UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO - UNIRIO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - CCBS INSTITUTO BIOMÉDICO - IB

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO - UNIRIO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - CCBS INSTITUTO BIOMÉDICO - IB DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA - DMP DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA DESEMPENHO REPRODUTIVO DE Nasonia vitripennis (Walker, 1836) (HYMENOPTERA: PTEROMALIDAE) SOB O EFEITO DA DIETA LARVAL E DO CONGELAMENTO DE PUPAS DE Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) (DIPTERA: CALLIPHORIDAE). Luana Christi Ferreira Messias RIO DE JANEIRO, RJ AGOSTO DE 2006

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO - UNIRIO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - CCBS INSTITUTO BIOMÉDICO - IB DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA - DMP DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA DESEMPENHO REPRODUTIVO DE Nasonia vitripennis (Walker, 1836) (HYMENOPTERA: PTEROMALIDAE) SOB O EFEITO DA DIETA LARVAL E DO CONGELAMENTO DE PUPAS DE Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) (DIPTERA: CALLIPHORIDAE). Luana Christi Ferreira Messias SOB A ORIENTAÇÃO DA Prof a. Dr a.valéria MAGALHÃES AGUIAR COELHO Monografia submetida como requisito parcial para obtenção de grau de bacharel em Ciências Biológicas, Modalidade Biológica. RIO DE JANEIRO, RJ AGOSTO DE 2006

3 TÍTULO DA MONOGRAFIA DESEMPENHO REPRODUTIVO DE Nasonia vitripennis (Walker, 1836) (HYMENOPTERA: PTEROMALIDAE) SOB O EFEITO DA DIETA LARVAL E DO CONGELAMENTO DE PUPAS DE Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) (DIPTERA: CALLIPHORIDAE). AUTORA: Luana Christi Ferreira Messias APROVADO EM: / /. MARCELLO XAVIER SAMPAIO CLAUDIA SOARES SANTOS LESSA VALÉRIA MAGALHÃES AGUIAR COELHO

4 FICHA CATALOGRÁFICA Messias, Luana Christi Ferreira Desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis (Walker, 1836) (HYMENOPTERA: PTEROMALIDAE) sob o efeito da dieta larval e do congelamento de pupas de Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) (DIPTERA: CALLIPHORIDAE). Rio de Janeiro, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Graduação em Ciências Biológicas; Modalidade Biológica, Vol.1, 87pp., 5 fig., 1 gráf. Monografia: Bacharel em Ciências Biológicas, Modalidade Biológica. 1-Parasitóide 2- Biologia 3- Controle Biológico

5 A meus queridos e amados pais, Cláudio Messias e Maria da Conceição Ferreira Messias, dedico esta monografia, pelo apoio incondicional, carinho e atenção conferidos a mim ao longo dos anos.

6 AS minhas irmãs Cristiane e Ana Claudia e ao meu sobrinho Santiago, dedico esta monografia, por me compreenderem e me apoiarem em todos os momentos.

7 AGRADECIMENTOS A Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro pelos conhecimentos adquiridos ao longo da minha vida acadêmica, pela possibilidade de realizar este trabalho e pela bolsa de Iniciação Científica concedida durante um ano da pesquisa. A minha orientadora Prof a. Dr a.valéria Magalhães Aguiar Coelho pela excelente orientação, pelos ensinamentos, incentivo, apoio, confiança e pela grande contribuição à minha formação acadêmica. A todo Corpo Docente da Universidade Federal do Estado Rio de Janeiro (UNIRIO) pelo ensinamento, contribuindo de forma excepcional à minha formação. A todos meus colegas, professores e funcionários do Departamento de Microbiologia e Parasitologia por serem sempre atenciosos e prestativos. Aos colegas do Laboratório de Estudos de Dípteros: Ana Luiza, Renata, Clarissa, Adriana e Leandro pela amizade, apoio e colaboração nos experimentos.

8 Aos meus amigos da Faculdade, em especial ao Robson, Luciana, Ana Carolina, Priscila, Ligia, Gisele, Luiza e Mariana, pelos momentos de felicidade e descontração, pelo companheirismo e principalmente pela amizade. Aos meus pais, minhas irmãs e meu sobrinho que sempre torceram pelo meu sucesso. A todos os meus familiares pelo incentivo, compreensão e ajuda em todos os momentos. A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a minha formação.

9 ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Nasonia vitripennis Posição taxonômica Ordem Hymenoptera Família Pteromalidae Biologia de Nasonia vitripennis Controle de insetos Chrysomya megacephala Posição Taxonômica Ordem Diptera Família Calliphoridae... 26

10 Importância dos Califorídeos Vetores de doenças Miíases Entomologia forense Terapia larval Polinização Dieta para Califorídeos Armazenamento de pupas hospedeiras em baixas temperaturas MATERIAIS E MÉTODOS Local de realização do trabalho Estabelecimento da colônia de Chrysomya megacephala Coleta Identificação Manutenção da colônia Estabelecimento da colônia de Nasonia vitripennis Coleta Identificação Manutenção da colõnia... 44

11 4.4. Procedimentos gerais de limpeza Procedimento utilizado para o congelamento de pupas Fase experimental Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO Desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis em pupas congeladas Desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis em pupas frescas oriundas da dieta larval Pedigree Júnior Razão sexual CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

12 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1- Fêmea de Nasonia vitripennis ovipositando em pupas de califorídeos FIGURA 2- Pupa de Califorídeo parasitoidada por Nasonia vitripennis FIGURA 3- Vista dorsal de Chrysomya megacephala FIGURA 4- Gaiola de criação da colônia estoque de Chrysomya megacephala FIGURA 5- Gaiola de criação da colônia estoque de Nasonia vitripennis... 45

13 ÍNDICE DE QUADROS QUADRO 1- Tempo de desenvolvimento de Nasonia vitripennis a temperatura de 25 C, segundo WERREN (2000)... 14

14 ÍNDICE DE TABELAS TABELA 1- Massa corporal (mg) média de pupas frescas e congeladas de Chrysomya megacephala com 24 horas de idade, oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior, utilizadas nas fases experimentais.. 51 TABELA 2- Duração média do desenvolvimento ontogenético (dias) de Nasonia vitripennis criadas em pupas frescas e congeladas 1,2 de Chrysomya megacephala oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior, sob condições controladas (T=27ºC/dia,25ºC/noite; 60+10% UR; 14h fotofase)... 53

15 TABELA 3- Número total de parasitóides emergidos e razão sexual de Nasonia vitripennis criadas em pupas frescas e congeladas 1 de Chrysomya megacephala oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior, sob condições controladas (T=27ºC/dia,25ºC/noite; 60+10% UR; 14h fotofase) TABELA 4- Número médio de parasitóides de Nasonia vitripennis emergidos de pupas frescas e congeladas 1 de Chrysomya megacephala oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior, sob condições controladas (T=27ºC/dia, 25ºC/noite; 60+10% UR; 14h fotofase) TABELA 5- Parâmetros relativos a pupas frescas e congeladas 1 de Chrysomya megacephala oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior expostos ao parasitoidismo por Nasonia vitripennis, sob condições controladas (T=27ºC/dia, 25ºC/noite; 60+10% UR; 14h fotofase)... 58

16 TABELA 6- Parâmetros relativos a pupas de Chrysomya megacephala oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior não expostos ao parasitismo, sob condições controladas (T=27ºC/dia, 25ºC/noite; 60+10% UR; 14h fotofase)... 60

