchus minyus induzia lesão e morte de raízes de fumo, quando fungo e bactéria estavam ausentes no solo. HEWITT, RASK e GOHEEN (1958) - demonstraram que os nematóides podem ser vetores de fitoviroses.

3 CHRISTIE (1959) - escreveu o livro "Plant Nematodes, their bionomics and control". CARVALHO (1959) - identificou o nematóide Radopholus similis em bananeiras no estado de São Paulo. SOCIETY OF NEMATOLOGISTS - uma ramificação da American Phytopathological Society, foi fundada em Responsável pela publicação do periódico Journal of Nematology. LORDELLO (início dos anos sessentas) - começou a ministrar a disciplina Nematologia de escolha optativa do Curso de Engenharia Agrônomica da ESALQ/USP. LORDELLO (1964) - implantação dos cursos de pós-graduação na ESALQ/USP e iniciou a disciplina Nematologia de Plantas, cursada principalmente pelos estudantes de mestrado e doutorado em Fitopatologia e em Entomologia. FRANCO (1964) - Brasil - publicou sua monografia "Estudo sobre o Anel Vermelho do Coqueiro". ORGANIZATION OF TROPICAL AMERICAN NEMATOLOGISTS (OTAN) - fundada em Responsável pela publicação do periódico Nematropica. LORDELLO (1968) - publicou o primeiro livro de nematologia em língua latina "Nematóides das Plantas Cultivadas". HARRISON et. a l. (1971) - denominaram de nepovirus, as partículas de vírus veiculadas por espécies de Xiphinema. MARTINELLI (1974) - relata que há 15 nepovirus, afetando videira, morangueiro, tomateiro, fumo e alcachofra. LEHMAN (1974) - USA: sugere ao Dr. Lordello promover a primeira reunião com os nematologistas brasileiros em Piracicaba, São Paulo, no Departamento de Zoologia da ESALQ/USP (6 e 7 de fevereiro de 1974) e foram apresentados 12 trabalhos sobre problemas brasileiros. Essa reunião contou com a presença do Dr. Kenneth R. Barker, da Universidade da Carolina do Norte, EUA, que proferiu três palestras. Na tarde de 7 de fevereiro de 1974, é fundada a Sociedade Brasileira de Nematologia, aprovando os estatutos e elegendo a primeira Diretoria, assim constituída: presidente Dr. Luiz Gonzaga E. Lordello; vice-presidente Dr. Mário Vieira de Moraes; conselheiros Dr. Olavo José Boock, Dr. Silamar Ferraz, Dr. Luiz Carlos Fazuoli, Dr. Wilson R. T. Novaretti e Dr. Sérgio M. Curi; secretário-tesoureiro Dr. Ailton Rocha Monteiro. Com o surgimento da Sociedade, nasceu a "Publicação da SBN", que a partir de 1984 (volume 8) se converteu na "Nematologia Brasileira". LORDELLO et al. (1975) - encontraram Heterodera fici, parasitando figueira em Valinhos, São Paulo. Esta foi a primeira espécie do gênero a ser identificada no país. PONTE (1978) - publicou o livro "Nematóides das galhas - espécies ocorrentes no Brasil e seus hospedeiros". SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEMATOLOGIA (1981) - V Reunião Brasileira de Nematologia no Instituto Agronômico do Paraná, Londrina, PR - foi outorgado o título de Pai da Nematologia no Brasil à Luiz Gonzaga E. Lordello. TENENTE et. al. (1981) - publicaram "Bibliografia Brasileira de Nematóides". XVI CONGRESSO BRASILEIRO DE NEMATOLOGIA (1992) - 24 a 28 de fevereiro de 1992, na UFLA (antiga ESAL) em Lavras, MG - foi registrada pela primeira vez a ocorrência de Heterodera glycines atacando soja no Brasil. TIHOHOD (1993) - publicou o livro "Nematologia Agrícola Aplicada". COSTA MANSO e outros (1994) - publicaram "Catálogo de nematóides fitoparasitos encontrados associados a diferentes tipos de plantas no Brasil. Sociedade Brasileira de Nematologia publica "O Nematóide de Cisto da Soja: a experiência brasileira. Jaboticabal: SBN, p" que reúne os esforços dos pesquisadores brasileiros concretizando o manejo de áreas contaminadas por Heterodera glycines. Morre em fevereiro de 2002 Luiz Gonzaga E. Lordello, o Pai da Nematologia Brasileira

4 TAXONOMIA E SISTEMÁTICA DE NEMATÓIDES A taxonomia é uma ciência básica que trata do conhecimento do taxa (do grego taxis = ordem, arranjo) e a sistemática é o método de classificação ou ordenamento do taxa num sistema hierárquico, através de grupos definidos e determinando sua posição. Devido à sobreposição dos objetivos cobertos pelos dois termos, eles, usualmente, representam a mesma coisa. Os nematóides pertencem ao Reino Animalia dentro do Filo Nemata (= Nematoda). O Filo Nemata apresenta duas classes: Adenophorea e Secernentea. Dentro de cada classe temos: subclasse, ordem, subordem, superfamília, família, subfamília, tribo, gênero, espécie, subespécie. Existem em torno de espécies descritas no Filo Nemata: 50% são nematóides marinhos; 25% são nematóides de vida livre (solo e água doce); 15% são parasitos de animais vertebrados e invertebrados; 10% são parasitos de plantas. A morfologia é a base da taxonomia e da sistemática dos fitonematóides. Para tanto, o espécime (é o organismo nematóide em estudo) deve ter sido bem preparado para que as lâminas contendo os espécimes possam ser visualizadas no microscópio e forneçam as informações morfométricas e morfológicas necessárias. A fêmea do nematóide é a fase de maior importância taxonômica, seguida do macho e por último dos juvenis. O exame direto do material fresco em lâminas temporárias (montagens em água) nem sempre é possível pois o estudo de identificação requer longos períodos de observação, o que limita o sucesso desta técnica que exige uma observação