TREINAMENTO: USO E MANUTENÇÃO DE MICROPIPETAS IRENE GOLDSTEIN JUNHO/2017

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1 TREINAMENTO: USO E MANUTENÇÃO DE MICROPIPETAS IRENE GOLDSTEIN JUNHO/2017

2 PIPETAS PIPETA é um instrumento volumétrico usado para a transferência de certos volumes, de modo preciso, sob determinadas temperaturas 1. O cienlsta francês Louis Pasteur desenvolveu uma variedade de pipetas por volta de 1860, algumas das quais são ullizadas até hoje. As pipetas automálcas foram inventadas na década de 1940 por George Riggs. O invento pretendia ser uma alternalva às pipetas graduadas de vidro, ullizadas pelos inspetores de leite para recolher amostras visando avaliar a presença de bactérias. A pipeta automálca facilitaria o trabalho e preveniria a contaminação dos inspetores, pois dispensava a sucção do líquido com a boca. 1 - BACCAN, N; ANDRADE, J.C; GODINHO, O.E.S. Química Analí,ca Quan,ta,va Elementar. 3. ed. São Paulo: Edgard Blücher, 2001.

3 TIPOS DE PIPETAS Principais Lpos de pipetas: Manuais: volumétrica, graduada, de Pasteur. AutomáLcas: chamadas de micropipetas, maior precisão, menor risco de contaminações por possuírem ponteiras descatáveis. Podem ter um canal (monocanal) ou mais canais (mullcanal). Podem ser de volume fixo ou variável. Uso com pequenos volumes, variando, por exemplo, de 0,1 µl até 1000 µl ou até vários ml. Modelos disponíveis: deslocamento de ar e deslocamento posilvo.

4 Pipetas manuais

5 Micropipetas

6 Vantagens da Micropipeta Leveza Ergonomia (evitar LER Lesão por esforço repellvo) Facilidade na visualização e ajuste do volume Precisão Facilidade na limpeza, evitando contaminantes ProduLvidade

7 Modelos de Micropipetas (I) Pipetas de deslocamento posilvo: Funcionamento: as ponteiras contêm um pistão descartável que regula a subida do líquido, similar a uma seringa. Aplicáveis a líquidos muito voláteis (clorofórmio), muito viscosos (mel, detergente, glicerol) ou muito densos (mercúrio), amostras de DNA/RNA, biológicas, radialvas ou corrosivas.

8 Pipetas de Deslocamento PosiLvo 1) Ajuste do volume 2) Preparo para aspiração 3) Aspiração 4) Dispensa

9 Pipetas de Deslocamento PosiLvo Vantagens Contato direto entre o pistão e a amostra - não há volume morto, facilita amostras densas e voláteis. Volume aspirado completamente - a vedação do pistão previne contaminações do usuário. Durante a dispensa do líquido o pistão limpa as paredes do capilar, aumentando a precisão. O pistão e capilar são ejetados e trocados, depois de cada amostra.

10 Modelos de Micropipetas (II) Pipetas de deslocamento de ar: São as pipetas clássicas de laboratório. Funcionamento: o pistão expulsa o ar da câmara e após mergulhar a ponteira no líquido, o pistão sobe, impondo uma pressão negalva que faz o líquido subir na ponteira. O pistão fica separado do líquido por uma camada de ar, por isso o nome desse Lpo de pipeta. Aplicáveis à maioria dos líquidos e soluções aquosas.

11 Técnicas de Pipetagem (I) Direta: Quando a segunda parada é ullizada na etapa de distribuição do líquido. É a mais ullizada. Indicada para a maioria dos líquidos. Não indicada para líquidos voláteis por aumentar a pressão interna e fazer gotejar. Não indicada para materiais viscosos pois o escoamento é mais lento e ocorre adesão à parede interna da ponteira aumentando a perda.

12 Técnicas de Pipetagem (II) Reversa: Quando a segunda parada é ullizada na etapa de aspiração. Indicada para a pipetagem de pequenos volumes ou para pipetagem de líquidos voláteis, líquidos com tendência a formar espuma ou ainda que possuam alta viscosidade.