17 ÍNDICE DE GRÁFICOS GRÁFICO 1- Ritmo de emergência de machos (A) e fêmeas (B) de Nasonia vitripennis expostas por 48 horas a pupas frescas e congeladas de Chrysomya megacephala oriundas das dietas larvais carne bovina e ração para cães Pedigree Junior, sob condições controladas (T=27ºC/dia,25ºC/noite; 60+10% UR; 14h fotofase)... 54

18 RESUMO O presente estudo objetivou avaliar o efeito do congelamento de pupas e da dieta larval de Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) sobre o desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis (Walker, 1836). O trabalho foi conduzido no Laboratório de Estudos de Dípteros, Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro. As colônias de C. megacephala e de N. vitripennis iniciaram-se a partir de coletas de indivíduos adultos da Fundação Rio-Zoo, RJ. Estes insetos foram mantidos em condições de laboratório. As etapas experimentais foram conduzidas em câmara climatizada (Quimis) regulada a 27 C dia e 25 C noite, 60 ± 10% de umidade relativa do ar e 14 horas de fotofase. A fotofase iniciou-se às 6 horas da manhã. O desempenho reprodutivo de N. vitripennis foi avaliado utilizando-se pupas de C. megacephala congeladas por períodos de 1, 3 e 6 meses oriundas da dieta larval carne bovina e de

19 pupas frescas oriundas da dieta larval Pedigree Junior. Como tratamento controle utilizou-se pupas frescas oriundas da dieta larval carne bovina. As pupas foram individualizadas em tubos de ensaio e expostas a uma fêmea de N. vitripennis com até 24 horas de idade pertencentes à 4ª geração. Os tubos de ensaio foram tampados com algodão hidrófobo e as pupas foram expostas ao parasitoidismo durante 48 horas. Após a exposição, os microhimenópteros foram descartados. As observações foram diárias, realizadas sempre no mesmo horário e acompanhadas até o 15º dia após a primeira emergência do adulto parasitóide. Realizaram-se 30 repetições por tratamento. Foi realizada análise de variância seguida do pós-teste Tukey para avaliar o significado estatístico dos resultados, considerando o nível de significância de 5%. Pupas congeladas por um período de 3 e 6 meses não viabilizaram o desenvolvimento dos insetos parasitóides. Houve um aumento e uma extensão do período do desenvolvimento ontogenético de N. vitripennis em pupas de C. megacephala congeladas por 1 mês, bem como, em pupas frescas de C. megacephala oriundas da dieta larval Pedigree Junior. Observou-se uma queda acentuada no número médio de parasitóides emergidos de pupas de congeladas por 1 mês, bem como em pupas frescas de oriundas da dieta larval Pedigree Junior. O percentual de parasitoidismo de pupas de C. megacephala expostas ao microhimenóptero foi

20 significativamente inferior em pupas congeladas por 1 mês (23,33%), bem como em pupas frescas oriundas da dieta larval Pedigree Junior (70,00%), ambos comparados com o tratamento controle (90,00%). Estes resultados demonstraram que o congelamento de pupas de C. megacephala e a utilização da dieta larval Pedigree Júnior, influenciaram negativamente o desempenho reprodutivo de N. vitripennis.

21 Summary The present study objected the evaluation the effect of the pupae freezing and the larval diet of Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) on the reproductive performance of Nasonia vitripennis (Walker, 1836). The work was conducted in the Studies of Dípteros Laboratory, on Microbiology and Parasitology Department, on Rio De Janeiro Federal University. The C. megacephala and N. vitripennis colonies were initiated from adult individuals collections of the Rio- Zoo Foundation, RJ. These insects were kept in laboratory conditions. The experimental stages were conducted in regulated chamber (Quimis) 27 C day and 25 C night, 60 ± 10% of RH and 14 hours of photoperiod. The photoperiod initiated it the 6 a.m. The N. vitripennis reproductive performance were evaluated using C. megacephala pupae freezing in periods of 1, 3 and 6 months deriving of the bovine meat larval diet and pupae deriving of the Pedigree Junior larval diet. As

22 control group, was used fresh pupae originated from bovine meat larval diet. Pupae were individually in pipes and displayed at a N. vitripennis female up to 24 hours of age of the 4 th generation. The pipes were covered with hydrophobic cotton and the pupae were displayed to the parasitoid during 48 hours. After the exposition, the microhymenopteras were discarded. The observations were daily and always realized in the same hourly and observed until the 15º day after the first adult parasitoid emergency. Were realized 30 repetitions for treatment. Analysis of variance followed of the Tukey test was carried through to evaluate the meaning statistical of the results, considering the level of 5% significance. Pupae freezing by a period of 3 and 6 months had not made possible the development of the parasitoid insects. It had an increase and a extension of the ontogenético period development of N. vitripennis in C. megacephala pupae freezing by 1 month, as well as, in C. megacephala fresh pupae deriving of the Pedigree Junior larval diet. A fall accented in the average number of parasitoid/pupae was observed, in pupae freezing by 1 month, as well as in fresh pupae deriving of the Pedigree Junior larval diet. The C. megacephala pupae parasitoidism percentage displayed to the microhymenoptera, was significantly inferior in pupae freezing by 1 month (23.33%), as well as in fresh pupae deriving of the Pedigree Junior

23 larval diet (70.00%), both comparing with the group control (90.00%). These results demonstrated that the freezing of C. megacephala pupae and the use of the Pedigree Junior larval diet, had a negative influence on the N. vitripennis reproductive performance.

24 1.INTRODUÇÃO A família Pteromalidae (Hymenoptera, Chalcidoidea) inclui um grande número de espécies parasitóides, muitas das quais têm papel importante no controle biológico de muscóides sinantrópicos (RUEDA & AXTELL, 1985; CARDOSO & MILWARD-DE- AZEVEDO, 1996). Esse grupo foi observado no Brasil, emergindo de pupas de moscas em estudos de levantamentos a campo (SERENO & NEVES, 1993; MARCHIORI, 2004 e CARVALHO et al., 2005). Dentro da família Pteromalidae, Nasonia vitripennis (Walker, 1836) é reconhecida como um ectoparasitóide gregário de pupas de dípteros ciclorrafos, principalmente das famílias Calliphoridae e Sarcophagidae (CARDOSO & MILWARD-DE-AZEVEDO, 1995). Suas larvas se alimentam inserindo as peças bucais através do tegumento do hospedeiro, onde vários indivíduos se desenvolvem até a maturidade causando a morte do inseto hospedeiro. É um inseto polífago, isto é, pode parasitoidar

25 mais de 68 espécies de dípteros (WHITING, 1967), o que favorece significativamente a manutenção do parasitoidismo na natureza, após a implantação de programas de controle baseados na soltura inundativa em nichos preferenciais de moscas varejeiras. Este parasitóide foi relatado em todos os continentes (RUEDA & AXTELL, 1985), e no Brasil foi registrado em 1985 por MADEIRA & NEVES em pupas de Chrysomya sp.(robineau-desvoidy, 1830). Chrysomya megacephala (Fabricius, 1974), originária do Extremo Oriente (LAURENCE, 1981), foi registrada no Brasil em meados da década de 70 por GUIMARÃES et al. (1978), e atualmente encontra-se largamente distribuída na América Latina (WELLS, 1991). Ecologicamente, este díptero participa do processo de decomposição de cadáveres, auxiliando em estudos relacionados à entomologia forense (GREENBERG, 1991; WELLS & KURAHASHI, 1994 e OLIVEIRA-COSTA, 2003), além de atuarem de maneira eficaz na polinização de plantas sapromiofílicas (SILVA et al., 2001). No entanto, é considerado um dos mais importantes dípteros vetores de vírus, bactérias entéricas, protozoários e helmintos, possuindo alto grau de sinantropia (FURLANETTO et al., 1984; PARALUPPI, 1996 e OLIVEIRA et al., 2002). Suas larvas necrobiontófagas podem causar miíases facultativas nos seres humanos e nos animais (GUIMARÃES & PAPAVERO, 1999).