mais rápida. Portanto, lâminas permanentes devem ser preparadas para estudos taxonômicos. Existem vários métodos de preparo dessas lâminas e a escolha de um deles deve considerar os aspectos favoráveis e desfavoráveis de cada método. A montagem de uma lâmina permanente apresenta quatro fases distintas: morte do nematóide, fixação do nematóide, infiltração em glicerina (troca de água do corpo do nematóide pela glicerina) e preparo da lâmina (incluindo lutagem e etiquetagem). MORFOLOGIA E ANATOMIA DOS FITONEMATÓIDES O comprimento do corpo de nematóides parasitos de plantas está em torno de 250 µm a 12 mm, sendo que a maioria está na faixa de 500 a 1000 µm. Parede do corpo: é constituída por cutícula, hipoderme e células musculares. A cutícula é a camada externa e é secretada pela hipoderme. Ela é transparente o que permite a visualização dos sistemas internos, principalmente digestivo e reprodutor. Apresenta permeabilidade à água e a certos íons. Formada por três camadas: córtex, matriz e camada basal. Além de recobrir todo o corpo, a cutícula penetra (invagina) pelas aberturas naturais, revestindo a cavidade bucal, esôfago, reto, vagina, vulva, etc. O crescimento dos nematóides está associado com as ecdises ou troca de cutícula, as quais normalmente ocorrem quatro vezes antes de alcançar a fase adulta. A hipoderme é uma densa camada de tecido abaixo da cutícula, podendo ser de dois tipos: formada de células distintas (natureza celular) ou na forma de sincito (massa de protoplasma com alguns núcleos espalhados). Na hipoderme, encontramos quatro engrossamentos longitudinais chmados de cordas ou linhas. As cordas laterais (2) contêm os canais coletores e algumas das ramificações nervosas principais. A musculatura está localizada internamente à hipoderme. Pode ser de dois tipos: somática e especializada.

5 PSEUDOCELOMA: é a cavidade geral do corpo dos nematóides. Diferencia-se do verdadeiro (celoma) por não ser revestido por um mesentério. Esse buraco é preenchido de um fluído, de constituição química complexa e tecido fibroso, no qual observam-se grandes células chamadas pseudocelomócitos, membranas e tecido fibroso. O fluído é chamado de FLUÍDO PSEUDOCELÔMICO, ficando nessa cavidade sob pressão e mantendo o corpo do nematóide firme, rígido. Dessa maneira, refere-se ao fluído a função de formar o ESQUELETO HIDROSTÁTICO. Internamente ao pseudoceloma estariam os órgãos do nematóide imersos no fluído. SISTEMA DIGESTIVO: é essencialmente um tubo que se estende da abertura oral ao ânus (fêmea e juvenis) ou cloaca (macho). a) boca ou abertura oral b) cavidade bucal (estilete) c) esôfago ou faringe d) válvula esôfago-intestinal (cárdia) e) intestino ou mesêntero f) reto ou proctodeo g) ânus (fêmea ou juvenis) e cloaca (macho) a) Boca ou abertura oral: localiza-se na extremidade anterior do corpo do nematóide, sendo rodeada por lábios, frequentemente em número de 6, sendo 2 subdorsais, 2 laterais e 2 subventrais. Há gêneros em que os lábios foram reduzidos a 3, por fusão 2 a 2. Em outros, o número de lábios tornou-se 2. Por fusão completa dos lábios, a região labial apresenta-se individa que é a situação dos fitonematóides. b) Estilete: é uma transformação da cavidade bucal. O estilete pode ser de dois tipos: estomatostílio e odontostílio. O primeiro tipo é o mais comum entre os fitonematóides, ocorrendo naqueles com esôfagos tilencóide e afelencóide. O estomatostílio é formado por um cone anterior, haste cilíndrica mediana e dilatações arredondadas ou bulbos (normalmente uma dorsal e duas subventrais). O estilete apresenta um canal interno por onde passam os líquidos e o seu diâmetro é de 1 micrômetro (atua como filtro de bactérias). Esse canal tem continuidade no esôfago. O estilete do tipo odontostílio resulta da transformação de apenas um dente, também sendo uma estrutura canaliculada. Esse estilete é típico da Ordem Dorilaimida. c) Esôfago: órgão musculoso e glandular. A luz ou lúmen do esôfago é trirradiada. Pode ocorrer nos fitonematóides, dois tipos de esôfago: de 3 ou de 2 partes. O esôfago de três partes é o mais comum entre os fitonematóides. O esôfago de 3 partes é dividido em: primeira parte (corpo); segunda parte (istmo) e a terceira parte (bulbo basal ou terminal). O corpo é subdividido em pró-corpo e bulbo mediano (ou metacorpo).o bulbo mediano é uma estrutura esferoidal, muscular e que funciona à semelhança de uma bomba de sucção e compressão. Por meio de uma pulsação muito rápida, permite a injeção na planta de substâncias produzidas pelo nematóide e a retirada dos alimentos para o seu sustento. O istmo é a porção do esôfago de menor diâmetro e é circundado pelo anel nervoso e gânglios nervosos. O bulbo basal apresenta três glândulas: uma dorsal e duas subventrais. Na taxonomia, é importante saber o local onde essas glândulas se abrem. Com relação a essa saída, temos os seguintes esôfagos: tipo tilencóide (o conduto ou canal da glândula dorsal esofagiana abre-se próximo ao estilete) e tipo afelencóide (a saída ocorre no bulbo mediano e este apresenta-se bem dilatado). O esôfago de 2 partes é dividido em: uma parte anterior (de menor diâmetro) e outra basal (mais dilatada e contém as glândulas esofagianas). Nesse tipo de esôfago, a abertura do canal da glândula dorsal se dá na parte basal do esôfago.

