AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTI-PROLIFERATIVO E GENOTÓXICO DO FRUTO DA AROEIRA (Schinus

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1 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTI-PROLIFERATIVO E GENOTÓXICO DO FRUTO DA AROEIRA (Schinus terebinthifolius RADDI, ANACARDEACEAE) EVALUATION OF THE ANTIPROLIFERATIVE AND GENOTOXIC EFFECT OF THE AROEIRA FRUIT (Schinus terebinthifolius RADDI, ANACARDEACEAE) Jorge Augusto Petroli Marchesi (1) Vanessa Thomé (2) Igor Caetano Dias Alcarás (2) Igor Lopes Coqueiro (2) Jéssica Fernanda de Almeida Silva (2) Nestor Dario Franco Marulanda (3) Resumo Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardeaceae), popularmente conhecida como aroeira, é uma planta com um vasto uso na medicina popular, e mais recentemente tem se destacado pelo uso dos seus frutos como condimento culinário. Estudos recentes têm demonstrado que o extrato da casca e das folhas apresenta potencial tóxico para células animais e vegetais, no entanto nenhum estudo avaliou a segurança dos frutos. Com isso, o presente trabalho objetivou avaliar o potencial citotóxico e genotóxico do extrato aquoso dos frutos de S. terebinthifolius através do sistema teste de Allium cepa. Para isso o extrato aquoso dos frutos da aroeira foi extraído e diluído nas concentrações de 100, 50, 25 e 10 mg/ml. Bulbos de cebola saudáveis foram submetidos aos tratamentos com as diferentes concentrações do extrato. Após 72 horas de exposição as raízes foram coletadas e utilizadas para a confecção de lâminas pela metodologia de esmagamento para avaliação da presença de micronúcleos, aberrações cromossômicas, e alterações no ciclo celular. Os dados obtidos neste trabalho demonstraram o poder citotóxico do extrato aquoso dos frutos de S. terebinthifolius quando empregado em grandes concentrações, e sugere que compostos presentes no fruto da aroeira tem o potencial de comprometer a maquinaria do ciclo celular e assim gerar alterações cromossômicas. Palavras-chave: Ciclo celular, Micronúcleo, Mutagênese, Pimenta-rosa. Abstract Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardeaceae), popularly known as aroeira, is a plant with a wide use in folk medicine, and more recently has been distinguished by the use of its fruits as a culinary condiment. Recent studies have shown that bark and leaf extract has toxic potential for plant and animal cells, however no studies have evaluated fruit safety. Thus, the present work aimed to evaluate the cytotoxic and genotoxic potential of the aqueous extract of the S. terebinthifolius fruits through the Allium cepa test system. For this the aqueous extract of the aroeira fruits was extracted and diluted in the concentrations of 100, 50, 25 and 10 mg/ml. Healthy onion bulbs were submitted to treatments with different extract concentrations. After 72 hours of exposure the roots were collected and used for the preparation of slides by the crushing methodology to evaluate the presence of micronuclei, chromosomal aberrations, and changes in the cell cycle. 1 Doutorando em Genética pela FMRP/USP; 2 Mestrando em Genética pela FMRP/USP. 3 Doutorando em Genética e Melhoramento de plantas pela Unesp/FCAV. 1

