Influência da técnica de coleta sobre a taxa de recuperação de embriões eqüinos

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1 Influência da técnica de coleta na taxa de recuperação... Influência da técnica de coleta sobre a taxa de recuperação de embriões eqüinos [Effect of embryo collection technique on embryo recovery rate in mares] G.R. Carvalho 1, J.M. Silva Filho 2, F.A. Fonseca 3, J.R.M. Ruas 4, A.M. Borges 5 1 Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa Rua P.H. Rolfs, s/n Viçosa, MG 2 Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais 3 Universidade Estadual do Norte Fluminense 4 Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais - EPAMIG 5 Médico Veterinário, estudante de doutorado da Universidade Federal de Viçosa Recebido para publicação em 7 de novembro de 2000 Recebido para publicação, após modificações, em 9 de agosto de giovanni@mail.ufv.br Projeto financiado pela FAPEMIG RESUMO Foram realizadas 114 coletas de embriões em éguas mestiças das raças Bretã e Campolina, distribuídas ao acaso em dois tratamentos: T1 fluxo interrompido, método tradicional que utiliza filtro de embrião (n=56) e T2 fluxo direto, sem interrupção do fluxo e sem utilização do filtro (n=58). O meio utilizado nas lavagens foi o Ringer lactato. Não houve diferenças entre tratamentos em relação à taxa de recuperação de embriões (58,9 e 44,8%), à qualidade dos embriões (3,56 e 3,53), à taxa de recuperação do meio de coleta (98,1% e 98,1%) e à taxa de gestação (52,9 e 81,8%), respectivamente, para T1 e T2. Observaram-se diferenças entre tratamentos quanto ao tempo de duração da coleta (10,3 e 7,4 minutos) e ao intervalo de tempo da coleta à inovulação (39,5 e 65,7 minutos). Palavras-chave: Eqüino, embrião, sistema de coleta, taxa de recuperação ABSTRACT One hundred and fourteen embryo collections were performed in donor mares of crossbred Breton and Campolina breeds randomly allotted to two treatments: T1 interrupted flushing (n=56), embryo flushing system whereby an embryo filter was inserted in the recovery line, and T2 direct flushing (n=58), without flushing interruption. The flushing medium was the Ringer lactate. No differences between T1 and T2 were observed for the embryo recovery rate (58.9% and 44.8%), for the quality of the embryos (3.56 and 3.53), for the recovery medium from the uterus ( ml, 98.1% and ml, 98.1%) and for the pregnancy rate of the transferred embryo (52.9% and 81.8%). Also, no differences between T1 and T2 for length of collection (10.3 and 7.4 minutes), and for interval from the collection to transference (39.5 and 65.7 minutes) were observed. Keywords: Equine, embryo, collection technique, recovery rate Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p ,

2 Carvalho et al. INTRODUÇÃO As taxas de coleta de embriões têm variado de 40 a 80% (Riera & McDonough, 1993; Squires, 1993; Tischner & Tischner,1996; Fleury, 1998). Segundo Squires et al. (1999), estão em torno de 50% para éguas que apresentam uma única ovulação. Vários fatores podem interferir nas taxas de coleta e de certa forma explicar a grande amplitude de resultados observados. Dentre eles podem-se citar: idade da égua (Squires et al., 1999), fertilidade da doadora (Katila et al., 1989; Squires et al., 1999), dia de coleta (McKinnon & Squires, 1988a), multiplicidade de ovulações (Squires et al., 1987; Rosa et al., 1998), reprodutor (Douglas, 1979; Castleberry et al., 1980; Pashen et al., 1993), sêmen (Squires et al., 1999) e época da estação de monta (McKinnon & Squires, 1988a; Pashen et al., 1993). O útero da égua suporta a introdução de grande quantidade