Protocolo para análise de clorofila a e feopigmentos pelo método fluorimétrico (Fluorímetro TD-700).

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1 Programa Brasileiro de Intercâmbio em Maricultura Brazilian Mariculture Linkage Program BMLP Programa de Monitoramento Ambiental Environmental Monitoring Program Protocolo para análise de clorofila a e feopigmentos pelo método fluorimétrico (Fluorímetro TD-700). Gilberto Fonseca Barroso Professor Assistente Universidade Federal do Espírito Santo Departamento de Ecologia e Recursos Naturais fonseca@npd.ufes.br Jack Littlepage Associate Professor University of Victoria Department of Biology littlepg@uvvm.uvic.ca Vitória, Agosto de 1998

2 Sumário Página I - Introdução...1 II - Princípio...1 III - Teoria...1 IV - Amostragem...2 V - Filtração...2 VI - Extração dos pigmentos...3 VII - Determinação da clorofila por fluorimetria...5 VIII - Operação do fluorímetro...6 IX - Cálculo da concentração de clorofila a e feopigmentos...7 X - Exemplo para cálcuclo manual da clorofila a e feopigmentos...8 XI - Calibração do Fluorímetro TD XII - Determinação de clorofila a em culturas de fitoplâncton (determinação in vivo)...13 XIII - Considerações finais

3 I - Introdução A concentração de pigmentos fotossintetizantes é extensivamente utilizada para estimar a biomassa do fitoplâncton. A clorofila a está presente em todas as plantas verdes e para o fitoplâncton a concentração deste pigmento constitui aproximadamente, de 1 a 2% do peso seco. Outros pigmentos presentes no fitoplâncton incluem clorofilas b e c, xantofilas, ficobilinas e carotenos. Os produtos da degradação da clorofila, encontrados em ecossistemas aquáticos, são os feoforbídeos e feofitinas que constituem os feopigmentos e os clorofilídeos. A presença ou ausência dos vários pigmentos fotossintetizantes, dentre outras características, é utilizada para separar os maiores grupos do fitoplâncton. Existem três métodos para determinação da concentração de clorofila a no fitoplâncton: espectrofotometria, fluorimetria e cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A fluorimetria é mais sensível do que a espectrofotometria e requer um menor volume de amostra, podendo ser utilizada para determinações in vivo. O método por cromatografia é o mais preciso, mas não é adequado para análises de rotina. Os dois produtos da degradação da clorofila a, feoforbide a e feofitina a, podem interferir na determinação da clorofila a ao absorverem luz e fluorescerem na mesma região do espectro que a clorofila a. Se estes feopigmentos estiverem presentes na amostra, poderão ocorrer erros significativos na concentração de clorofila a. O presente protocolo é específico para determinação de clorofila a através do método fluorimétrico e constitui uma tentativa de normatização para análise desta variável, pelo subprograma de Monitoramento Ambiental do Programa Brasileiro para Integração da Maricultura (Brazilian Mariculture Linkage Program - BMLP). II - Princípio A fluorescência é provocada pela absorção de energia radiante e reemissão de parte desta energia sob a forma de luz. Na prática isso ocorre quando uma solução é iluminada por um feixe luminoso, de comprimento de onda específico, absorvendo luz e emitindo-a num comprimento de onda maior. Essa emissão é chamada de fluorescência. III - Teoria Uma dado volume de água da estação amostral deverá ser filtrado em filtro de fibra de vidro. A clorofila e outros pigmentos do fitoplâncton presentes na amostra são extraídos pelo procedimento de imersão do filtro em solução de acetona 90%, por um período de 20 a 24 horas. Os resíduos celulares e do filtro são removidos em uma segunda filtração, após a extração dos pigmentos. No fluorímetro o extrato de clorofila é iluminado (excitado) a 460 nm e a emissão da luz (fluorescência) é medida em 670 nm. Após a leitura deverão ser adicionadas 2 gotas de uma solução diluída de HCl para conversão da clorofila em feopigmentos. Os valores das leituras, antes e após a acidificação, o volume de amostra filtrada e o volume de acetona utilizado na extração serão utilizados na planilha de cálculo para determinação das concentrações de clorofila a e feopigmentos em µg/l (microgramas por litro). 3