2 The data obtained in this work demonstrate the cytotoxic power of the aqueous extract of the S. terebinthifolius fruits when used in high concentrations, and suggests that compounds present in the aroeira fruit have the potential to compromise the cell cycle machinery and thus generate chromosomal alterations. Keywords: Cell cycle, Micronucleus, Mutagenesis, Pink-pepper. 1. Introdução Schinus terebinthifolius Raddi (família Anacardeaceae), popularmente conhecida como aroeira, é uma planta nativa e amplamente encontrada em todo o território brasileiro, com um vasto uso na medicina popular para o tratamento de doenças inflamatórias e hemostáticas. Dentre os usos populares mais comuns destacam-se os banhos de assento após o parto, tratamento de doenças do sistema respiratório e urinário, micose, infecções por cândida, lavagem de feridas e úlceras. Mais recentemente tem se destacado pelo uso dos seus frutos como condimento culinário conhecido como pimenta-rosa, pink-pepper ou poivre rose (SOUZA et al., 2001). Estudos têm demonstrado que os extratos da casca e das folhas da aroeira apresentam potencial tóxico para células animais e vegetais (TERRA-JUNIOR et al., 2015; DONNELLY, GREEN e WALTERS, 2008). Outros estudos também identificaram seu potencial alelopático sobre algumas plantas, e ação larvicida, inseticida e repelente contra o mosquito Aedes aegypti. Apesar disso, nenhum estudo avaliou a segurança do extrato dos frutos quanto à capacidade citotóxica e genotóxica de seus compostos. Assim, no presente trabalho foi avaliada a capacidade antiproliferativa e citotóxica do extrato aquoso do fruto de Schinus terebinthifolius sobre o organismo teste Allium cepa L Material e Métodos Frutos maduros de Schinus terebinthifolius foram coletados e as amostras foram limpas e secas em estufa a 40 ºC por cinco dias, e então maceradas com o auxílio de almofariz e pistilo até a obtenção de matéria seca com um aspecto homogêneo. O extrato aquoso (EA) foi preparado utilizando 10g de matéria seca de frutos e 100 ml de água ultra-pura, e mantida sob agitação à 35 ºC por 4 horas. O extrato obtido foi filtrado e diluído nas concentrações de 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml e 10 mg/ml, e armazenado em frascos âmbar na geladeira. Para avaliar o efeito genotóxico e citotóxico do extrato aquoso dos frutos de Schinus teredinthifolius, utilizou-se o sistema teste de Allium cepa. Para isso bulbos saudáveis e que

3 3 não tiveram contato com defensivos químicos foram expostos às diferentes concentrações do extrato aquoso da semente de S. teredinthifolius. Para cada tratamento foram expostos três bulbos, utilizando-se como controle negativo água destilada, e como controle positivo a substância química fipronil em concentração de uso. Após 72 horas de exposição as raízes foram coletadas e fixadas em solução Carnoy 3:1 (Etanol:Ácido acético) e armazenadas em geladeira. Foram utilizadas três raízes de cada bulbo para a confecção das lâminas através do método de esmagamento. As lâminas foram analisadas em microscópio óptico sob um aumento de 400x, onde foram contadas células meristemáticas para a avaliação do número de micronúcleos, de células apoptóticas, e de células mitóticas nas diferentes fases do ciclo celular (prófase, metáfase, anáfase e telófase), totalizando 9 mil células por tratamento. Para a avaliação de aberrações cromossômicas foram contadas 100 células em mitose e identificado o número de células com formações de fragmentos, laggings e pontes cromossômicas. A análise estatística de todos os dados foi realizada utilizando o Teste t de Student bicaudal não pareado com nível de probabilidade <0,05. 3 Resultados e Discussão Após 72 horas de tratamento com as diferentes concentrações do extrato aquoso, o Índice Mitótico (IM) dos bulbos tratados não apresentou variação significativa com relação ao controle negativo (Figura 1A). No entanto, ao avaliar o número de células nas diferentes fases do ciclo celular (prófase, metáfase, anáfase e telófase) (Figura 1B), verificou-se que os grupos tratados com 100 e 50 mg/ml de extrato aquoso apresentaram apenas células mitóticas na fase inicial de prófase (Figura 5B), sugerindo que o extrato aquoso de Schinus terebinthifolius está agindo na interrupção do ciclo celular. Apesar de não ter sido encontrado diferenças significativas no número de células nas diferentes fases do ciclo celular entre os tratamentos e o controle negativo, percebe-se uma evidente diminuição no número de células em mitose quando tratadas com o extrato de S. terebinthifolius (Figura 1B). Esta alteração do ciclo pode estar ligada a presença de voláteis como os sesquiterpenos e monoterpenos presentes nos óleos essenciais de S. terebinthifolius, os quais na planta atuam como fitoalexinas responsáveis por dificultar o crescimento e a propagação de bactérias e fungos parasitas (BARBOSA, DEMUNER e CLEMENTE, 2007). Quando avaliado o número de células em processo de apoptose (Figura 2A) nos diferentes tratamentos, constatou-se uma maior quantidades de células apoptóticas no meristema das raízes tratadas com 100 e 50 mg/ml de extrato aquoso de Schinus

