SISTEMA TESTE DE Allium cepa COMO BIOINDICADOR DE CITOTOXICIDADE E GENOTIXICIDADE EM Aristolochia elegans Mast

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1 SISTEMA TESTE DE Allium cepa COMO BIOINDICADOR DE CITOTOXICIDADE E GENOTIXICIDADE EM Aristolochia elegans Mast Rafael Pereira de Paula¹, Samara Santos de Souza Bueno², Kátia Fabiane Medeiros Schmitt², Auana Vicente Tiago³, Ana Aparecida Bandini Rossi 4. 1 Graduando em Agronomia, Universidade do Estado de Mato Grosso, Alta Floresta- MT. rppagronomia@gmail.com. 2 Graduanda em Ciências Biológicas, Universidade do Estado de Mato Grosso, Alta Floresta-MT. 3 Mestranda em Biodiversidade e Agroecossistemas Amazônicos, Universidade do Estado de Mato Grosso, Alta Floresta-MT. 4 Profa Dra da Faculdade de Ciências Biológicas e Agrárias, Universidade do Estado de Mato Grosso, Alta Floresta-MT. Recebido em: 31/03/2015 Aprovado em: 15/05/2015 Publicado em: 01/06/2015 RESUMO O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito citotóxico e genotóxico do extrato de A. elegans por meio do teste de Allium cepa. Os extratos foram preparados com água destilada e material caulinar, usando as seguintes concentrações 5; 10; 15; e 20 mg ml -1. Observou-se células por tratamento. Os efeitos citotóxicos e genotóxicos foram avaliados pelo índice mitótico e aberrações cromossômicas e os dados submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey 5%. Os resultados evidenciaram um decréscimo no índice mitótico nas células meristemáticas das cebolas submetidas aos extratos de A. elegans em todas as concentrações, tanto em 24h, 48h quanto nas recuperadas (72h), diferindo-se estatisticamente do controle. Os extratos A. elegans apresentaram efeito citotóxico e genotóxico sobre as raízes de A. cepa, pois inibiram drasticamente as fases da mitose, alterando o índice mitótico em todas as concentrações utilizadas. Os extratos ocasionaram também alterações cromossômicas no processo de divisão celular. PALAVRAS-CHAVE: Cipó Mil Homens; Índice Mitótico; Plantas Medicinais. TEST SYSTEM Allium cepa AS A BIOINDICATOR CYTOTOXICITY AND GENOTIXIDADE IN Aristolochia elegans Mast. ABSTRACT The aim of this study was to determine the cytotoxic and genotoxic effects of extract of A. elegans through the Allium cepa test. The extracts were prepared in distilled water and stem material, using the following concentrations 5; 10; 15; and 20 mg ml cells were analyzed per treatment. Cytotoxic and genotoxic effects were assessed by mitotic index and chromosomal aberrations. Data were subjected to analysis of variance and means were compared by Tukey test 5%. The results show a decrease in the mitotic index in meristematic cells of onions submitted to A. elegans extracts at all concentrations, both in 24Hrs, 48hrs as the recovered (72hrs), ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