de meio de coleta e o expulsa com relativa facilidade sem a necessidade de manipulação uterina. Essa particularidade do miométrio poderia ser utilizada como instrumento capaz de facilitar a recuperação de embriões durante a lavagem uterina. Entretanto, como se utilizam filtros com pequena capacidade volumétrica durante as coletas, não se pode aproveitar dessa característica em sua plenitude, pois o grande fluxo expelido transbordaria no filtro, levando a perdas embrionárias. O presente experimento teve por objetivo testar o efeito de sistemas de coleta (indireto e direto) sobre a taxa de recuperação de embriões em éguas mestiças das raças Bretã e Campolina MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no setor de eqüideocultura do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, entre de outubro de 1997 e março de Foram utilizadas 41 éguas mestiças paridas e solteiras, com idade entre quatro e 12 anos, e quatro potras de três anos, todas com boa condição corporal. As éguas foram selecionadas pelo histórico reprodutivo e por exames ginecológicos e cobertas por dois garanhões puros, um da raça Bretã e outro da raça Árabe, férteis de acordo com o histórico reprodutivo e os exames andrológicos. As éguas, mantidas a pasto (capim gordura, Melinis minutiflora), receberam suplementação de capimnapier (Penisetum purpureum) e concentrado para suprir as exigências nutricionais diárias segundo Nutrient... (1989). Potras e éguas solteiras foram rufiadas e palpadas pelo reto a cada três dias até o aparecimento do estro ou a presença de um folículo com 25 a 30mm de diâmetro, quando o controle se tornou diário até a ovulação; as éguas paridas foram controladas a partir do quinto dia após o parto até a ovulação (Palhares, 1987). As cobrições ocorreram a cada 48 horas, a partir da detecção de um folículo com 35mm de diâmetro até a ovulação. A sincronização do estro entre doadoras e receptoras foi feita com uma única aplicação de um análogo da prostaglandina F2α. As coletas ocorreram no sétimo ou oitavo dia após a ovulação, dependendo da sincronização com as receptoras, usando-se sonda uterina esterilizada. Dois mil mililitros de solução Ringer lactato de sódio (Alvarenga et al., 1993), divididos em três fluxos de aproximadamente 700ml e pré-aquecidos a 37 o C, foram utilizados para as lavagens uterinas. Após a introdução do meio não se fez manipulação uterina. Caso houvesse alguma dificuldade no retorno do meio, a sonda de coleta era movimentada para frente e para trás, para facilitar a liberação do fluxo, de acordo com (Riera & McDonough, 1993). Após a terceira etapa da coleta, observou-se o útero por meio do ultra-som, e na presença de líquido realizou-se massagem para auxiliar no seu esvaziamento. Foram realizadas 114 coletas, divididas ao acaso em dois tratamentos. No tratamento 1 (fluxo indireto, n=56) utilizou-se método de coleta em que o retorno do meio infundido no útero foi coletado em frascos de 1.000ml, passando antes por um filtro de embrião comercial (Millipore Brasil). O método foi chamado de 2 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p , 2001