6 d) Válvula esôfago-intestinal: na conexão do esôfago e do intestino, existe um aparelho valvular, a válvula esôfago-intestinal, que impede a volta dos alimentos (evita o regurgitamento). Quando essa válvula se projeta para o interior da luz do intestino, como um corpo cônico, recebe o nome de cárdia. e) Intestino: é um tubo cuja parede é formada de uma única camada de células epiteliais, contendo no lado interno microvilosidades para aumentar a superfície de absorção e secreção de alimentos. f) Reto: parte posterior do intestino a partir de uma constrição existente nessa região, e vai até abrir no ânus ou na cloaca. g) Ânus e cloaca: abertura final do intestino (ânus). No caso do macho, as saídas dos sistemas digestivo e reprodutor se fundem e tornam-se única, recebendo o nome de cloaca. SISTEMAS RESPIRATÓRIO E CIRCULATÓRIO: não existem em nematóides. A troca de gases é feita por difusão diretamente através da cutícula. O oxigênio é essencial para o nematóide, a falta dele pode levar à dormência e dependendo do nível de falta pode levar à morte. Parte das funções de um sistema circulatório é executada, nos nematóides, pelo fluído pseudocelômico. SISTEMA EXCRETOR: há dois tipos básicos: glandular e tubular. O sistema excretor tubular é o mais comum em fitonematóides, consistindo de dois longos tubos, cegos nas extremidades, embutidos nas cordas hipodermais laterais, anteriormente interligados por meio de um tubo transversal, do qual parte um conduto excretor mediano que se vai abrir no poro excretor, geralmente localizado na região do istmo do esôfago. SISTEMA NERVOSO: o sistema nervoso central dos nematóides consiste de: uma região central, o anel nervoso (anel de fibras nervosas), que fica ao redor do istmo quando este existe. Do anel nervoso partem nervos longitudinais para as extremidades anterior e posterior do corpo do nematóide. Vários órgãos sensoriais estão ligados ao sistema nervoso dos nematóides destacandose: papilas labiais, anfídeos, fasmídeos, deirídeos, papilas caudais, hemizonídeos, cefalídeos, hemizôneos. SISTEMA REPRODUTOR: os nematóides normalmente apresentam os sexos separados. Tanto os órgãos reprodutores da fêmea como do macho são sempre tubulares. Sistema reprodutor feminino: é formado de um ou dois tubos de origem mesodérmica, com ovário, oviduto e útero, e de uma vagina, de origem ectodérmica que se abre para o exterior por uma vulva em forma de fenda na linha mediana ventral. Entre o oviduto e o útero pode existir uma espermateca (local onde os espermatozóides são armazenados e os oócitos são fertilizados quando passam antes de ir para o útero, isso ocorre na reprodução do tipo anfimixia). O ovário é um tubo cego, de uma só camada de células epiteliais baixas, em cujo interior se dá a ovogênese. Apresenta uma zona germinativa (ou de multiplicação), de rápida divisão celular, e uma zona de crescimento das células reprodutoras femininas (oócitos). A classificação das fêmeas quanto ao número de ovários e posição do ovário em relação à vulva: monodelfa é aquela que apresenta um ovário podendo ser também prodelfa quando o ovário se estende anteriormente à vulva ou opistodelfa quando o ovário se estende posteriormente à vulva; e didelfa é aquela fêmea que apresenta dois ovários e nesse caso a posição deles em relação à vulva é uma disposição oposta, ou seja, um ovário anterior e outro posterior à vulva, recebendo o nome de anfidelfa. O oviduto é um tubo estreito de epitélio colunar que une o ovário ao útero. O útero é uma complexa região do trato reprodutor e nele ocorre a formação da camada protéica uterina da casca do ovo. Os ovos dos fitonematóides permanecem no útero até serem lançados para o exterior do corpo (ovíparos). Os ovos são geralmente de tamanho semelhante nos diferentes nematóides, independemente das dimensões dos adultos, medindo de 50 a 100 micrômetros de comprimento por 20 a 50 micrômetros de largura. No entanto, entre os fitonematóides, há uma considerável variação: podem ser ovais,

7 subglobulares, elípticos ou forma de rim e, em geral, a superfície do ovo é lisa. Do útero, uma vagina curta e muscular leva à vulva. Sistema reprodutor masculino: consiste de testículo, vaso deferente canal ejaculador e cloaca. Entre o testículo e o vaso deferente pode estar presente a vesícula seminal. Como órgãos de cópula, têm-se frequentemente os espículos, as asas caudais (bursa) e gubernáculo. Pode haver um ou dois testículos, nomeando-se aos machos monórquios e diórquios, respectivamente. Os testículos são semelhantes aos ovários, apresentando-se como tubos cegos de parede epitelial plana com as zonas germinativa e de crescimento. Os espermatozóides formados nos testículos podem ser armazenados na vesícula seminal. Os espermatozóides dos nematóides não apresentam flagelo e mostram movimento amebóide e na forma podem ser alongados, conóides, esferoidais ou discoidais. Segue-se o vaso ou canal deferente é um tubo de parede epitelial glandular que ao estreitar-se forma o canal ejaculador que se abre no reto. Da união dos sistemas digestivo e reprodutor forma-se a cloaca. Nela