26 Imaturos de C. megacephala, em laboratório, podem ser mantidos com sucesso em dietas naturais como a carne bovina, eqüina e fígado de ave (AGUIAR-COELHO & MILWARD-DE- AZEVEDO, 1996; SANTOS et al., 1998 e PEDROSO et al., 2006). Portanto, a descoberta de uma dieta alternativa que permita a sua criação, preenchendo requisitos mínimos de qualidade biológica e quantidade a custos menores e em ambiente mais salubre de trabalho é um desafio a ser alcançado. Neste sentido, como dieta alternativa para os imaturos, ração para cães, comercialmente denominada de Pedigree Júnior vem sendo testada (MILWARD-DE-AZEVEDO et al., 2000 e BARBOSA et al., 2004). O método de controle de dípteros muscóides considerados pragas à pecuária tem sido quase que exclusivamente com o uso de inseticidas químicos. Porém, o uso indiscriminado destes compostos químicos tem proporcionado o desenvolvimento de insetos resistentes, além de agravos a saúde do homem e ao ambiente através dos seus efeitos tóxicos, bem como, pelo poder residual dos mesmos (CARVALHO et al., 2005). A eficiência do emprego de pteromalídeos no controle de muscóides vetores tem sido periodicamente confirmada (MORGAN, 1980; GEDEN et al., 1992 e GIBSON et al., 2000). Este método poderia induzir ao uso racional de inseticidas reduzindo os danos ambientais. Portanto, a

27 criação de parasitóides em larga escala caracteriza-se como uma etapa fundamental para a implantação de um programa de controle biológico dentro de um programa integrado de dípteros. Enquanto dietas artificiais não forem comercialmente disponibilizadas para a criação dos parasitóides, será exigida a obtenção de um expressivo número de hospedeiros preferênciais ou alternativos num reduzido intervalo de tempo (MILWARD-DE-AZEVEDO et. al., 2004). O armazenamento de pupas congeladas de C. megacephala, a serem utilizadas como hospedeiras preferências ou alternativas, possibilitaria a viabilização e racionalização da criação dos microhimenópteros. Além do benefício da disponibilidade contínua de pupas, com redução de custos e maior salubridade possibilitaria também, a inviabilização prévia do hospedeiro, garantindo a emergência única de parasitóides em liberações a campo (KLUNKER, 1982; PETERSEN, 1986 e MILWARD-DE-AZEVEDO & CARDOSO, 1996, 1998).

28 2.OBJETIVOS 1. Avaliar o efeito do congelamento de pupas de Chrysomya megacephala sobre o desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis, em condições controladas. 2. Avaliar o desempenho reprodutivo de N. vitripennis em pupas frescas de C. megacephala oriundas da dieta larval Pedigree Júnior, em condições controladas.

29 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Nasonia vitripennis Posição taxonômica Reino Animalia Linnaeus, 1758 Filo Arthropoda Von Siebold & Stannius, 1845 Subfilo Mandibulata Classe Insecta Linnaeus, 1758 Sub-Classe Pterygota Brauer, 1855 (Lang, 1889) Ordem Hymenoptera Subordem Apocrita Série Parasitica Superfamília Chalcidoidea Latreille, 1817 Família Pteromalidae Dalman, 1820 Subfamília Pteromalinae Gênero Nasonia (Ashmead, 1904) Espécie Nasonia vitripennis (Walker, 1836) Ordem Hymenoptera

30 Os insetos da ordem Hymenoptera formam um grupo diverso, com aproximadamente espécies (LA SALLE & GAULD, 1993). Esta ordem é um dos maiores grupos dentre os insetos, compreendendo as vespas, abelhas e formigas. O nome é derivado do grego (hymen = membrana; ptera = asas), com as espécies deste grupo apresentando dois pares de asas membranosas, sendo que as asas anteriores são maiores do que as posteriores (RASNITSYN & QUICKE, 2002). As fêmeas possuem um ovipositor típico que permite a perfuração do hospedeiro ou acessar locais inacessíveis, estando muitas vezes modificado em um ferrão. O desenvolvimento é do tipo holometabólico (metamorfose completa), que apresenta os estágios de ovo, larva, pupa e adulto (RASNITSYN & QUICKE, 2002). Entre os himenópteros, a determinação do sexo é feita pelo número de cromossomos que um indivíduo recebe. Os óvulos fertilizados possuem um par de cromossomos, cujos indivíduos irão desenvolver-se em fêmeas diplóides; e os ovos não fertilizados recebem apenas um cromossomo, cujos indivíduos irão desenvolver-se em machos haplóides. Este fenômeno é chamado de partenogênese. Entretanto, o mecanismo de determinação do sexo por meio da partenogênese é muito mais complexo, não envolvendo apenas o número de cromossomos (RASNITSYN & QUICKE, 2002).

31 Os himenópteros são insetos de grande valor econômico, responsáveis pela manutenção do equilíbrio dos chamados insetos pragas. Esta ordem possui várias famílias comportando-se como parasitóides, sendo pouco estudados e pobremente conhecidos nas regiões de clima Neotropical (MARCHIORI, 2003; SHIMBORI et al., 2003). Os Hymenoptera parasitóides são os mais importantes agentes de controle biológico, responsáveis pela maioria dos benefícios econômicos e ambientais produzidos pelos programas de controle biológico, podendo fornecer subsídios para os estudos da biologia e conservação. Como agentes de controle biológico, eles reagem ao tamanho de populações de seus hospedeiros. Sua ação de mortalidade aumenta com o crescimento da população de seus hospedeiros e diminui com o decréscimo da mesma. As duas populações interligadas flutuam entre si, de modo a impedir tanto o aumento abrupto, como a extinção da população do hospedeiro (LA SALLE & GAULD, 1993; SCATOLINI & PENTEADO-DIAS, 1997). Esse grupo tem recebido atenção nos programas de controle de moscas em estábulos (SERENOS & NEVES, 1993 e MARCHIORI, 2002) Família Pteromalidae A família Pteromalidae é considerada uma das maiores famílias de Chalcidoidea, com aproximadamente 3100 espécies, incluindo representantes fitófagos e entomófagos, existindo espécies

32 predadoras e um grande número de espécies parasitóides (GIBSON, 1993;). Eles podem ser solitários ou gregários, ectoparasitóides ou endoparasitóides, coinobiontes ou idiobiontes, parasitóides primários ou secundários e até hiperparasitóides. A maioria é idibionte e muitos se desenvolvem como ectoparasitóides solitários ou gregários em larvas ou pupas de Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera e Siphonaptera (GAULD & BOULTON, 1988 e IORIATTI, 1995). Os predadores são indivíduos que capturam suas presas e as matam para o seu consumo, enquanto os parasitos são indivíduos que consomem o material orgânico de seus hospedeiros, mas essencialmente não são capazes de matá-los. Uma grande quantidade de parasitas pode se alimentar de um único hospedeiro. Já os indivíduos parasitóides são insetos cujas formas imaturas se desenvolvem dentro de um hospedeiro (normalmente um outro inseto), acarretando a morte do mesmo. Uma grande quantidade de parasitóides pode se desenvolver bem em um único hospedeiro (IORIATTI, 1995). Os termos ectoparasitóide e endoparasitóide foram estabelecidos em analogia aos parasitos comuns e são relativos à posição da larva em relação ao seu hospedeiro, ectoparasitóide se ela se desenvolve externamente e endoparasitóide se ela se desenvolve internamente. O parasitóide idiobionte é aquele cuja larva consome o