4 4 terebinthifolius em comparação com as células não tratadas. Por sua vez, foi identificada a presença de micronúcleos e aberrações cromossômicas estruturais nas células meristemáticas de Allium cepa tratadas com o extrato aquoso dos frutos (Figura 2B-L). Foi identificada a presença de células contendo micronúcleos no tratamento de 50 e 25 mg/ml (Figura 2B e C), e ainda, a presença de alterações do tipo laggings e pontes cromossômicas nestas duas concentrações. Outros tipos de aberrações cromossômicas e erros no ciclo celular mitótico foram identificados nas células tratadas com o extrato, como a presença de c-metáfases e anáfases multipolares (Figura 2G; Figura 2J-L). Carvalho et al. (2003) ao avaliar o efeito genotóxico do extrato aquoso da casca de S. terebinthifolius contra o DNA de Escherichia coli indicou que o extrato não foi capaz de produzir uma quebra dupla do DNA plasmidial. Uma das possíveis explicações para este achado é que o fruto da planta armazena uma quantidade muito maior de óleos essenciais e outros metabólitos que poderiam estar causando este efeito genotóxico (BARBOSA, DEMUNER e CLEMENTE, 2007). Figura 1 - (A) Avaliação do Índice Mitótico e (B) do ciclo celular das células meristemáticas da raiz de Allium cepa submetidas ao extrato aquoso do fruto de Schinus terebinthifolius.

5 Figura 2 - Micrografias das células meristemáticas de Allium cepa em (A) processo de apoptose indicadas pela seta negra, (B e C) com micronúcleos, e alterações cromossômicas do tipo: (D, E e F) anáfases com pontes; (G) c-metáfase; (H e I) cromossomos perdidos indicados pela seta vermelha; (J, K e L) e anáfases multipolares. 5 4 Conclusão Compostos presentes no fruto de Schinus terebinthifolius tem a capacidade de perturbar o ciclo celular, aumentando a chance da ocorrência de erros e por consequência o surgimento de anomalias cromossômicas estruturais e formação de micronúcleos. Referências BARBOSA, L. C. A.; DEMUNER, A. J.; CLEMENTE, A. D. Seasonal variation in the composition of volatile oils from Schinus Terebinthifolius Raddi. Quim. Nova, v. 30, n. 8, p , CARVALHO, M. C. R. D. et al. Evaluation of Mutagenic Activity in an Extract of Pepper Tree Stem Bark (Schinus terebinthifolius Raddi). Environmental and Molecular Mutagenesis, v. 42, p , DONNELLY, M. J.; GREEN, D. M.; WALTERS, L. J. Allelopathic effects of fruits of the Brazilian pepper Schinus terebinthifolius on growth, leaf production and biomass of seedlings of the red mangrove Rhizophora mangle and the black mangrove Avicennia germinans. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, v. 357, n. 2, p , SOUZA, P. A. et al. Estabelecimento de espécies arbóreas em recuperação de área degradada pela extração de areia. Rev. CERNE, v. 7, n. 2, p , 2001.

6 TERRA-JÚNIOR, O. N. et al. Study of Acute Genotoxic Potential of an Aqueous Extract of Schinus terebinthifolius Raddi: an in vivo Micronucleus Assay. Advanced Studies in Biology, v. 7, n. 8, p ,