estão localizados os órgãos de cópula, espículos e gubernáculo. Os espículos são dois órgãos pares esclerotizados, móveis, curvos, que juntos formam uma passagem para o esperma no ato da cópula. O gubernáculo é uma pequena peça móvel, esclerotizada, localizada atrás dos espículos e que serve como guia (direcionamento) para eles. Extensões (expansões) da cutícula localizadas na região caudal e dispostas nos dois lados do corpo podem estar presentes e servem para manter os parceiros em posição adequada durante o ato sexual. Essas extensões da cutícula são chamadas de asas caudais ou bursa. BIOLOGIA DOS FITONEMATÓIDES Nematóides apresentam tipicamente quatro estádios juvenis entre o ovo e o adulto com quatro trocas (ecdises) do revestimento do corpo permitindo com isso o aumento em seu tamanho. Na literatura nematológica mais antiga, o termo larva é usado. Esse termo é inadequado porque do ovo do nematóide forma-se um indivíduo com todas as características do adulto, faltando-lhe apenas os órgãos reprodutores. O mais correto seria ninfa. No entanto, muitos autores vem utilizando o termo juvenil. Nos tilenchidas (Classe Secernentea), o primeiro estádio juvenil, J1, passa para J2 dentro do ovo. Enquanto que nos longidoridos e trichodoridos (Classe Adenophorea) é o J1 que eclode do ovo. Pensando nos tilenchidas, o ciclo de vida acontece da seguinte maneira: o ovo ao ser formado é uma célula única, que após uma série de divisões celulares (desenvolvimento embrionário), possibilitará a formação de um juvenil, chamado de juvenil de primeiro estádio (J1). O J1 fica dentro do ovo e sofre a primeira ecdise (troca do revestimento do corpo do nematóide), passando para juvenil de segundo estádio (J2). O J2 formado, ainda dentro do ovo, inicia o processo de eclosão (saída). O J2 já fora do ovo, pode estar no solo ou no tecido da planta hospedeira. O J2 sofrerá a segunda ecdise, passando para J3. O J3 sofrerá a terceira ecdise, passando para J4. O J4 sofrerá a quarta ecdise (última ecdise), entrando na fase adulta, sendo então normalmente, fêmea ou macho. Após essa última ecdise, os órgãos sexuais aparecem pela primeira vez, ou seja, a fase juvenil não apresenta sistema reprodutor desenvolvido. Os nematóides costumam apresentar os sexos separados. Indivíduos hermafroditos são raros e muitos dos casos relatados precisam ser confirmados. Há muitos casos de indivíduos anormais que, como intersexos, exibem características tanto de machos como de fêmeas. Geralmente, são fêmeas anormais que, além de sistema reprodutor feminino completo e funcional, têm órgãos de macho como, por exemplo, espículos. Raramente, o intersexo é um macho com órgãos femininos, tais como vulva e vagina. As espécies de nematóides, com algumas exceções, têm fêmeas e machos e se reproduzem por anfimixia (reprodução cruzada). Em algumas espécies só a fêmea ocorre normalmente, sendo os machos inexistentes ou muito raros, e então a reprodução é geralmente por partenogênese (reprodução a partir de um único indivíduo - fêmea - sem a participação do macho, formando ovos não

8 fertilizados) que pode ser meiótica ou mitótica. O número de ovos produzidos varia com a espécie do nematóide e a planta hospedeira. Os ovos após serem liberados pela fêmea podem ficar individuais ou agregados. Essa agregação (agrupamento) acontece pela formação e secreção de uma matriz gelatinosa para envolver os ovos. Tais massas de ovos estão associadas com espécies de fêmeas com corpo avolumado e sedentárias. Os ovos podem, também, ficar retidos e protegidos dentro do corpo de fêmeas mortas dos gêneros Heterodera e Globodera. Esse corpo restando apenas a parede do corpo rígida e escurecida contendo ovos é chamado de cisto. A duração do ciclo de vida (ovo a ovo) varia em função do gênero, espécie ou raça do nematóide, da planta hospedeira e do ambiente (principalmente temperatura e umidade). Os fitonematóides podem ser classificados em dois grandes grupos conforme o tecido vegetal parasitado: parasitos de órgãos subterrâneos ou de parte aérea. A maioria dos fitonematóides são parasitos de órgãos subterrâneos (raízes, rizomas, tubérculos, etc). Conforme o hábito de alimentação, os fitonematóides podem ser classificados em ectoparasitos ou endoparasitos. Dentro de cada um desse grupo ocorre uma sub-classificação, conforme a perda ou não da mobilidade de seus juvenis ou fêmea durante o parasitismo no tecido vegetal: sedentários ou migradores. VERIFICAÇÃO DA PATOGENICIDADE DE FITONEMATÓIDES Um organismo é apontado como patógeno de uma determinada doença quando é possível aplicar os postulados de Koch (1882): 1 - o patógeno deve estar associado à doença (associação constante) 2 - obter o organismo em cultura pura (isolamento em cultura pura) 3 - inocular o organismo, isolado em cultura pura, em hospedeiro sadio da mesma espécie ou variedade da planta doente e conseguir a reprodução da doença (reprodução da doença pela inoculação do isolado) 4 - reisolamento do organismo em meio de cultura e identificação, comparando com o primeiro patógeno isolado (reisolamento) O que pode complicar a aplicação