2 differing to control statistically.the extracts also caused chromosomal changes in the cell division process. KEYWORDS: Cipo Thousand Men; Mitotic Index; Medicinal Plants. INTRODUÇÃO A família Aristolochiaceae pertencente à ordem Magnoliiflorae, compreende sete gêneros, que inclui Aristolochia (GONZALEZ et al., 2010). A família apresenta distribuição por vários continentes, no entanto apenas os gêneros Aristolochia, Euglypha e Holostylis são encontrados no Brasil. De acordo com FORZZA, (2010) ocorrem no Brasil aproximadamente 83 espécies do gênero Aristolochia, entre elas Aristolochia elegans, uma planta nativa, não endêmica, distribuída nas regiões norte, nordeste, centro-oeste e sudeste. Aristolochia elegans Mast. é uma trepadeira de ramo sulcado, de crescimento emaranhado sobre si ou sobre outras plantas, as flores surgem das axilas das folhas, possuem estrias de cor púrpura, são grandes e solitárias, seu fruto é uma cápsula que apresenta formato oblongo (NASCIMENTO et al., 2010). Conhecida popularmente por jarrinha, papo de peru e mil homens é muito utilizada na medicina caseira para diversos tratamentos (LUIZ et al. 1990). A utilização de plantas medicinais tem aumentado significativamente entre a população brasileira, são empregadas para aliviar ou mesmo curar algumas enfermidades, uma vez que contam com princípios biologicamente ativos, também utilizados pela indústria farmacêutica na produção de fármacos (BADKE et al., 2011; HONÓRIO, 2013). No entanto, podem apresentar caráter de toxidade, resultando em efeitos deletérios, em virtude das interações entre os constituintes químicos das plantas (ARGENTA et al., 2011; CORRÊA et al., 2011), pois os organismos expostos ao uso indiscriminado dessas substâncias podem estar sujeitos a efeitos tóxicos, aneugênicos e mutagênicos significativos, sendo assim, resultando em danos celulares (BELCAVELLO et al., 2012). Inúmeros testes toxicológicos são utilizados para avaliar as concentrações e o tempo de exposição necessário para que os agentes tóxicos possam produzir efeitos adversos sobre os organismos (BRAGA et al., 2015). É comumente utilizado o teste Allium cepa em ensaios toxicológicos, como em estudos realizados com extratos vegetais, para avaliação dos aspectos macroscópicos como alteração da cor, formato, tamanho da raiz e ainda características microscópicas como alterações na divisão das células meristemáticas de cebola (LONGHIN, 2008). Uma série de estudos corrobora a utilização do teste de A. cepa como um ensaio importante na avaliação de extratos e infusões de plantas medicinais (BAGATINI et al., 2007; TEDESCO & LAUGHINGHOUSE, 2012), além de ser um ensaio de curto prazo com muitas vantagens: baixo custo, fácil manipulação, cromossomos em boas condições para estudo de danos ou distúrbios na divisão celular, incluindo a avaliação de riscos de aneuploidia (BELCAVELLO et al., 2012). Os efeitos da genotoxicidade e mutagenicidade podem ser constatados pelo fenômeno da inibição da divisão celular, o qual pode ser causado pela ação dos componentes existentes nas plantas medicinais (FRESCURA, 2012). A utilização de plantas medicinais como A. elegans é muito comum, assim surge à necessidade de realização de estudos sobre seu possível efeito, desta ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

3 forma este trabalho objetivou analisar a citotoxidade e a genotoxidade da espécie A. elegans através do teste de A. cepa. MATERIAL E MÉTODOS Amostras de caule de A. elegans foram coletadas no município de Nova Bandeirantes no norte do estado de Mato Grosso, posteriormente levado ao laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular, Campus universitário de Alta Floresta da Universidade do Estado de Mato Grosso UNEMAT. O material caulinar foi pesado em balança de precisão e fervido por três minutos em água destilada para obter os extratos nas concentrações de 0; 5; 10; 15 e 20 mg ml -1. Para o teste de citotoxicidade e genotoxicidade utilizou-se bulbos de A. cepa que foram submetidos aos extratos por 24h. Após este período, foram coletadas radículas de cada um dos bulbos e os extratos renovados. Após 48h de exposição aos extratos, novamente coletou-se algumas radículas, os bulbos foram então submergidos em água destilada por 24h para o tratamento de recuperação, e as raízes coletadas após este período. Em seguida as radículas foram fixadas em etanol: ácido acético (3:1) em temperatura ambiente por 24h, posteriormente transferidas para o álcool 70% e levados à geladeira até o momento da análise. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com três tratamentos (24, 48 e 72 horas) e cinco concentrações, com quatro repetições por concentração, totalizando 20 bulbos. Para as análises microscópicas os meristemas radiculares de cada amostra foram submergidos cuidadosamente por cinco minutos em água destilada em placa de Petri. As radículas foram secas em papel absorvente e colocadas na solução de HCl 5N por um período de 20 minutos e recolocadas na água por mais cinco minutos. O material a ser analisado foi colocado sobre a lâmina com uma pinça e com o auxílio de um bisturi foi seccionado a região meristemática apical, o restante do material foi descartado, deixando sobre a lâmina somente o material em plena atividade celular. Após este procedimento acrescentou-se 10µL de corante orceína acética 2%, e coberta com uma lamínula seguida de uma leve maceração com o bastão de vidro, através da técnica de esmagamento (GUERRA & SOUZA, 2002) e de acordo com protocolo de BARBÉRIO et al. (2011). O material foi observado em microscópio óptico binocular com magnitude de 40X. Foram preparadas quatro lâminas para cada concentração, em cada uma das lâminas foram contadas 500 células, totalizando células por concentração. Os efeitos citotóxicos e genotóxicos foram avaliados através da análise das divisões celulares, índice mitótico (IM) e aberrações cromossômicas (AC) segundo a equação proposta por PIRES et al. (2001). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey 5%, utilizando-se o recurso computacional Genes (CRUZ, 2008). RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1 estão expressos os resultados das análises de citotoxidade dos extratos de A. elegans sobre meristemas radiculares de A. cepa, submetidas aos tratamentos de 24, 48 horas e recuperadas 72 horas, nas concentrações de 0; 5; 10; 15 e 20 mg ml -1. Os resultados indicam que houve alterações significativas nos índices mitóticos. Foi observado um decréscimo no índice mitótico com o aumento ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