3 Influência da técnica de coleta na taxa de recuperação... indireto em virtude de se interromper o fluxo, quando do enchimento do filtro. No tratamento 2 (fluxo direto, n=58), o meio que retornava do útero foi coletado diretamente sem filtrar, em três balões volumétricos de vidro com capacidade de 1.000ml cada, adaptados para o procedimento. Os balões tiveram seus gargalos afunilados até o diâmetro de 10mm para receber uma mangueira de silicone com 10cm de comprimento com dispositivo de controle de saída do líquido. No fundo desses balões fez-se uma abertura circular, por onde era introduzida a mangueira que conduzia o fluxo proveniente do útero. Os três tubos foram colocados com o gargalo para baixo em suporte de madeira que os mantinha estáveis durante a coleta e o período de decantação dos embriões (Fig.1). Após a coleta de embriões do tratamento 1, o conteúdo do filtro foi transferido para uma placa de vidro estéril. No tratamento 2, o suporte de madeira com os balões volumétricos foram mantidos em repouso por 20 minutos (Oguri & Tsutsumi, 1974; Iuliano & Squires, 1985). Após a decantação, liberou-se o fluxo diretamente sobre uma placa de vidro, sendo uma para cada fluxo. O rastreamento dos embriões foi realizado utilizando-se microscópio estereoscópio (Micronal Olympus Brasil.). Para controle do tratamento 2, após o rastreamento todo o conteúdo dos três balões volumétricos foi filtrado. Os embriões foram lavados em solução de Dulbeccos modificada (DPBS) (Whittingam, 1971), com 10% de soro fetal bovino, previamente filtrada em filtro de 20 micras (Millex-Millipore Brasil) (Iuliano et al., 1985). Foram medidos com micrômetro (Micrometer.) adaptado à ocular da lupa, classificados de acordo com escala de 1 a 4 modificada da proposta por McKinnon & Squires (1988b). O embrião excelente (esférico, uniforme no tamanho, na cor e na textura) foi classificado com valor 4; o bom (com menor anormalidade, pouco irregular, com alguns blastômeros deslocados e pouca separação do trofoblasto), valor 3; o regular (várias anormalidades, não muito severas, com vários blastômeros deslocados e células degeneradas), valor 2; e o ruim (embrião degenerado, blastocele colapsada, numerosos blastômeros deslocados e de forma bastante irregular), valor 1. Para as transferências foram utilizadas palhetas francesas (IMV France) de 0,25ml para embriões com até 1.500µm, e de 0,50ml, para embriões maiores. As palhetas de 0,25ml foram montadas no aplicador de embriões 5 e as de 0,50ml, no aplicador universal de sêmen 5. Ambas foram envolvidas por camisa sanitária 5. A receptora escolhida foi selecionada por apresentar no momento sincronia mais estreita com a doadora (entre 0 e 2 dias) e melhores condições uterina e de corpo lúteo, observadas pela palpação retal e pela ultra-sonografia. Após a introdução do aplicador na cérvice rompia-se a camisa protetora (Squires Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p ,

4 Carvalho et al. et al., 1982; Meira & Henry, 1991), e em seguida depositava-se o embrião no útero. Vinte e oito embriões foram transferidos, 17 provenientes do tratamento 1 e 11 do tratamento 2. Os dados referentes à presença de embriões nos fluxos, de fertilidade dos embriões transferidos e os dados dos garanhões (taxas de recuperação de embriões das éguas cobertas, coletas por fluxo e embriões por fluxo) foram avaliados pelo teste do qui-quadrado. Para os dados quantitativos (duração da coleta, recuperação de meio, dia da coleta, qualidade do embrião, intervalo entre a coleta e a inovulação, intervalo do início do estro à ovulação e número de cobrições por ciclo) usou-se a análise de variância utilizando-se o programa SAEG 7.0 (Universidade..., 1997). RESULTADOS E DISCUSSÃO A maioria dos trabalhos que envolve transferência de embriões em eqüinos utiliza a inseminação artificial. Neste experimento utilizou-se a monta natural. Nas primeiras transferências de embriões em eqüinos Oguri & Tsutsumi (1972; 1974) utilizaram um garanhão fértil. Tendo em vista a influência do garanhão sobre a taxa de recuperação de embriões (Douglas, 1979; Castleberry et al., 1980; Pashen