dos postulados de Koch? conseguir cultura pura de nematóides: culturas gnobióticas (gnotobiologia é o estudo de um organismo qualquer na ausência de outras espécies demonstráveis ou na presença de espécies conhecidas) podem permitir o estudo de patogenicidade além de estudos de parasitismo, de alterações fisiológicas e bioquímicas verificadas em plantas atacadas, de eclosão de juvenis e movimentação de nematóides, entre outros. Pesquisar câmaras de isolamento, raízes excisadas, calos de tecidos vegetais, discos de cenoura como técnicas de criação e manutenção de fitonematóides. Para aplicação dessas técnicas a axenização dos nematóides é muito importante. A axenização é a eliminação de contaminantes presentes na superfície externa do corpo dos nematóides. E internamente? Para a Ordem Tylenchida quando ocorre a eliminação dos contaminantes externos não se preocupa com contaminação interna porque o estilete apresenta um orifício muito pequeno que não permite a entrada de bactérias, o que dá segurança nos estudos gnobióticos. Para Ordem Dorylaimida temos os fitonematóides transmissores de vírus e como esses estão internos não são eliminados. Por isso que estudos gnobióticos com esses fitonematóides normalmente não dão certos. Pesquisar como pode ser feita a axenização de fitonematóides. conseguir nematóides em número suficiente e em menor tempo lembrar que o solo é biologicamente complexo: solo tratado, água de irrigação,...

9 MOUNTAIN estabeleceu que para verificar a patogenicidade de um fitonematóide deveriam ser observados quatro aspectos: associação; capacidade parasítica; envolvimento da doença e o papel do nematóide na doença. ASSOCIAÇÃO: para estabelecer uma associação do nematóide com a doença teríamos que: - fazer um levantamento, percorrendo todas as áreas onde está ocorrendo a doença, coletando amostras e realizando a extração - complementação com a realização de alguns testes: aplicação de nematicidas e inoculação do nematóide em doses crescentes em plantas sadias (normalmente essas doses seguem uma escala logarítmica) CAPACIDADE PARASÍTICA: verificar penetração e alimentação nos tecidos da plantas. ENVOLVIMENTO DA DOENÇA: aqui ocorre o controle do envolvimento de outros microrganismos encontrados na suspensão original de fitonematóides (produto final da extração). O controle de microrganismos associados (CMA) é um tratamento que vai ser inoculado nas plantas sadias. Para separar os nematóides dos outros microrganismos é utilizada a peneira, preferencialmente a de 325 mesh. PAPEL DO NEMATÓIDE NA DOENÇA: agravador, excitante, vetor e patógeno. Agravador seria qualquer nematóide que, enquanto presente em uma área necrótica, formada por um incitante ou patógeno, libera substâncias tóxicas capazes de matar células do hospedeiro, diretamente e/ou predispõe células não afetadas à invasão por microrganismos e/ou estimula crescimento de microrganismos prejudiciais. Incitante seria o nematóide parasito que ataca tecidos sadios da planta, formando campo de infecção para outros microrganismos, o nematóide por si só não causa a doença. Vetor é o nematóide que leva o patógeno para o interior da planta e não está envolvido na etiologia da doença. Patógeno é o nematóide parasito que pode causar a doença na ausência de qualquer outro microrganismo. RELAÇÕES ECOLÓGICAS Os fatores bióticos que afetam populações de fitonematóides podem ser: a) hospedeiro: hospedabilidade e disponibilidade de local de alimentação. b) parasito: ciclo de vida, taxa de reprodução, mecanismos de sobrevivência, infectividade. Os nematóides ectoparasitos migradores e endoparasitos migradores geralmente ovipositam seus ovos individualmente conforme são produzidos e assim liberados exclusivamente no solo no caso dos primeiros e no caso dos endoparasitos migradores, essa deposição individual poderá ocorrer tanto no solo como no tecido vegetal, pois dependerá de onde estiver a fêmea no momento dessa liberação. Os nematóides endoparasitos sedentários e ectoparasitos sedentários liberam seus ovos em massas (matriz gelatinosa). No caso dos gêneros Heterodera e Globodera, boa parte dos ovos produzidos pela fêmea fica retida no corpo da fêmea, que quando morre torna-se o cisto contendo e protegendo os ovos, que sobrevive por vários anos. O tempo de duração para ocorrer um ciclo de vida é diferente para os diferentes gêneros e espécies de fitonematóides e é grandemente influenciado pela temperatura. O gênero Xiphinema pode exigir um ano para completar o seu ciclo de vida. Já Aphelenchoides exige 10 dias. Os gêneros Meloidogyne gasta 4 semanas e Tylenchulus, 8 semanas. As taxas de reprodução também são importantes. Por exemplos: Aphelenchoides 20 a 30 ovos por fêmea; Meloidogyne média de 500 ovos podendo chegar a mais de ovos; Ditylenchus 200 a 500 ovos; Rotylenchulus 50 a 100 ovos. c) homem: práticas culturais (rotação de culturas, cultivares resistentes, controle químico, alqueive, etc.), práticas conservacionistas do solo (curvas de nível, plantio direto, adubação verde) d) biota: fungos, bactérias, nematóides, vírus, insetos, ácaros e outros.