13 Pipetagem no Modo Direto Etapas: 1. Ajuste do volume 2. Encaixe da ponteira 3. Pré- lavagem da ponteira 4. Pressão e posicionamento do botão no primeiro estágio 5. Aspiração com a liberação gradual do botão 6. Dispensa, pressionando o botão até o segundo estágio 7. Descarte da ponteira

14 Pipetagem no modo direto

15 Pipetagem no Modo Reverso Etapas: 1. Ajuste do volume 2. Encaixe da ponteira 3. Pré- lavagem da ponteira 4. Preparo para aspiração 5. Aspiração 6. Dispensa 7. Re- aspiração (se necessário) 8. Descarte do líquido residual 9. Descarte da ponteira

16 Pipetagem no Modo Reverso

17 Pipetagem no Modo Reverso O volume adicional compensa as perdas de volume que poderão ocorrer por gotejamento, evaporação e aderência à parede da ponteira, devido à viscosidade. Contudo, deve ser descartado no final da pipetagem, pois não faz parte do volume requerido. Antes de pipetar líquidos voláteis, aspire e dispense várias vezes esse líquido. Isso produzirá vapor suficiente para saturar a atmosfera interna do sistema de pipetagem diminuindo a taxa de evaporação e consequentemente o aumento de pressão e, principalmente, o gotejamento. O volume total (volume selecionado + volume da segunda parada) não pode exceder a capacidade máxima da ponteira, considere sempre 80% da capacidade. Apenas pipetas de deslocamento de ar podem ser ullizadas.

18 Pipetagem no Modo Reverso

19 Etapas Detalhadas Pipetagem Modo Direto 1. Ajuste do volume 2. Encaixe da ponteira 3. Pré- lavagem da ponteira 4. Pressão e posicionamento do botão no primeiro estágio 5. Imersão da ponteira logo abaixo da superucie do líquido com a micropipeta na posição verlcal 6. Aspiração com a liberação gradual do botão 7. Pausa de 2 segundos e remoção da micropipeta 8. Inserção da micropipeta no frasco receptor, em ângulo e com a ponteira encostada na parede 9. Dispensa, com a pressão do botão até o segundo estágio 10. Aguardo de 2 segundos e remoção da micropipeta 11. Liberação do botão 12. Ejeção e descarte da ponteira

20 Dicas para melhor performance na pipetagem

21 Dicas para melhor performance na pipetagem Para melhorar a reprodulbilidade: finalize o ajuste de volume sempre no senldo horário. Baixando a numeração: gire vagarosamente até obter o volume desejado. NÃO ultrapasse a posição desejada. Aumentando a numeração: rotacione 1/3 de volta acima do volume desejado e retorne vagarosamente à posição correta.

22 Dicas para melhor performance na pipetagem Para melhorar a precisão: realizar a pré- lavagem (condicionamento) da ponteira, pelo menos duas vezes, com o líquido a ser ullizado. Esta é necessária sempre que trocar a ponteira, ou ajustar para um volume maior. Razões: Para saturar a atmosfera interna do sistema de pipetagem Para condicionar a parte interna da ponteira e assim evitar deixar uma camada de líquido na ponta da ponteira (tornando o volume expelido menor que o valor alvo).

23 Dicas para Melhor Performance na Pipetagem Pressione o botão de modo lento e constante. Enquanto aspira, mantenha a ponteira a uma profundidade constante logo abaixo da superucie do líquido. Aguarde um pouco para o líquido subir. Se muito abaixo da superucie, mais líquido será aspirado por causa da capilaridade.

24 Dicas Para Pipetar Corretamente Para aspirar mantenha a pipeta o mais verlcal possível. Um ângulo superior faz com que uma quanldade maior de líquido seja aspirado. PraLque um ritmo constante de pipetagem entre uma amostra e outra. O treinamento é primordial para obtenção de melhor precisão. Dispense até a úllma gota. Recomenda- se, em grande parte das aplicações, dispensar com a micropipeta em ângulo e com a extremidade da ponteira contra a parede do recipiente, pois isso reduz ou elimina a quanldade remanescente de amostra na ponteira técnica na qual pode aumentar a precisão em 1% ou mais.

25 Dicas Para Pipetar Corretamente Padronize a pipetagem: Aperte o botão até o primeiro estágio, mergulhe a ponteira no líquido e aspire- o, soltando o botão. Remova a pipeta do líquido e aperte o botão até o segundo estágio, garanlndo a dispensação total do conteúdo. Padronizar resulta em precisão e exaldão melhores. Guarde a micropipeta enquanto não a eslver ullizando. O calor do corpo humano transferido durante a pipetagem altera o equilíbrio de temperatura, podendo levar a variações de volume. Uma má combinação de ponteira e pipeta pode ocasionar resultados imprecisos, inexaldão ou ambos. Use ponteiras de boa qualidade e de preferência da mesma marca da micropipeta. Somente ullize marcas alternalvas se comprovada sua compalbilidade com o modelo de micropipeta em questão.