et al., 1993), foi adotada a metodologia proposta por Valle (1997), na qual são analisadas as características de controle e as características de resultados. As características de controle informam sobre a homogeneidade dos dados entre os garanhões, e não se constituem resultados de determinado tratamento. Estes dados procuram mostrar a não interferência dos garanhões nos resultados dos tratamentos (análise independente dos tratamentos). As características de controle avaliadas para os garanhões foram intervalo do início do estro à ovulação das éguas cobertas, número de cobrições por ciclo e dia da coleta (Tab.1). Outros dados dos garanhões foram coletados (Tab. 1) procurando analisar possíveis interferências nos resultados dos tratamentos (fluxo indireto ou direto). Não foram verificadas diferenças (P>0,05) entre os reprodutores em todas as características avaliadas. Estes resultados mostram a ausência de efeito de garanhão sobre os resultados obtidos nos dois tratamentos. Tabela 1. Características de controle avaliadas de acordo com a utilização do garanhão em éguas doadoras de embriões Característica Garanhão 1 Garanhão 2 Número coletas em éguas cobertas/ Número de embriões 58/31 54/26 Taxa de recuperação de embriões (%) 53,4 48,2 Qualidade do embrião na coleta 1 3,84 ± 0,4 3,54 ± 0,8 Intervalo do início do estro à ovulação (dias) 6,47 ± 1,9 6,02 ± 2,0 Número de cobrições por ciclo 1,84 ± 0,8 1,90 ± 0,8 Dia da coleta (idade do embrião) 7,75 ± 0,4 7,85 ± 0,4 Coletas no fluxo indireto (%) 31 (53,5) 24 (44,4) Coletas no fluxo direto (%) 27 (46,5) 30 (55,6) Embriões por fluxo indireto (%) 18/31 (58,0) 14/24 (58,3) Embriões por fluxo direto (%) 13/27 (48,2) 12/30(40,0) 1 4 = excelente, 3 = bom, 2 = regular, 1 = degenerado O número de embriões recuperados por tratamento (Tab. 2) foi de 33/56 (58,9%) para o tratamento com fluxo indireto, e de 26/58 (44,8%), para o com fluxo direto (P>0,05). Os resultados mostraram que a hipótese de um fluxo livre não melhorou a taxa de recuperação de embriões, e talvez o aumento no tempo de coleta, ou a redução na velocidade de saída do meio, seja útil na suspensão do embrião no útero, facilitando sua recuperação. 4 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p , 2001

5 Influência da técnica de coleta na taxa de recuperação... Tabela 2. Resultados obtidos da coleta de embriões nos tratamentos de fluxo indireto (T1) e fluxo direto (T2) em éguas doadoras Característica T1 T2 Número de coletas/ Número de embriões 56/33 58/26 Taxa de recuperação de embriões (%) 58,9 44,8 Duração da coleta (min) 10,30± 1,8A 7,40 ± 2,3B Recuperação do meio (ml) 1962,1± 75,4 1962,4 ± 50,6 Dia da coleta 7,8 ± 0,4 7,8 ± 0,4 Qualidade do embrião 1 3,6 ± 0,7 3,5 ± 0,8 Tamanho do embrião (mm) 1,2 ± 0,5 1,0 ± 0,3 Intervalo da coleta à inovulação (min) 39,5 ± 12,3A 65,7 ± 15,0B Taxa de gestação (%) 9/17 (52,9) 9/11 (81,8) Valores seguidos por letras diferentes na linha diferem pelo teste F (P<0,01). 4 = excelente, 3 = bom, 2 = regular, 1 = degenerado O tempo de 20 minutos utilizado para decantar os embriões no tratamento 2 foi o mesmo utilizado por Oguri & Tsutsumi (1974) e Iuliano & Squires (1985), suficiente para que os embriões nessa idade (7,79 dias) decantassem. Müller & Cikryt (1988), ao estudarem o tempo de decantação e idade dos embriões, verificaram que quanto mais novos, maior o tempo gasto na decantação. Observaram, ainda, que seis de oito embriões com 192 horas (oito dias) ou mais de vida decantaram em cinco minutos de repouso, e com 10 minutos, todos já estavam sedimentados. O tratamento 2 permitiu a identificação do aparecimento do