10 Os fatores abióticos que afetam populações de fitonematóides podem ser: a) topografia: elevação, declividade, exposição b) ambiente do solo: umidade (chuva, geada,...), temperatura (média, extremos, duração de extremos, acumuladas térmicas,...), aeração, textura, estrutura, ph e fertilidade, matéria orgânica, trocas gasosas. Os nematóides são organismos muito adaptados para viverem no solo e apresentam algumas características que possibilitam essa adaptação: tamanho, formato e diâmetro do corpo; cutícula hidrofílica (qualquer gotícula de água que cai sobre o corpo do nematóide se espalha rapidamente por toda a superfície e a água é essencial para a sua movimentação) e movimento ondulatório que facilita a locomoção entre as partículas de solo. A capacidade de campo na faixa de 40 a 60% é a mais propícia. A temperatura ótima para a maioria dos nematóides está na faixa de o C, pensando em nematóides de clima tropical ou subtropical. Nas faixas de 5-15 o C e de o C, os nematóides podem ficar inativos ou com atividades reduzidas. Temperaturas fora desses limites são letais, sendo que a 52 o C ocorre a morte instantânea em questão de segundos. O oxigênio é essencial para os nematóides. O tamanho das partículas do solo e o espaço dos poros são importantes: o movimento do nematóide pode ser inibido quando os espaços dos poros são muito estreitos. Por isso que problemas de nematóides são maiores em solos arenosos. Contudo é bom salientar a baixa capacidade de retenção de água por solos arenosos. A adição de certos materiais orgânicos pode estimular a diminuição de populações de fitonematóides por liberar substâncias tóxicas quando de sua decomposição e por estimular a formação de uma microbiota contendo possíveis organismos de controle natural biológico. Cabe salientar que a matéria orgânica estaria disponibilizando mais nutrientes, melhoraria as condições físicas para o crescimento e ocupação do sistema radicular das plantas o que resultaria em um melhor desenvolvimento da planta. As populações de nematóides estão distribuídas em termos de espaço e tempo em: a) distribuição horizontal no solo b) distribuição vertical no solo c) distribuição temporal (ao longo dos meses do ano) A distribuição horizontal de nematóides no campo é muito irregular. Apresentam-se em manchas ou em focos ao acaso. Essas manchas são constituídas de plantas com sintomas reflexos de parte aérea e são denominadas de reboleiras. Os nematóides apresentam movimentação própria muito pequena, mas que é importante para realização de suas funções vitais como eclosão, orientação para exsudatos, atração sexual, e outras. Os estádios infectivos migradores de endoparasitos sedentários; juvenis e fêmeas récemformadas de ectoparasitos sedentários; juvenis e adultos de ectoparasitos migradores e endoparasitos migradores podem movimentar no solo em torno de 1m por ano. Os nematóides concentram-se na camada de 0 a 30 cm de profundidade no perfil do solo. Por que? Nesta camada concentram-se a maioria das raízes da planta e condições ótimas de oxigenação, de umidade e de temperatura. Os nematóides podem ser carregados a grandes distâncias pela água, pelos animais e pelo próprio homem, por meio de materiais vegetais e no solo. As populações de nematóides são menores na época de plantio e aumentam atingindo maiores níveis na época da colheita da cultura. Ovos e juvenis de Meloidogyne apresentam uma redução de 70 a 90% durante o período de entressafra ( inverno ). Nas culturas perenes, a flutuação populacional acontece também, pois as plantas apresentam desenvolvimento radicular diferencial conforme a época do ano. É importante considerar a época amostrada para que se possa realizar comparações de resultados de análises nematológicas.

11 INTERAÇÕES ENTRE FITONEMATÓIDES E DE FITONEMATÓIDES COM OUTROS ORGANISMOS (FUNGOS, BACTÉRIAS, VÍRUS, INSETOS, ÁCAROS) Fitonematóide x fitonematóide: a presença de um fitonematóide pode influenciar a dinâmica populacional de um outro fitonematóide. Exemplos: Pratylenchus brachyurus aumenta sua população em algodoeiro quando na presença de Meloidogyne incognita e M. arenaria. Heterodera glycines diminui sua população na presença de Meloidogyne incognita. Fitonematóide x fungo: temos interações favoráveis ao desenvolvimento de doenças causadas por fungos fitopatogênicos quando na presença de fitonematóide. Exemplo: murcha de Fusarium e o gênero Meloidogyne. Também existem interações entre fitonematóides e fungos micorrízicos em que o desenvolvimento dos fitonematóides é comprometido. O controle biológico com fungos também merece destaque, ocorrendo fungos predadores, parasitos de ovos, juvenis, fêmeas e cistos, produtores de metabólitos tóxicos. Fitonematóide x bactéria: temos interações favoráveis ao desenvolvimento de doenças causadas por fitobactérias quando na presença de fitonematóide, mas os exemplos são poucos quando comparados aos de fungos. Exemplo: Aphelenchoides fragariae e Xanthomonas begoniae em folhas de begônia. Temos também o comprometimento da fixação biológica por Bradirhyzobium quando na presença de Heterodera glycines na cultura da soja. O controle biológico de fitonematóides com a bactéria do gênero Pasteuria também é muito importante. Fitonematóide x vírus: mais de 25 espécies dos gêneros Xiphinema, Longidorus, Trichodorus e Paratrichodorus são vetores de vírus de plantas. A