26 Dicas Para Pipetar Corretamente Troque a ponteira antes de aspirar líquido, amostra ou reagente diferente. Pressione e solte o botão de modo lento e constante. NUNCA pipete líquidos onde T > 70 C ou T < 4 C. NUNCA vire a pipeta de cabeça para baixo. NUNCA deite a pipeta enquanto houver líquido na ponteira. Quando não eslver em uso, mantenha a pipeta na posição verlcal para evitar que ela entre em contato com superucies contaminadas. NÃO ullize graxa ou silicone no pistão ou selos, exceto quando indicado no manual de operação / manutenção da micropipeta. NUNCA tente ajustar o volume acima da especificação.

27 How to Pipe{e correctly - h{ps:// v=qgx490kukjg

28 Fontes de erro da pipetagem

29 Problemas

30 Problemas

31 Pipe ng - h{ps:// v=ngoswmrjjao

32 Manutenção externa Remova o ejetor de ponteiras; Limpe o ejetor de ponteiras com um pano embebido em solução de detergente; Limpe a parte externa da pipeta; Passe um pano embebido com água desllada para enxaguar o ejetor de ponteiras e o corpo da pipeta; Recoloque. Frequência: quando necessário. Não trabalhe com material sujo pois pode ocorrer contaminação.

33 Manutenção interna (Descrição Gilson e Esquema - Eppendorf) Só pode ser realizada com a autorização do responsável pelo laboratório; Desmontar a pipeta; Deixar o corpo da pipeta em um local seco; Limpar as peças da parte inferior ullizando um banho de ultrassom com água e detergente por 20 min; Enxaguar as peças com bastante água corrente, o úllmo enxágue deve ser feito com bastante água desllada; Deixar secar em temperatura ambiente; Montar a pipeta, para um novo uso. Frequência: quando pipetar solução corrosiva ou contaminante, quando notar que o botão de controle não está suave, quando ponteira eslver pingando.

34 Pipe{e disassembling and cleaning - h{ps:// v=21co53uukv8

35 Procedimentos do LAQA IT- LAQA Operação das Micropipetas. IT- LAQA Verificação de Micropipetas AutomáLcas,Tipos Volumes Fixos ou Reguláveis. FM- LAQA Formulário de registro dos dados da verificação da calibração

36 IT- LAQA Operação das Micropipetas ObjeLvo: orientar o usuário no uso das micropipetas. Campo de Aplicação Definições e abreviaturas Documentos de Referência Procedimento: Operação da micropipeta Limpeza externa Limpeza interna

37 Calibração e Verificação das Micropipetas Calibração é realizada por laboratório da RBC (exigência da ISO/IEC Realizado por laboratório da Rede Brasileira de Calibração reconhecida pelo Inmetro) - Incerteza Verificação da calibração: realizada pelo laboratório como controle do bom funcionamento do equipamento, Realizado preferencialmente anualmente, principalmente antes da elaboração de uma curva de calibração. ExaLdão e precisão

38 ExaLdão e Precisão

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40 IT- LAQA Verificação de Micropipetas AutomáLcas,Tipos Volumes Fixos ou Reguláveis ObjeLvo: Descrever o procedimento de verificação da calibração de micropipetas para determinar se atende aos requisitos especificados pelo laboratório. Procedimento: Calcular o valor da massa média de água obldo dessa verificação da calibração e em seguida, o volume correspondente a essa massa, através da fórmula abaixo: onde: v = m/d d = densidade da água na temperatura de verificação da calibração (Ver tabela) m = massa média de água (em g) v = volume calculado (em ml) Preenchimento da FM- LAQA Registro de Verificação de Micropipetas

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42 Tabela de densidade da água em relação à temperatura

43 Volume a ser pipetado, conforme capacidade da micropipeta de volume variável a ser verificada

44 Verificação da Calibração das Micropipetas Tolerâncias em relação à exaldão e precisão das micropipetas podem ser encontradas na ISO :2002(E) Piston- operated volumetric apparatus Part 2: piston pipe{es.

45 Tabela de Tolerância da ISO :2002(E) Piston Pipe{es

46 Como localizar os procedimentos do LAQA na Intranet

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54 Bibliografia Além da bibliografia referenciada no texto, seguem as demais referências consultadas: h{p: //www. analilcaweb. com. br/pipetas h{p:// importancia- da- pipetagem- nos- processos- analilcos Manual de operação das micropipetas da Gilson: Gilson guide to pipe.ng, 2ª ed., 1998 ISO :2002(E) Piston- operated volumetric apparatus Part 2: piston pipe{es

55 OBRIGADA IRENE GOLDSTEIN 22/06/2017 E 27/06/2017