embrião por fluxo. De 24 embriões coletados, seis apareceram no primeiro fluxo, seis no segundo fluxo e 12 no terceiro fluxo. A maior freqüência observada no terceiro fluxo não tem correspondência com outros trabalhos, que apontaram maior freqüência de embriões no primeiro fluxo (Imel et al., 1981; Meira & Henry, 1991; Allen, 1994). Possivelmente a maior freqüência de embriões no terceiro fluxo seja atribuída ao reduzido tempo gasto em cada lavagem parcial, não proporcionando tempo ideal de suspensão dos embriões no meio durante as primeiras coletas. As durações das coletas para os tratamentos 1 e 2 foram de 10,3 e 7,4 minutos (P<0,01), respectivamente. Na literatura consultada poucos são os relatos sobre a duração da coleta, o que torna difícil a inferência acerca da influência do tempo de coleta sobre a taxa de recuperação de embriões. No trabalho de Oguri & Tsutsumi (1974), o tempo necessário para a coleta variou de 10 a 40 minutos, com média de 18 minutos. Hinrichs (1990) não mencionou o tempo total utilizado na coleta, embora mantivesse o útero repleto com o meio de coleta por três minutos, antes de esvaziá-lo. Segundo Allen (1994), a utilização do fluxo direto ou método aberto não tem sido usado na rotina, havendo preferência pelo fluxo indireto (Squires, 1993; Huhtinen et al., 1997; Fleury, 1998; East et al., 1999). Riera & McDonough (1993), ao compararem o fluxo direto sem manipulação do útero com o fluxo indireto envolvendo a manipulação do corpo e cornos uterinos, observaram diferenças significativas entre os tratamentos quanto às taxas de recuperação de embriões, cujos valores foram 53 e 80%, respectivamente. Vários trabalhos utilizaram a manipulação uterina durante a coleta (Douglas, 1979; Allen, 1994; Fleury, 1998), enquanto outros não a utilizaram (Savage & Woodcock, 1989; Hinrichs, 1990; Ball et al., 1992). Os trabalhos de Riera & McDonough (1993) e Alvarenga et al. (1993) compararam a manipulação ou não do útero. Os resultados encontrados nos dois trabalhos foram diferentes, isto é, no primeiro a manipulação uterina melhorou as taxas de recuperação de embriões, enquanto que no segundo os melhores resultados foram obtidos quando não se manipulou o útero. No presente trabalho não houve manipulação uterina durante as coletas. O volume de líquido recuperado por tratamento (P>0,05) correspondeu a aproximadamente 98% do volume infundido no útero. Dessa forma, observou-se que a interrupção do fluxo durante as coletas no tratamento de fluxo indireto não comprometeu a capacidade uterina quanto à expulsão do meio infundido no útero. Observou-se também que o volume de meio recuperado não interferiu nos índices de embriões Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p ,

6 Carvalho et al. coletados, ou seja, o aparecimento ou não do embrião não foi atribuído à retenção do meio no útero. Taxas semelhantes de recuperação de meio foram observadas por outros pesquisadores, sempre acima de 90% (Oguri & Tsutsumi, 1972; Douglas, 1979; Imel et al., 1981; Savage & Woodcock, 1989). Quanto ao dia de coleta, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos. Na maioria das vezes ocorreu no oitavo dia após a ovulação. Coletas no sétimo e oitavo dia são as eleitas por apresentarem as melhores taxas de recuperação e viabilidade de embriões (Castleberry et al., 1980; Iuliano & Squires, 1985; McKinnon & Squires, 1988a; Squires et al., 1999). A qualidade do embrião não foi influenciada pelo método de coleta (P>0,05). A velocidade de saída do fluxo no segundo tratamento foi maior do que no primeiro, em função da ausência de limitações do fluxo. Apesar disso não