33 hospedeiro sem permitir que ele se desenvolva após ter sido parasitado. Neste caso, geralmente a fêmea imobiliza o hospedeiro ou realiza a oviposição em um estágio imóvel de desenvolvimento. O parasitóide coinobionte é aquele em que a oviposição ocorre num estágio de desenvolvimento do hospedeiro, mas este continua seu desenvolvimento e a larva somente o mata posteriormente. De uma forma geral, os ectoparasitóides adotam estratégias idiobiontes e os endoparasitóides, coinobiontes, mas esta não é uma regra absoluta (HANSON, 1995). A morfologia do ovo e da larva de primeiro ínstar é bastante variável. De um modo geral, os ovos são elipsóides e apresentam córion esculturado. A larva geralmente é himenopteriforme, mas o último segmento pode ser bilobado e a cabeça e mandíbulas, muito grandes. Larvas de ectoparasitas possuem sistema traqueal aberto, mas em endoparasitas este sistema pode estar fechado ou até mesmo ausente (HANSON, 1995). Algumas espécies de Pteromalidae já foram utilizadas em controle biológico. Este é o caso de Spalangiinae, utilizados no controle de moscas sinantrópicas (GREENE et al., 1998), e de Trichilogaster acaciaelongifoliae (Froggatt, 1892), utilizado no controle de uma planta invasora, Acacia longifólia (Andrews), na África do Sul (DENNIL, 1988). Alguns hiperparasitóides são considerados

34 prejudiciais porque atacam parasitóides de pragas, como os parasitóides e predadores de lagartas e afídeos, como Braconidae e Syrphidae. Apesar dos Pteromalidae serem encontrados em todo o mundo, em termos de revisão, como afirmaram GRISSELL & SCHAUFF (1997), a região neotropical tem sido pouco estudada. BOUCEK (1993) descreveu de uma só vez 31 novos gêneros somente para a América do Norte; um número ainda maior é esperado para a região neotropical. Alguns estudos foram recentemente conduzidos no Brasil (Carvalho et al., 2004 e MARCHIORI., 2004) Biologia de Nasonia vitripennis São insetos de tamanho diminuto variando de 1,0 a 3,0 mm para fêmeas e 0,5 a 2,2 mm para machos. Essa variação é correlacionada com o tamanho do hospedeiro e com o número de parasitóides que nele estão se alimentando. Esta espécie é considerada como ectoparasitóide, pois a fêmea insere seu ovipositor no pupário do hospedeiro, localizando a superfície ectodérmica das pupas (FIGURA 1). Vários ovos são colocados em uma única pupa hospedeira, portanto este parasitóide é gregário. De cada ovo originará apenas um parasitóide adulto. O seu ciclo biológico inclui quatro instares larvais (MERWE, 1943) (QUADRO 1). A duração do desenvolvimento ontogenético varia conforme a temperatura e é acelerada com o aumento

35 Fonte:SIMMONS (2006) FIGURA 1: Fêmea de Nasonia vitripennis ovipositando em pupas de califorídeos.

36 Erro! QUADRO 1: Tempo de desenvolvimento de Nasonia vitripennis a temperatura de 25 C, segundo WERREN (2000). Dia Estágio e características 0 Ovo 1,5 2 Primeiro instar larval (alimentação ativa) 2 3 Segundo instar larval (alimentação ativa) 3 6 Terceiro instar larval (alimentação ativa) Quarto instar larval 6 7 Fim da alimentação, estágio de inativação e defecação 7 8 Estágio pré-pupal, a inatividade continua 8 9 Pupa branca gradativamente torna-se amarela Pupa amarela com a coloração dos olhos se desenvolvendo A cor dos olhos já se desenvolveu,inicia a pigmentação dos olhos e da cabeça A coloração da cabeça e do tórax está completa Corpo completamente pigmentado, os machos começam a eclodir As fêmeas eclodem 14 Emergência das pupas hospedeiras

37 desta. De acordo com WHITING (1967), este microhimenóptero pode ser criado na faixa compreendida entre 15 e 30 C. De acordo com SCHNEIDERMANN & HORWITZ (1958), utilizando pupas de Sarcophaga sp. como hospedeiro, o período embrionário, a 25 C de temperatura, transcorreu em cerca de dois dias. A esta mesma temperatura os espécimes puparam em cerca de cinco dias e o estágio pupal apresentou uma duração de seis dias em média, portanto o desenvolvimento de ovo a adulto ocorre em cerca de 13 a 14 dias a temperatura de 25 C. A determinação sexual de N. vitripennis é do tipo haplodipóide, o que confere às fêmeas parasitóides capacidade para determinar o sexo de sua progênie por meio do controle da fertilização dos ovos, os machos desenvolvem-se de ovos não fertilizados e fêmeas desenvolvem-se de ovos fertilizados (WYLIE, 1976 e KING, 1993). WYLIE (1965) verificou que a presença de outras fêmeas estimulava a produção de um maior percentual de machos na prole. Inclui-se, ainda como fatores indutores do aumento do número de machos na progênie a utilização de hospedeiros previamente parasitados (WYLIE, 1973; WERREN, 1980 e KING, 1993), altas densidades de parasitóides (WYLIE, 1965) e a idade das fêmeas parasitóides, provavelmente devido à exaustão do esperma armazenado na espermateca (VELTHUIS et al., 1965). BARBOSA (2006) verificou que a razão sexual tende a um desvio para o nascimento de fêmeas com o aumento da densidade de hospedeiro e de machos

38 com o aumento da densidade de parasitóides. Por outro lado, a razão sexual de parasitóides microhimenópteros é altamente variável e fortemente influenciada por fatores ambientais, tais como fotoperíodo, temperatura e umidade relativa (VELTHUIS et al., 1965). Na natureza, as vespas, entretanto, evitam alterações climáticas extremas ao selecionarem microhabitats (KING, 1987). Os machos são mais precoces que as fêmeas. Não havendo cópula dentro do pupário, os machos competem pela proximidade do púpario antes da saída das fêmeas, favorecendo o êxito da cópula. As fêmeas recém-emergidas copulam imediatamente com os machos que já estão esperando; em seguida as fêmeas se dispersam a procura dos hospedeiros. Um macho é capaz de inseminar várias fêmeas, enquanto normalmente as fêmeas copulam uma vez. Os machos têm vida curta e não podem voar, pois apresentam asas reduzidas, enquanto nas fêmeas as asas ultrapassam o comprimento do abdome (WHITING, 1967). A utilização de vários hospedeiros como fonte alimentar aumenta a longevidade das fêmeas. O inverso ocorre se forem alimentadas apenas com mel. Elas podem viver cerca de 45 dias (WHITING, 1967; WERREN, 1980). Para KING & HOPKINS (1963), apenas as fêmeas de N. vitripennis alimentam-se dos fluidos dos hospedeiros, além de mel, em colônias mantidas em laboratório. Os machos são inábeis na ingestão deste fluido