primeira evidência experimental comprovando a transmissão de um vírus por nematóide foi realizada por Hewiit et al. (1958) que demonstraram que Xiphinema index era capaz de transmitir o vírus causador da doença folha em leque de videira em vinhedos americanos. Nematóides de duas famílias, Longidoridae e Trichodoridae, transmitem vírus de dois diferentes gêneros de vírus. Os primeiros dos gêneros Longidorus e Xiphinema, transmitem os nepovírus, e os últimos dos gêneros Trichodorus e Paratrichodorus, os tobravírus. De cerca de 375 espécies de Longidorus e Xiphinema e de 80 espécies de Trichodorus e Paratrichodorus, apenas 8 espécies de Longidorus, 7 espécies de Xiphinema, 4 espécies de Trichodorus e 7 espécies de Paratrichodorus foram identificadas como vetores de vírus. As partículas de vírus precisam ser ingeridas de uma planta infestada, associarem-se e subsequentemente dissociarem-se do sítio específico de retenção dentro do vetor e serem introduzidas numa célula da planta receptora. Todos os juvenis e adultos podem transmitir os vírus associados, mas estes não são retidos durante as ecdises, nem passam através do ovo para a progênie do vetor. AMOSTRAGEM Finalidade da amostragem: determinar as espécies de nematóides bem como distribuições e densidades populacionais. Fatores que influenciam a distribuição e a densidade de nematóides: época do ano, cultivos anteriores, textura do solo e práticas de manejo de nematóides. Se o nematóide está presente, a distribuição no campo normalmente ocorre em focos (visualizados pelas reboleiras). Melhor época para coletar amostras: normalmente, as populações de nematóides são baixas na primavera (início do cultivo) e vão aumentando conforme vai avançando a estação de crescimento e desenvolvimento da planta cultivada e alcança o pico de população na colheita.

12 Lembrar que o nematóide pode estar presente o ano todo, o que diferencia de uma época para outra, seria se o nematóide está na fase de sobrevivência ou de multiplicação na planta hospedeira cultivada. Número de amostras a ser coletadas: esse número é baseado no valor da informação que você ganhará com o custo de coleta e envio de amostras para o Laboratório de Análise bem como do preço da análise nematológica. Quanto maior o número de amostras coletadas, mais precisa e confiável será a estimativa. O custo de uma determinação acurada da população de nematóides não deverá exceder o custo de manejo do nematóide e os benefícios do controle. Planejamento antes de proceder a coleta: rever os padrões de cultivos anteriores; determinar textura de solo e outras alterações no campo; identificar manchas no campo e observar os sintomas nas plantas; dividir a área baseado em histórico de cultivo e tipo de solo. Coleta de amostras e cuidados com as amostras coletadas: as propriedades devem ser divididas em talhões, glebas, quadras, pivôs ou quadrantes de pivô para realização da amostragem de solo e de raízes. O importante é que a divisão represente homogeneidade no tocante ao aspecto observado na lavoura. Caso ocorra, dentro de uma divisão, plantas com aspectos diferentes, proceder uma subdivisão ou subdivisões. Em cada unidade será realizado o caminhamento em zigue-zague coletando-se, por meio de trados, enxadas ou enxadões, de 10 a 20 amostras simples (500 g de solo e 10 g de raízes). É interessante remover a camada superficial do solo antes da retirada das amostras. As amostras simples serão coletadas ao longo do perfil dos primeiros 20 a 30 cm de profundidade. Essas amostras simples serão homogeneizadas e resultarão em uma amostra composta contendo 500 a 1000 g de solo e 10 a 50 g de raízes. Essa amostra composta deve ser acondicionada em saco plástico (por que não deve ser usado saco de papel?) que deverá ser identificado, fechado e ser acompanhado de uma ficha de identificação da amostra (local, data de coleta, proprietário, cultura e outros dados que julgar necessários). Muitas vezes, é bastante útil fazer o croqui da área amostrada. As amostras compostas deverão chegar no laboratório, no prazo máximo de, 72 horas após a coleta para o início dos procedimentos de técnicas de extração de nematóides. As amostras devem ser protegidas da exposição ao sol para evitar aquecimento excessivo. No caso de viveiro de mudas (café, citros, seringueira, essências florestais,...) coletar aleatoriamente, no mínimo 10 mudas para cada lote de 1000 mudas, tomando parte do solo e radicelas de cada muda (sem precisar destruí-las) e ir colocando em um balde para constituir a amostra composta do lote. EXTRAÇÃO DE NEMATÓIDES A PARTIR DE AMOSTRAS DE SOLO E DE PARTES VEGETAIS Amostras de solo: Flutuação centrífuga em solução de sacarose: a amostra composta entregue ao laboratório deve ser homogeneizada antes de retirar a alíquota (qual o motivo desse procedimento?) coloca-se uma alíquota de 150 cm 3 de solo (alguns laboratórios trabalham com alíquotas de 100 cm 3 de solo) em um balde (ou outro recipiente), adicionando-se em torno de 2 litros de água de torneira; mistura-se bem, desmanchando os torrões (para que serve esse procedimento?); deixa-se em repouso durante 15 segundos (o que acontece nesse tempo?);