houve danos macroscópicos, avaliados pela qualidade do embrião, e nem interferência com a fertilidade dos embriões transferidos (Tab. 2), que foi de 81,8% (nove gestações em 11 transferências). A utilização do Ringer lactato como meio de lavagem mostrou-se eficiente. Tendo como referência as taxas de gestação, não se observou comprometimento dos embriões, mesmo nos de fluxo direto, os quais permaneceram em repouso por 20 minutos durante a decantação. Alvarenga et al. (1993) sugeriram a adoção desse meio e obtiveram taxa de gestação de 64% (14/22). Em programa comercial de transferências de embriões eqüinos, Fleury (1998) também o utilizou para a coleta de número expressivo de embriões. Além de não afetar o embrião, as vantagens da utilização do Ringer lactato, em substituição ao DPBS, incluem custo reduzido e a não necessidade de mantê-lo resfriado. O intervalo de tempo médio da coleta à inovulação do fluxo indireto, 39,5 minutos é menor do que o do fluxo direto, 65,7 minutos (P<0,01). Apesar de o tempo de coleta do fluxo direto ter sido menor, a espera de 20 minutos durante a decantação do embrião aumentou o intervalo de tempo da coleta à transferência. Agrupando-se os dois tratamentos a taxa de recuperação de embriões foi de 51,8% (59/114), próxima às observadas em outros trabalhos que utilizaram grande número de coletas. Fleury (1998), ao trabalhar com 215 e 669 lavagens uterinas, no sétimo e oitavo dias após a ovulação, obteve taxas de recuperação de embriões de 49,3 e 58,0%, respectivamente. Em outro trabalho, Fleury et al. (1989) obtiveram taxa de 52,3% em 172 coletas. Utilizando fluxo direto sem manipulação uterina, Riera & McDonough (1993) obtiveram taxa de recuperação de 53% (44/83). Pashen et al. (1993) obtiveram 479 embriões (66%) em 727 tentativas, encontrando mais de um embrião em 18% das coletas. A ocorrência de dupla ovulação aumenta a probabilidade de aparecimento de embrião em relação a ovulações únicas. Trabalhos de superovulação têm resultado em aumento no número de embriões coletados, embora a relação número de embriões e número de ovulações seja semelhante à observada quando há ovulação única (Dippert et al., 1992; ROSA et al., 1998). Neste trabalho apenas em um momento foram coletados dois embriões. Nos trabalhos de Imel et al. (1981) e Iuliano et al. (1985) observaram-se altas taxas de recuperação de embriões, respectivamente, 72% (75/104) e 78% (118/151). Entretanto, os autores não citaram a freqüência de coletas com mais de um embrião. Battut et al. (1998) e Ball et al. (1992), trabalhando com 40 e 26 coletas, respectivamente, obtiveram taxa de recuperação de embriões de aproximadamente 53%. Índice menor de sucesso nas coletas foi encontrado por Sertich et al. (1988), que realizaram 46 lavados e obtiveram 20 embriões (43%). Squires et al. (1999) comentaram que a taxa de recuperação de embriões de éguas com ovulação única é em torno de 50%. A não-manipulação não interferiu nas taxas de recuperação de embriões neste estudo. Possivelmente a adoção desse método seja interessante por reduzir a contaminação do ambiente de coleta e o estresse de manipulação da doadora. Na Tab.3 são apresentados os dados de 23 coletas realizadas no sétimo dia e 90 no oitavo dia após a ovulação. As taxas de recuperação de embriões foram de 30,4 e 57,8% (P<0,05), indicando melhor recuperação no oitavo dia. Alguns trabalhos mostraram taxas de coleta semelhantes nos dias 7 e 8 (Oguri & Tsutsumi, 1972; Iuliano et al., 1985; McKinnon & Squires, 1988a; Meira & Henry, 1991). Melhores 6 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p , 2001