4 das concentrações e com o decorrer do tempo, sendo que todas as concentrações diferiram estatisticamente do controle. Os índices mitóticos das células de A. cepa expostas aos três tratamentos (TR 24h, TR 48h e RC 72h) não apresentaram diferenças entre suas médias, exceto para a concentração de 5 mg ml -1, no qual o tratamento de recuperação (72h) e 24h demonstraram diferenças estatísticas entre si. TABELA 1. Média do Índice mitótico obtidos para os tratamentos (TR) 24h, 48h e recuperadas (RC) 72h em células meristemáticas radiculares de A. cepa submetidas a diferentes concentrações de extratos de A. elegans. Concentrações Mg ml -1 TR (24h) TR (48h) RC (72h) 0 57,25 Aa 57,25 Aa 57,25 Aa 5 18,75 Ab 12,15 ABb 7,25 Bb 10 11,15 Ab 16,70 Ab 10,50 Ab 15 12,65 Ab 10,25 Ab 5,15 Ab 20 11,50 Ab 11,60 Ab 6,95 Ab Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas na horizontal e minúscula na vertical não diferem estatisticamente entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. FONTE: os autores. Resultados semelhantes foram encontrados por GIUSTINA et al. (2010), ao analisarem o efeito citotóxico de diferentes concentrações de Cinnamomum zeylanicum pelo teste em A. cepa. Conforme o aumento das concentrações ocorreu uma diminuição do número de células em divisão. Em estudo sobre o efeito citotóxico de Rosmarinus officinalis sobre as células de A. cepa, CARDOSO et al. (2014) obtiveram resultados parecidos, utilizando tratamentos de 24 e 48 horas, observaram um decréscimo do índice mitótico com o decorrer do tempo. LOUVATEL et al. (2014), observaram que mesmo após ser submetido a 24 horas de recuperação o índice mitótico das células de A. cepa permaneceu inferior ao controle (0h), em estudo sobre a citotoxidade de Stachys byzantina. Resultados semelhantes ao presente estudo, onde mesmo após o tratamento de recuperação o índice mitótico das células de A. Cepa não diferiu estatisticamente dos demais tratamentos. Esses resultados sugerem a presença de atividade anti-proliferativa e citotóxica de A. elegans, indicando seu potencial terapêutico para a inibição do ciclo celular, podendo estar ligado a presença de ácidos aristolóquicos, substância comum para espécies do gênero (LEITÃO et al., 1992). Segundo RIBEIRO et al. 2003, agentes genotóxicos e mutagênicos induzem alterações na molécula de DNA, podendo levar a um comprometimento das gerações futuras, pela característica de herdabilidade que apresentam, além de promover efeitos imediatos como o comprometimento da saúde dos organismos expostos. Neste estudo foram observadas algumas destas alterações tais como: anáfase com cromossomo isolado e pontes anafásicas (Figura 1), sugerindo um efeito citotóxico da infusão de A. elegans nas concentrações de 10 mg ml -1, 15 mg ml -1 e 20 mg ml -1. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