39 (hemolinfa) devido à ausência do ovopositor, órgão que auxilia as fêmeas na perfuração dos pupários dos muscóides. São insetos polífagos, pois as fêmeas de N. vitripennis são capazes de parasitoidar uma grande variedade de pupas de dípteros. WHITING (1967) listou em sua revisão 68 espécies, e reportou a possibilidade deste microhimenóptero utilizar outros artrópodes como hospedeiros, incluindo ácaros e, entre eles, os carrapatos. Segundo CARDOSO & MILWARD-DE- AZEVEDO (1996), esta vespa é reconhecida como parasitóide de pupas de dípteros ciclorrafos, principalmente das famílias Calliphoridae e Sarcophagidae (FIGURA 2). No entanto, observações a campo sugerem que este ectoparasitóide é incapaz de penetrar em sítio de pupação a certas profundidades. Desta forma, seus hospedeiros naturais limitam-se a pupas que habitualmente pupariam próximo ou na superfície do seu habitat de criação (LEGNER, 1967). WYLIE (1967) mencionou, também, uma maior facilidade do parasitóide em detectar hospedeiros maiores, em detrimento dos pequenos. WYLIE (1967) observou também que as fêmeas desta espécie atacam, em média, apenas dois hospedeiros, no intervalo de 18 horas, mesmo que um número maior de pupários esteja disponível. Elas são capazes de identificar, através da introdução de seu ovipositor no pupário, pupas previamente parasitoidadas (WHITING, 1967 e WYLIE, 1967).

40 Fonte:GOMES (2000) FIGURA 2: Pupa de Califorídeo parasitoidada por Nasonia vitripennis.

41 WYLIE, em 1965, discutiu as evidências da discriminação, por fêmeas de N. vitripennis, entre pupas parasitoidadas e não parasitoidadas. Segundo ele, as condições físicas e químicas das pupas parasitoidadas são detectadas pelo ovipositor das fêmeas, causando ou não sua retração. Ele sugeriu que o veneno injetado pelas fêmeas, no primeiro ataque as pupas, provoca alterações metabólicas que induzem a rejeição do hospedeiro alvo por outras fêmeas. A ausência de condições favoráveis e necessárias para o crescimento e sobrevivência do inseto pode induzir a diapausa em algumas espécies. Em N. vitripennis, a temperatura, o fotoperíodo, a pressão atmosférica, a Umidade Relativa e o alimento são estímulos que podem iniciar a diapausa em algumas regiões (WYLIE, 1958; SCHNEIDERMANN & HORWITZ, 1958 e WHITING, 1967) Controle de insetos O controle de insetos pode ser feito com métodos físicos, químicos ou biológicos. O controle físico pode ser feito de várias formas como o uso de fogo, drenagem, inundação e temperatura (alta ou baixa) (GALLO et al., 1988). As práticas sanitárias adequadas na pecuária como remoção do lixo, do esterco, de restos de alimento dos animais, mantendo sempre limpo o ambiente de criação são fundamentais para impedir a

42 proliferação de dípteros. A proteção mecânica como o uso de telas nas portas e janelas, mosquiteiros constituem um método físico de proteção individual muito eficaz no controle de doenças. As medidas de modificação ambiental, para eliminar os criadouros de insetos daninhos e evitar a construção de domicílios inadequados que não possuam latrinas ou fossas de modo a impedir o acesso de moscas ao material fecal são medidas que também devem ser adotadas (GALLO et al., 1988). O controle químico permanece como forma mais utilizada na redução da densidade populacional dos dípteros. Como principal método químico têm-se os inseticidas, compostos químicos aplicados direta ou indiretamente sobre os insetos (GALLO, 1988). Segundo BRISOLA-MARCONDES (2001), o controle por meio de inseticidas químicos possui algumas qualidades; já que, inseticidas são eficientes contra uma grande variedade de insetos. O efeito dos inseticidas sobre as populações costuma ser muito rápido, permitindo controlar uma praga em algumas horas ou dias, desde que se atinja uma parte substancial da sua população. Porém estes podem trazer muitos prejuízos ao ambiente contaminando solos, alimentos, atmosfera e recursos hídricos (ANDREA, 2005). Outro problema a ser considerado seria o surgimento de resistência em insetos de importância médica, com o uso continuado do inseticida constituindo uma forte pressão seletiva sobre os

43 insetos, em que exemplares mais aptos a resistir podem produzir descendência, livre da concorrência com os não resistentes. Os inseticidas químicos apresentam várias limitações. O amplo espectro de ação desses produtos químicos, disponíveis faz com que haja efeito nocivo sobre o homem e várias outras espécies. Se esse, demorar a ser degradado, pode haver acúmulo na cadeia alimentar e danos especialmente em certas aves predadoras. O fato de os inseticidas agirem sobre várias espécies pode levar à supressão dos inimigos naturais, causando dependência crescente do seu uso, e fazer com que espécies secundárias se tornem importantes, devido à falta de controle natural (BRISOLA-MARCONDES, 2001). O interesse pelo controle biológico tem crescido em vários países, em resposta aos efeitos adversos dos pesticidas químicos sobre o meio ambiente e sobre a biodiversidade, e bem como em função do novo direcionamento internacional à produção agrícola através da utilização de meios alternativos menos agressivos ao meio ambiente, no sentido de favorecer a conservação e o uso sustentável da biodiversidade (SCATOLINI & PENTEADO-DIAS, 1997). O controle biológico utiliza inimigos naturais de determinada espécie para evitar uma superpopulação desta. Suas técnicas são determinadas após prévio estudo de

44 comportamento, fisiologia e bioquímica dos insetos (NEVES, 2005). Como vantagem, é um método seguro e de fácil manuseio. Esta técnica não deixa resíduos, é mais específica e permanente tendo menor chance de causar desequilíbrio. Como desvantagem, tem ação lenta (GALLO, 1988). Os inimigos naturais são os agentes do controle biológico de insetos praga e este tipo de controle é considerado o componente fundamental do equilíbrio da natureza. Os inimigos naturais são referidos como predadores, parasitos ou parasitóides, e patógenos. No caso específico do controle biológico de insetos praga, os predadores e os parasitos são denominados agentes entomófagos e suas vítimas são, respectivamente chamadas de presas e hospedeiros. Patógeno ou agente entomopatogênico é um microrganismo que vive e se alimenta sobre ou dentro de um inseto hospedeiro (MARICONI et al., 1999). Os inimigos naturais das moscas de interesse humano, são numerosos e de ocorrência cosmopolita. Como predadores distinguem-se os pássaros, os sapos, as rãs, lagartixas e outros vertebrados generalistas e/ou oportunistas. Entre os Arthropoda, as aranhas são notáveis predadores de moscas e entre Insecta encontram-se predadores nas Ordens Coleoptera, Dermaptera, Diptera, Hymenoptera e Hemiptera. Entre os entomopatógenos destacam-se as bactérias, os fungos, os nematóides e os vírus. No entanto, os

45 parasitos, ou parasitóides ocupam um lugar de destaque entre os inimigos naturais das moscas e todos eles pertencem à Ordem Hymenoptera. Os parasitóides são agentes responsáveis pela redução de populações de moscas que proliferam em esterco, cadáveres e carcaças de animais (RUEDA & AXTELL 1985). Além disso, sendo inimigos naturais de pragas agrícolas podem ser usados em programas de controle biológico (SCATOLINI & PENTEADO-DIAS 1997). Esses insetos são considerados bioindicadores da biodiversidade dos ecossistemas, sendo considerados espécies-chave para a manutenção do equilíbrio das comunidades que os incluem (MARCHIORI 2004). Segundo SMITH & RUTZ (1991) a eficiência dos parasitóides está relacionada a habitat específicos, por isso o estudo do comportamento das espécies nativas e os fatores que interferem na sua população são de extrema valia para uso de programa em controle biológico, bem como o conhecimento da ecologia de espécies-praga e seus inimigos naturais. Diversos parasitóides apresentam potencial e vêm sendo testados para o controle de moscas sinatrópicas (MARICONI et al., 1999). O parasitoidismo de pupas de C. megacephala por N. vitripennis vem sendo estudado, em laboratório (MILWARD-DE-AZEVEDO et al., 1996; DELGADO & AGUIAR-COELHO, 2005; BARBOSA, 2006) com o objetivo de subsidiar a implementação de medidas de controle biológico de