7 Influência da técnica de coleta na taxa de recuperação... taxas de coletas no oitavo dia foram encontradas por Fleury (1998) e Fleury et al. (1989). Os diâmetros dos embriões no sétimo e oitavo dia também diferiram (P<0,01). Resultados semelhantes nos mesmos tempos foram citados em vários trabalhos (Imel et al.,1981; Iuliano et al., 1985; McKinnon & Squires, 1988a). Isso mostra que em éguas mestiças das raças Bretã e Campolina o desenvolvimento embrionário é semelhante ao de outras raças. A capacidade uterina de expulsar o meio de lavagem foi semelhante no sétimo e no oitavo dias. Tabela 3. Eficiência de coletas de embriões realizadas no sétimo e oitavo dias após a ovulação Embriões/coleta(%) Duração coleta (min) Diâmetro embrião (mm) Recuperação do meio (ml) Coleta no 7º dia 7/23 (30,4) A 8,6 0,50 a 1963,04 Coleta no 8º dia 52/90 (57,8) B 8,8 1,17 b 1963,02 Valores seguidos por letras maiúsculas (P< 0,05) ou minúsculas (P<0,01) diferentes na coluna diferem pelo teste do qui-quadrado CONCLUSÕES A utilização do fluxo direto não apresenta vantagens em relação ao fluxo indireto que justifique sua adoção, apesar da pequena redução do custo de transferência. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALLEN, W.R. Equine embryo transfer: A brief update on techniques and progress. In: Equine Practitioners Group Congress, Proceedings... p , ALVARENGA, M.A., LANDIM, F.C., MEIRA, C. Modifications in the technique used to recover equine embryos. Equine Vet. J., v.15, p , (Suppl.) BALL, B.A., MILLER, P.G., DAELS, P.F. Influence of exogenous progesterone on early embryonic development in the mare. Theriogenology, v.38, p , BATTUT, I., COLCHEN, S., FIENI, F. et al. Success rates when attempting to nonsurgically collect equine embryos at 144, 156 or 168 hours after ovulation. Equine Vet. J., v.25, p (Suppl). CASTLEBERRY, R.S., SCHNEIDER Jr., H.J., GRIFFIN, J.L. Recovery and transfer of equine embryos. Theriogenology, v.13, p.90, DIPPERT, K.D., HOFFERER, S., PALMER, E. et al. Initiation of super ovulation in mares 5 or 12 days after ovulation using equine pituitary extract with or without GnRH analogue. Theriogenology, v.38, p , DOUGLAS, R.H. Review of induction of superovulation and embryo transfer in the equine. Theriogenology, v.11, p.33-40, EAST, L.M., VAN SAUN, R.J., VANDERWALL, D.K. Embryo recovery and transfer techniques. Equine Pract., v.21, p.8-12, FLEURY, J.J. O dia da colheita na taxa de recuperação de embriões em eqüinos em uma central de transferência de embriões comercial. Arq. Fac. Vet. UFRGS, v.26, p.268, FLEURY, J.J., COSTA NETO, J.B.F., ALVARENGA, M.A. Results from an embryo transfer program with Mangalarga mares in Brazil. Equine Vet. J., v.8, p (Suppl). HINRICHS, K. A simple technique that may improve the rate of embryo recovery on uterine flushing in mares. Theriogenology, v.33, p , HUHTINEN, M., PEIPPO, J., BREDBACKA, P. Successful transfer of biopsied equine embryos. Theriogenology, v.48, p , IMEL, K.J., SQUIRES, E.L., ELSDEN, R.P. et al. Collection and transfer of equine embryos. J. Am. Vet. Med. Assoc., v.179, p , IULIANO, M.F., SQUIRES, E.L. Embryo transfer in two-year-old donor mares. Theriogenology, v.24, p , IULIANO, M.F., SQUIRES, E.L., COOK, V.M. Effect of age of equine embryos and method of transfer on pregnancy rate. J. Anim. Sci., v.60, p , KATILIA, T, OIJALA, M., KOTILAINEN, T. et al. Embryo transfer in subfertile mares. Acta Vet. Scand., v.30, p , McKINNON, A.O, SQUIRES, E.L. Equine embryo transfer. Vet. Clin. North Am., v.4, p , 1988a. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p ,

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