13 passa-se a suspensão pela peneira de 20 mesh (no lugar de 20 mesh podem ser usadas a de 40 ou 60 mesh) que está sobreposta a de 325 mesh (no lugar de 325 mesh podem ser usadas a de 400 ou a de 500 mesh) (o que significa mesh?) recolhe-se o resíduo da peneira de maior mesh (325, 400 ou 500 mesh), com auxílio de jatos de água de uma piseta (frasco lavador) para um copo de béquer (o que fica na peneira de mesh menor? qual a importância da utilização da peneira de mesh menor?) a suspensão homogeneizada do copo de béquer é distribuída para tubos de centrífuga, cuidando para que os mesmos fiquem balanceados. O balanceamento é feito pela altura da suspensão em cada tubo; centrifuga-se por 5 min a uma velocidade de 650 gravidades (o que significa gravidades?) que na Centrífuga Excelsa Baby II Modelo 206-R corrsponde a rpm (o que é rpm?); elimina-se cuidadosamente o líquido sobrenadante e limpa-se a parede interna do tubo de centrífuga (qual o motivo dessa limpeza?); adiciona-se ao resíduo de cada tubo, solução de sacarose (454 g de açúcar cristal ou refinado em 1 L de água) e misture bem os sedimentos (qual o cuidado que se deve ter nessa fase com a solução de sacarose em contato com o resíduo e por que?); centrifuga-se à mesma velocidade anterior durante 1 min; verte-se o sobrenadante em uma peneira de 500 mesh e adiciona-se um pouco de água para retirar o excesso de solução de sacarose que está no resíduo da peneira; recolhe-se o resíduo da peneira de 500 mesh, com auxílio de jatos de água de uma piseta para um copo de béquer; a suspensão recolhida não deve ultrapassar 40 ml (por que desse limite de volume?). Funil de Baermann: a amostra composta entregue ao laboratório deve ser homogeneizada antes de retirar a alíquota (qual o motivo desse procedimento?); coloca-se uma alíquota de 50 cm 3 de solo sobre uma camada de papel facial (ou papel higiênico muito macio) disposta sobre uma peneira de chá; coloca-se a peneira de chá acoplada ao funil plástico (poderia ser de vidro) contendo água de torneira e que deve possuir em sua extremidade inferior uma mangueira de borracha fechada por uma presilha ou por um tubo de anestesia para obstruir o fluxo de água; ajusta-se o volume de água com uma piseta, de modo que a água fique em contato com o solo e tendo o cuidado para que não ocorra encharcamento do solo (por que deve ter esse cuidado?); após 24 horas (em alguns casos 48 h), coleta-se uma parte do líquido (no máximo 40 ml) do funil em que a mangueira foi apertada com a presilha ou recolhe-se o tubo de anestesia de dentista. No caso do tubo de anestesia, o conteúdo é despejado em um copo de béquer e o tubo lavado várias vezes, recolhendo a água dessas lavagens para esse copo. Lembrar que o volume final não deverá ultrapassar os 40 ml. Extração de cistos de Heterodera glycines: homogeneizar a amostra composta de solo em uma bandeja; retirar uma alíquota de 150 cm 3 de solo; colocar essa alíquota em um recipiente contendo de 1 a 2 L de água; misturar bem o solo à água, desmanchando os torrões de solo; interromper a agitação e deixar em repouso por 15 s; verter a suspensão de solo em duas peneiras sobrepostas, 20 e 100 mesh, respectivamente; descartar o resíduo da peneira de 20 mesh;

14 recolher o resíduo da peneira de 100 mesh com auxílio de jatos de água de uma piseta para um copo; verter a suspensão recolhida no copo em um funil plástico contendo papel de filtro dobrado em cone; deixar passar toda a água e esperar por um tempo; retirar o papel de filtro e abrí-lo; colocar o papel para visualização em lupa; procurar os cistos no meio das partículas de solo e outros componentes, contá-los e classificálos como cistos viáveis e não viáveis (o que é um cisto viável?). Amostras de partes vegetais (raízes, folhas, sementes, caules,...): Funil de Baermann: pesa-se o material vegetal que será processado (qual a importância desse peso?); corta-se o material vegetal em fragmentos, podendo até desfiá-lo se possível (qual a razão desse procedimento?); o material cortado ou desfiado é colocado sobre o lenço facial disposto sobre a peneira de chá; todos os demais passos seguem o mesmo procedimento descrito anteriormente para amostra de solo. Borbulhamento de ar: pesa-se o material vegetal que será processado; corta-se o material vegetal em fragmentos, podendo até desfiá-lo se possível; coloca-se o material em um copo de béquer contendo 1 L de água e dentro do recipiente deverá estar a mangueira de ar acoplada ao aparelho de borbulhamento de ar de aquário (qual a importância desse borbulhamento?); após 24 horas (em alguns casos 48 ou mais horas), passa-se a suspensão por uma peneira de 200 mesh sobreposta a de 500 mesh (ou de 325 ou de 400 mesh); recolhe-se o resíduo da peneira de 500 mesh, com auxílio de uma piseta de água, para um copo de béquer. Lembrar que o volume final da suspensão não deve ultrapassar 40 ml. Técnica do liquidificador doméstico: pesa-se o material vegetal que será processado; corta-se o material vegetal em fragmentos, podendo até desfiá-lo se possível; coloca-se o material no copo do liquidificador, preenchendo com água ou solução de hipoclorito de sódio a 0,5 % de cloro ativo até que encubra o material (por que usar hipoclorito de sódio?); liga-se o liquidificador em sua menor rotação por um período de 20 a 60 s no máximo; passa-se a suspensão obtida pela peneira de 200 mesh sobreposta a de 500 mesh (ou de 325 ou de 400 mesh); recolhe-se o resíduo da peneira de 500 mês, com auxílio de uma piseta de água, para um copo de béquer. Lembrar que o volume final da suspensão não deve ultrapassar 40 ml.