46 muscóides de importância econômica, apresentando resultados promissores. O uso de insetos modificados geneticamente, por serem estéreis ou portadores de genes deletérios, pode ser muito útil para controlar as populações naturais, sendo chamado controle autocida (insetos para sua autodestruição). O controle autocida é feito, usualmente, por meio da liberação de grandes quantidades de machos estéreis, que vão competir com os normais. A cada geração, com redução da descendência, os estéreis vão se tornar mais numerosos, em proporção aos normais, até que, teoricamente, seja extinta a população natural. Isto foi realizado com sucesso em Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858) na Flórida, Estados Unidos (BRISOLA-MARCONDES, 2001). Para obter um controle satisfatório destes insetos, um programa de manejo deve integrar métodos culturais, químicos e biológicos. Atualmente o controle integrado é considerado como melhor solução no combate de insetos nocivos, por associar o uso de um inseticida para redução imediata da população nociva e o emprego de um método de controle biológico indicado para aquele ambiente (NEVES, 2005), além do controle sanitário adequado. Muitas das técnicas de controle utilizadas no Brasil foram importadas de outros países e nem sempre são adequadas à nossa realidade (NEVES, 2005).

47 3.3. Chrysomya megacephala Posição Taxonômica Reino Animalia Linnaeus, 1758 Filo Arthropoda Von Siebold & Stannius, 1845 Subfilo Mandibulata Classe Insecta Linnaeus, 1758 Sub-Classe Pterygota Brauer, 1855 (Lang,1889) Ordem Diptera Linnaeus, 1758 Subordem Cyclorrhapha Brauer, 1863 Divisão Schizophora Seção Calyptratae Superfamília Muscoidea Família Calliphoridae Brauer, 1889 Sub-Família Chrysomynae Gênero Chrysomya Robineau-Desvoidy, 1830 Espécie Chrysomya megacephala Fabricius, Ordem Diptera Os Diptera Cyclorrapha constituem um grupo de animais sinantrópicos, por apresentarem capacidade de se adaptar as alterações do meio ambiente produzidas pelo homem (D ALMEIDA et al., 1983). O desenvolvimento dos dípteros é holometabólico, ou seja, contem as fases de ovo, larva, pupa e adulto (GALLO et al., 1988 e NEVES, 2005). As larvas são vermiformes, ápodas e

48 diferenciam-se, em geral, em todos os estágios apenas pelo tamanho. As pupas em geral são imóveis e não se alimentam. Estas atingem as características do adulto no último estágio da metamorfose (BARTH, 1972). Muitas espécies de dípteros muscóides têm interesse médico e veterinário, por serem vetores mecânicos de patógenos e causadores de miíases ao homem e aos animais (GREENBERG, 1971, 1973 e FURLANETO et al., 1984). Esta associação ocorre pelo fato das moscas serem exploradoras de substâncias e resíduos orgânicos, que são produzidos pela atividade humana e animal (MONTEIRO, 1995) Família Calliphoridae Moscas pertencentes à família Calliphoridae são caracterizadas por apresentarem geralmente tamanho médio com coloração azul, violeta, verde ou cobre metálico. Estas moscas possuem um alto grau de sinantropia, podendo veicular doenças para o homem. São conhecidas como moscas-varejeiras pelo hábito de depositar massas brancas de ovos sobre a carne (SILVA, 2001). Na década de 70 espécies de califorídeos do gênero Chrysomya foram introduzidas nas Américas, entre elas Chrysomya megacephala (FIGURA 3). Estas espécies dispersaramse rapidamente pelo continente além de, aparentemente, terem causado um declínio significativo em populações locais de

49 Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775), uma espécie nativa do continente (GUIMARÃES et al., 1978; LAURENCE, 1981 e BAUMGARTNER & GREENBERG, 1984). Este episódio apresenta as características clássicas das invasões biológicas, onde as espécies invasoras dispersam-se rapidamente (BAUMGARTNER & GREENBERG, 1984), além de causarem impacto negativo sobre as populações de espécies locais. C. megacephala também é conhecida como mosca das latrinas pela sua freqüência em dejetos humanos (BARBOSA, 2004) e por essa razão a presença desta espécie em ambientes ocupados pelo homem é responsável pela transmissão de muitas doenças, veiculando microorganismos causadores de enterites graves (GREENBERG, 1973). Sua postura de ovos é agregada, e a fêmea pode colocar de 150 a 300 ovos por postura depositandoos em locais próximos ao de outras fêmeas no mesmo substrato, por estímulo de feromônios (VON ZUBEN et al., 2000). De acordo com QUEIROZ & CARVALHO (1987), esta espécie é classificada como estrategista r. Como boa colonizadora, ela desenvolve-se em matéria orgânica em decomposição, e em vários habitas tais como carcaças e dejetos, fezes de galinhas, depósitos de lixo e aterros sanitários (MILWARD-DE- AZEVEDO et al., 1995) Importância dos Califorídeos

50 Fonte: PEREIRA (2006) FIGURA 3: Vista dorsal de Chrysomya megacephala.

51 Vetores de doenças Dentre os vetores de agentes patógenos, o papel exercido pelos califorídeos é preponderante. A prevalência destes dípteros, em relação a outras espécies de moscas, aumenta os riscos para saúde pública (VALGODE et al., 1998), sendo responsável pela maioria das diarréias infantis e pela vetoração de fungos, ovos de helmintos, cistos de protozoários e enterovírus (FURLANETTO et al., 1984 e QUEIROZ et al., 1999). Podem atuar, também, como veiculadores de polivírus dos tipos I, II, III (GREENBERG, 1971,1973). Em estudos com dípteros califorídeos realizados em Manaus, AM, foram isolados Staphylococcus aureus (Rosenbach, 1884), Escherichia coli (Escherich, 1885), Proteus sp., Providencia sp., Citrobacter sp. e Klebsiella sp., e as espécies Chrysomya megacephala, Chrysomya putoria (Wiedemann, 1818), Chrysomya albiceps (Wiedemann, 1830) e Phaenicia eximia (Widemann, 1819), foram responsáveis como potenciais veiculadores de bactérias enteropatogêncicas para alimentos expostos (PARALUPPI et al., 1996). Chrysomya megacephala foi incriminada na transmissão de Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1909) e junto com Chrysomya putoria participam na veiculação de Entamoeba hystolytica (Shaudin, 1903), Coxsakie virus (Coxsakie, 1948), Salmonella sp., Shigella e ovos de vários