5 A B C D FIGURA 1. Células de Allium cepa em divisão celular. Telófase (a); Metáfase (b); Metáfase irregular (c); Anáfase com Ponte (d). FONTE: os autores. Comparando as frequências das diferentes fases da mitose dentro de cada tratamento (Tabela 2), nota-se maior presença de prófase em relação às outras fases subsequentes. Com o aumento da concentração do extrato, houve redução no índice mitótico, com menor crescimento radicular a partir da concentração de 5 mg ml -1. Nesta concentração houve uma queda acentuada, indicando maior inibição do crescimento radicular, independente dos tratamentos. Observou-se também que a concentração de 20 mg ml -1 teve um leve aumento no crescimento das raízes em relação a concentração 15 mg ml -1. NEVES et al. (2014), avaliando o efeito do extrato de Phyllanthus niruri sobre células de cebola, utilizaram quatro concentrações (0,02; 0,04; 0,06 e 0,08 Mg ml -1 ), sendo que a maior (0,08 Mg ml -1 ) provocou um aumento das divisões celulares em relação à concentração anterior (0,06 Mg ml -1 ), resultados semelhantes ao encontrado neste estudo. TABELA 2. Frequência das diferentes fases da mitose em células meristemáticas de raízes de A. cepa desenvolvidas sob diferentes concentrações de extratos de A. elegans. % de Células nas fases Tratamentos C. E. (mg ml - ¹) Prófase Metáfase Anáfase Telófase 0 130,2 A 64,5 A 56,5 A 35 A 5 60,2 B 10 B 10,7 B 12,7 AB TR (24h) 10 32,2 B 7,7 B 11,2 B 4,5 B 15 49,0 B 6 B 5,2 B 3 B 20 35,5 B 9,5 B 6,7 B 5,7 B 0 130,2 A 64,5 A 56,5 A 35 A 5 26,2 B 17,2 B 9,5 B 7,7 B TR (48h) 10 34,2 B 13 B 25,5 B 10,7 B 15 34,2 B 6,7 B 2,7 B 7,5 B 20 43,7 B 8,2 B 3,2 B 2,7 B 0 130,2 A 64,5 A 56,5 A 35 A 5 21,5 B 7 B 5 B 2,7 B RC (72h) 10 32,5 B 10 B 5,7 B 4,2 B 15 13,2 B 7 B 2,7 B 2,7 B 20 18,7 B 8,2 B 3,5 B 4,2 B Médias seguidas pelas letras maiúscula na vertical não diferem estatisticamente entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. FONTE: os autores. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

6 Poucos estudos foram realizados para avaliar os efeitos de extratos de A. elegans na divisão celular. MENDES et al., (2012) não observaram influencia significativa de Aristolochia birostris em células de cebola, embora tenha ocorrido um aumento considerável na prófase em todas as concentrações do extrato alcoólico. SILVA Jr., (2011) observaram atividade antimicrobiana em Aristolochia cymbifera contra bactérias entéricas. CONCLUSÕES Os resultados demonstraram que foi possível verificar a presença de atividade citotóxica de Aristolochia elegans sobre as raízes de Allium cepa, indicando seu potencial terapêutico para inibição do ciclo celular. REFERÊNCIAS ARGENTA, S. C.; ARGENTA, L. C.; GIACOMELLI, S. R.; CEZAROTTO, V. S. Plantas Medicinais: Cultura Popular Versus Ciência Medicinal. Vivências. v.7, n.12, p.51-60, BADKE, M. R.; BUDÓ, M. D. L. D.; SILVA, F. M. D.; RESSEL, L. B. Plantas Medicinais: O Saber Sustentado na Prática do Cotidiano Popular. Esc Anna Nery. v. 15; n.1; p ; BAGATINI, M. D.; SILVA, A. C. F.; TEDESCO, S. B. Uso do sistema teste de Allium cepa como bioindicador de genotoxicidade de infusões de plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, n. 3, p , BARBÉRIO, A.; VOLTOLINI, J. C.; MELLO, M. L. S. Standardization of bulb and root sample sizes for the Allium cepa test. Ecotoxicology, v. 20, n. 4, p , BELCAVELLO, L.; CUNHA, M. R. H.; ANDRADE, M. A.; BATITUCCI, M. D. C. P. Citotoxicidade e danos ao DNA induzidos pelo extrato de Zornia diphylla, uma planta medicinal. Natureza on line, v. 10, n. 3, p , BRAGA, J. R. M.; LOPES, D. M. Citotoxicidade e genotoxicidade da água do rio Subaé (Humildes, Bahia, Brasil) usando Allium cepa L. como bioindicador. Ambiente & Água-An Interdisciplinary Journal of Applied Science, v. 10, n. 1, p , CARDOSO, G. H. S.; DANTAS, E. B. S.; SOUSA, F. R. C.; PERON, A. P. Cytotoxicity of aqueous extracts of Rosmarinus officinalis L.(Labiatae) in plant test system. Brazilian Journal of Biology, v. 74, n. 4, p , CORRÊA, A. D.; BATISTA, R. S.; QUINTAS, L. E. M.; Plantas Medicinais: do cultivo a terapêutica. ed. 8. Petrópolis, RJ: Vozes, CRUZ, C. D. Programa Genes - Diversidade Genética. 1.ed. Viçosa, MG: Editora UFV, 2008, V.1, p ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p

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