52 tipos de cestódeos (GREENBERG, 1971, 1973 e FURLANETTO et al., 1984). De acordo com trabalho desenvolvido por OLIVEIRA et al., (2002), dentre os califorídeos capturados, C. megacephala foi à espécie que apresentou maior quantidade de ovos de helmintos aderidos à sua superfície e ao seu conteúdo intestinal. Além de helmintos, foram encontrados ovos de Ascaris sp., Toxascaris sp., Toxocara sp., Oxiurídeos, Tricostrongilídeos, Trichuris sp e Capillaria sp., tanto na superfície corporal quanto no conteúdo intestinal. Nessa espécie também foi encontrado ovo de Acantocephala Miíases BRISOLA-MARCONDES (2001) define miíase como uma infestação de vertebrados vivos por larvas de dípteros que, pelo menos em parte do seu ciclo, se alimentam de tecidos vivos ou mortos de animais vertebrados, líquidos corporais ou alimentos ingeridos. De acordo com ZUMPT (1965) estas larvas se alimentam dos tecidos do hospedeiro e de suas substâncias corporais líquidas. Os efeitos patogênicos das larvas desses dípteros estão associados com a liquefação do tecido infestado, através de enzimas proteolíticas liberadas pelo parasito. Os odores exalados pela pele são bem féticos e

53 parecem atrair as fêmeas proporcionando estímulo para estas oviporem (BRITO et al., 2001). Podem ser obrigatórias (miíase primária) quando as larvas se desenvolvem em um hospedeiro vivo; facultativas (miíase secundária) quando presentes em matéria orgânica em decomposição ou em tecidos necrosados de um hospedeiro vivo; ou pseudomiíases quando as larvas são ingeridas e atravessam o tubo digestivo causando alguma avaria (NEVES, 2005) Entomologia Forense Entomologia médico-legal ou forense é a aplicação do estudo de insetos e outros artrópodos associados a um cadáver humano em decomposição, em eventos envolvendo suspeita de crime, com o propósito de fornecer informações úteis para uma posterior investigação (VANLAERHOVEN & ANDERSON, 1999 e VON ZUBEN et al., 2000). Diptera e Coleoptera compreendem 60% do total da fauna de um cadáver e as famílias de dípteros: Calliphoridae, Sarcophagidae e Muscidae são consideradas as mais importantes na decomposição (GREENBERG, 1991), seguido das famílias de coleópteras: Dermestidae, Silphidae e Cleridae (SMITH, 1986). No Velho Mundo, moscas do gênero Calliphora, Lucilia e Chrysomya são consideradas as espécies mais importantes encontradas em cadáveres no Sul da África. Chrysomya albiceps e Chrysomya marginalis (Wiedemann, 1830)

54 têm sido consideradas como espécies determinantes no processo de decomposição de carcaças (SMITH, 1986). O conhecimento das espécies que utilizam carne em decomposição como substrato de criação (ou seja, para alimentação e postura de ovos e larvas), bem como a sucessão de diferentes espécies de insetos no cadáver, são de grande importância na entomologia forense por providenciarem informações cruciais da causa e circunstâncias da morte tais como: intervalo pós-morte (IPM) pelas espécies encontradas e seu estágio de desenvolvimento, identificação da possível presença de drogas em tecidos realizando testes toxicológicos nas larvas, se a morte ocorreu no local em que o corpo foi encontrado ou se o corpo foi movimentado, comparando a fauna local em torno do corpo e a fauna no corpo (SOUZA & LINHARES, 1997 e NEVES, 2005) Terapia larval A bioterapia ou terapia larval é um processo de cura de ferimentos necrosados e infectados utilizando larvas vivas de moscas varejeiras, para o tratamento de feridas de difícil cicatrização, acelerando este processo de cicatrização (TORRES, 2005). As larvas atuam na remoção mecânica de bactérias, aceleram a proliferação de tecido de granulação e atuam na liquefação do tecido necrosado. A aplicação é relativamente

55 simples, sendo um tratamento não dispendioso que promove bons resultados onde algumas vezes as terapias convencionais não foram efetivas (TORRES, 2005). Este método foi usado em populações aborígines na Austrália, América Central e Birmânia, e teve seu auge nas décadas de 1930 e Com o descobrimento dos antibióticos, esse método de limpeza e tratamento de feridas foi abandonado. Entretanto, com o aparecimento de resistência generalizada de bactérias a antibióticos, larvas de Califorídeos têm sido novamente usadas no tratamento de afecções em alguns países (NEVES, 2005). No Brasil, existem espécies que apresentam potencial para serem utilizadas neste procedimento, tendo em vista as características necrobiontófagas de suas larvas Polinização As moscas constituem o segundo grupo de insetos polinizadores mais importante (SILVA & MARTINS, 2003). As moscas utilizam o néctar e o pólen para o seu próprio consumo. As plantas cujas flores são associadas especificamente com moscas são chamadas de miofílicas, podendo ser subdivididas em sapromiofílicas (sapro = podre, miofilia = afins de moscas) quando as flores imitam material em decomposição (SILVA, 2001), e micofílicas quando as flores imitam fungos. A família Calliphoridae está entre as

56 principais famílias visitantes dessas flores, sendo atraída por essas plantas por suas flores apresentarem características semelhantes ao seu substrato de alimentação e oviposição (SILVA & MARTINS, 2003). Estas flores possuem anteras e estigmas expostos e odores perceptíveis (SILVA, 2001) Dieta para Califorídeos A manuntenção de Chrysomya megacephala, em laboratório, apresenta uma limitação: a natureza do substrato para o cultivo das larvas compromete a assepsia e a tolerância do ambiente de criação e áreas circunvizinhas. A dieta natural para criação de larvas é a carne bovina que, no segundo ou terceiro dias de uso, já se encontra putrefata exalando gases ricos em cairomônios que atraem outros artrópodes, saprófagos, comprometendo a higiene local e a saúde dos laboratoristas. Portanto, a descoberta de dietas alternativas que reduzem esta problemática, aliada a redução de custos que favoreçam o desenvolvimento dos insetos, possibilitando a criação de larga escala desses dípteros em laboratório vem sendo investigada (BARBOSA et al., 2004). BOSISIO et al.,(1999) em seus estudos com larvas da 3 a geração de C. megacephala criadas em dieta larval à base de Pedigree Júnior e carne bovina, sob condições controladas, verificaram que a taxa de sobrevivência dos

57 imaturos foi superior a 85% em todos os estágios de desenvolvimento na dieta Pedigree Júnior, revelando-se um potencial para a utilização na manutenção de colônias estoques. Similares resultados foram evidenciados para C. megacephala pertencentes a 3ª geração por MILWARD-DE-AZEVEDO et al., (2000) ao testar dietas comercializadas no Brasil, inferindo que dentre as dietas avaliadas a de Pedigree Júnior foi a que apresentou melhor resultado. BARBOSA et al., (2004) realizaram experimentos sobre a longevidade e capacidade reprodutiva de casais agrupados de C. megacephala, oriundos da 3 a geração, que foram criados em dieta larval à base de Pedigree Júnior e carne bovina. A média da massa total de ovos e a longevidade de adultos não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos Contudo, MESSIAS et al., (2006) demonstraram que a performance de imaturos criados por 26 gerações em laboratório na dieta Pedigree Júnior, foi influenciada negativamente. O peso das larvas maduras de C. megacephala oriundas da dieta Pedigree Júnior foi significativamente inferior quando comparado com o controle, e apenas 10% das larvas inoculadas na dieta de Pedigree Júnior deram origem a adultos, com 81,3% no controle de carne bovina.

58 3.6. Armazenamento de pupas hospedeiras em baixas temperaturas A criação em larga escala de microhimenópteros parasitóides exige o aperfeiçoamento de técnicas que viabilizem a sua produção contínua. A estocagem de alguns insetos hospedeiros em baixas temperaturas, como forma de provisão dietética, tem sido testado com êxito (GULIAS-GOMES et al., 2000). KLUNKER (1982) relatou que a eficiência do parasitoidismo de Muscidifurax raptor (Girault & Sanders, 1910) por pupas de Musca domestica (Linnaeus, 1758), foi mantida após o congelamento das pupas a 21 C, durante 53 semanas. Utilizando temperaturas entre 20 C e 25 C, KUNKLER & FABRITIUS (1992) conseguiram resultados satisfatórios na manutenção de estoques de M. raptor, Muscidifurax zaraptor (Kogan & Legner, 1970) e Urolepis maritima (Walker, 1834). Estas técnicas, além de simplificarem o processo de produção de parasitóides, reduzindo seus custos, criam condições para o desenvolvimento de programas de controle mais extensos (PICKENS & MILLER, 1978). Também há o benefício de inviabilizar o hospedeiro, garantindo a emergência única de parasitóides em liberações a campo (MILWARD-DE-AZEVEDO & CARDOSO, 1998).

59 No entanto, em alguns casos observa-se o comprometimento da taxa reprodutiva do microhimenóptero (MILWARD-DE-AZEVEDO & CARDOSO, 1996). Segundo MILWARD-DE- AZEVEDO et al., (2004), a redução da taxa reprodutiva de fêmeas parasitóides em pupas congeladas pode estar, fundamentalmente, relacionada à indisponibilidade parcial de alimento adequado ao desenvolvimento de seus imaturos, e a oferta qualitativa da dieta deve ser diretamente dependente do grau de conservação da pupa e não existe uma causa isolada relacionada à adequação ainda insatisfatória de uso de pupas muscóides armazenadas em baixas temperaturas como substrato de criação de N. vitripennis, e sim um complexo de fatores interferentes, entre eles podem ser a perda do odor natural e a desidratação das pupas hospedeiras determinadas pelo congelamento.

60 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Local de realização do trabalho O presente estudo foi desenvolvido no período de março de 2005 a maio de 2006, no Laboratório de Estudo de Dípteros (LED), Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO) localizado na Rua Frei Caneca, 94 Centro, Rio de Janeiro, Brasil Estabelecimento da colônia de Chrysomya megacephala Coleta A colônia de Chrysomya megacephala foi estabelecida no laboratório com a finalidade de obter estoque de pupas hospedeiras para os himenópteros parasitóides. A colônia iniciou-se com a captura de aproximadamente 100 indivíduos adultos da Fundação Rio-Zoo,

61 Rio de Janeiro, Brasil, após prévia autorização da Direção da Fundação. As coletas ocorreram no período da manhã, semanalmente durante um mês no ano de 2005, no lixão onde é um local de acúmulo de resíduos de restaurantes, lanchonetes e jaulas de animais. Para captura dos insetos foram utilizadas armadilhas que seguiram os princípios da descrita por MARINHO (2000), presas com fio de nylon a suporte de madeira a 1,5 metros de altura do solo. Utilizou-se como isca carne bovina inserida no interior das armadilhas. Um dia após a exposição, as armadilhas foram recolhidas e levadas para o laboratório Identificação Os insetos adultos coletados a campo foram identificados taxonomicamente segundo MELLO (2003), com o uso de microscópio estereoscópio (Olympus-Tokyo) e sexados através do dimorfismo sexual dos olhos, holópticos nos machos e dicópticos nas fêmeas. Adotou-se a relação sexual 1: Manutenção da colônia Os dípteros foram transferidos para gaiolas de madeira medindo 30 cm de comprimento x 30 cm de largura x 35 cm de altura, revestidas nos lados e no topo com tela de náilon, com madeira no fundo e na frente contendo uma abertura frontal revestida com borracha tampada com recipiente

62 plástico (FIGURA 4). As gaiolas foram revestidas na base com jornais. Os insetos foram alimentados sem interrupções, com água e mel (50%) oferecidos em recipientes plásticos (6 cm de diâmetro), contendo tela de náilon que serviu como substrato de pouso, evitando-se a morte por afogamento. Carne bovina (acém) fresca cortada em cubos de aproximadamente 3 cm 3, mantida em freezer a 18 C e descongelada em geladeira 24 horas da sua utilização, e ração para cães comercialmente denominada de Pedigree Júnior produzida e elaborado por Effem Brasil Inc. & Cia, foram utilizadas como fonte de proteína animal até o 5º dia após a emergência para a maturação dos ovários das fêmeas e posteriormente a partir do 15 dia como substrato para oviposição. Estes mesmos substratos constituíram a dieta para o desenvolvimento das larvas na proporção de uma grama da dieta por larva. Estes substratos foram acondicionados em recipientes plásticos de 10 cm x 7 cm x 6 cm, inseridos em recipientes maiores de 15 cm x 11 cm x 10 cm contendo serragem ou vermiculita como substrato de pupariação e vedados com tecido de náilon (escaline). Este conjunto foi mantido em uma capela de criação de larvas até a pupariação. As pupas foram transferidas para recipientes de vidro de 10 cm x 15 cm e inseridas nas gaiolas de criação até obtenção dos insetos adultos.

63 FIGURA 4: Gaiola de criação da colônia estoque de Chrysomya megacephala.

64 As gaiolas foram identificadas com o nome da espécie, data de estabelecimento da colônia, geração e a dieta utilizada Estabelecimento da colônia de Nasonia vitripennis Coleta A colônia de Nasonia vitripennis iniciou-se com a captura de indivíduos nativos da Fundação Rio-Zoo, Rio de Janeiro, Brasil, após prévia autorização da Direção da Fundação. As coletas ocorreram semanalmente no período da manhã durante um mês no ano de 2005, em pontos localizados próximos do lixão da Fundação Rio-Zoo. As armadilhas utilizadas para captura dos insetos foram potes plásticos de 17 cm de comprimento x 10 cm de largura x 10 cm de altura, com laterais revestidas por tela de náilon, uma abertura frontal fechada com tecido de náilon e alças de barbante. As armadilhas foram presas a 1,5 metros de altura do solo, e continham pupas frescas de C. megacephala com aproximadamente 24 horas de idade, e carne bovina putrefata como fonte de cairomônio, ambos acondicionados em placas de Petri. Um dia após a exposição no campo as armadilhas foram recolhidas e levadas para o laboratório. As pupas de C. megacephala foram transferidas para tubos de ensaio de 1,5 cm x 5 cm vedados com algodão hidrófobo até a emergência dos indivíduos adultos

65 de N. vitripennis. Este procedimento foi repetido até a obtenção de insetos parasitóides Identificação A identificação dos espécimens parasitóides recémemergidos foi realizada por meio da descrição taxonômica detalhada por RUEDA & AXTELL (1985) com o uso de microscópio estereoscópio (Olympus-Tokyo). Os insetos foram sexados através do dimorfismo sexual das asas, reduzidas nos machos, e desenvolvidas nas fêmeas. Adotou-se a relação sexual 1:1. A ratificação da análise foi fornecida pela sistemata Maria Angélica Penteado Dias (Departamento de Ecologia e Biologia Evolutiva, Universidade de São Carlos, São Paulo, SP, Brasil) Manutenção da colônia Os parasitóides adultos foram mantidos no laboratório em gaiolas de vidro transparentes medindo 14,0 cm diâmetro e 19,0 cm de altura, com uma abertura frontal fechada com tecido de náilon (escaline)(figura 5). Os insetos foram alimentados diariamente com água e gotículas de mel aderidas a tiras de papel de filtro acondicionados em copos plásticos pequenos. Pupas congeladas e frescas foram

66 Figura 5: Gaiola de criação da colônia estoque de Nasonia vitripennis.