4 IV Amostragem Material: Frascos de polietileno com capacidade para 1 L e isentos de ácidos. Procedimento: Um volume de aproximadamente 1 litro de água da estação amostral deverá ser armazenado num frasco de polietileno, devidamente identificado (ex. data, estação amostral, profundidade, maré e coletor). Os frascos deverão ser rapidamente armazenados em local abrigado da luz, num recipiente térmico (isopor ou Coleman) com gelo. As amostras deverão ser filtradas em laboratório o mais breve possível. V Filtração Material: filtros de fibra de vidro de 24 mm (Whatman 934-AH); pinça de pontas lisas e chatas; funis de filtração com capacidade para 200 ml (GelmanSciences); suporte para funis de filtração; bomba de vácuo. Solução de Carbonato de magnésio (MgCO 3 ): dissolver 1g de MgCO 3 em 100 ml de água destilada. Armazenar num frasco com conta-gotas. Água do mar filtrada: armazene um pouco da água do mar filtrada de suas amostras numa piseta com identificação. Procedimento: 1 Filtre triplicatas de aproximadamente 100 ml ou até o filtro ficar verde para cada uma das amostras, em filtro de fibra de vidro de 24mm (Whatman 934-AH), utilizando-se do sistema de filtração e de bomba de vácuo. Para evitar o rompimento das células e ocorrer a perda de clorofila, a filtração deve ser realizada numa pressão entre 100 e 300 mm Hg e não deve exceder 500 mm Hg. Registre o volume filtrado (V). 2 Antes de terminar a filtração adicione 3 gotas da solução de MgCO 3 para evitar a acidificação da clorofila. Com uma pisseta adicione um pouco de água do mar filtrada nas paredes internas do sistema de filtração, para filtração das eventuais células do fitoplâncton que ficarem aderidas. Não se deve usar água destilada devido ao risco de rompimento das células. 3 - Nesse ponto, podem ser estabelecidos dois caminhos: a extração imediata dos pigmentos ou o armazenamento dos filtros no congelador para posterior análise. 4 - Na escolha pela segunda opção, os filtros deverão ser dobrados ao meio (com o material filtrado para dentro) e acondicionados em papel alumínio. Os envelopes de alumínio devem ser devidamente identificado (ex. data, estação amostral, profundidade, maré e coletor) e acondicionados num recipiente contendo sílica gel, previamente desidratada, para serem armazenados no congelador. O prazo máximo para armazenamento é de 90 dias. Obs 1 : Os filtros sempre deverão ser manipulados com pinças de pontas lisas e chatas. 4

5 Obs 2 : O volume de 100 ml deve ser o suficiente para ambientes estuarinos, porém a prática com o procedimento das análises possibilitará a definição da quantidade ideal de amostra a ser filtrada. Isso dependerá da concentração de fitoplâncton na água e do tempo gasto na filtração. Em caso de grande quantidade de material em suspensão (ex. detritos de folhas) é recomendada uma pré-filtração das amostras com uma malha de aproximadamente 1mm (recomenda-se o uso de um escorredor de arroz). Em caso de culturas de fitoplâncton em fase exponencial de crescimento, um volume de 10 ml pode ser o ideal. VI - Extração dos pigmentos Material: unidade de filtração de extrato; filtros de fibra de vidro de 24mm (Whatman 934-AH); pinça de pontas lisas e chatas; proveta com capacidade de 10 ou 20 ml; Acetona 90%: Adicionar 100 ml de água destilada em 900mL de acetona. É recomendável preparar um volume total de 4 L (400 ml de água destilada em ml de acetona). Obs 3 : Os reagentes devem ter o padrão para análise (P.A.) e devem estar dentro do prazo de validade. A extração pode ser feita logo após a etapa de filtração da amostra de água ou via extração à frio (na geladeira a uma temperatura de +4ºC) por um período de 20 à 24 horas. A clorofila é rapidamente degrada pela luz (natural ou artificial), sendo necessário conduzir a extração dos pigmentos e as leituras no fluorímetro sob baixa luminosidade (penumbra). 1 O filtro deverá ser colocado num tubo de ensaio com tampa e estar completamente imerso em um volume aproximado de 10mL de acetona 90%. 2 Para evitar a exposição dos pigmentos à luz, o tubo de ensaio deverá ser coberto com papel laminado, e colocado na geladeira (extração à frio) por um período entre 20 e 24 horas. Algumas horas antes de completar o período de 24 horas é recomendável agitar levemente os tubos de ensaio para auxiliar a extração. Obs 4 : Os tubos de ensaio deverão estar limpos e isentos de vestígios de ácidos, além de terem uma tampa para evitar a volatilização da acetona. A identificação dos tubos deverá ser feita com uma etiqueta contendo as seguintes informações: estação amostral, profundidade, data (e hora no caso de comparação em diferentes níveis de maré) e volume de amostra filtrada (ml). É recomendável o uso de lápis, uma vez que a acetona pode manchar a etiqueta com a tinta da caneta. 5

6 3 A unidade de filtração de extrato, previamente enviada pelo BMLP (cilindro de plástico preto com suporte para filtro, tubo de ensaio com conexão para bomba de vácuo manual), deverá ser montada com um filtro de fibra de vidro de 24mm (Whatman 934-AH). Completado o período de extração (20 a 24 horas) o conteúdo do tubo (extrato e resíduos do filtro) deverá ser despejado cuidadosamente dentro do cilindro e então submetido a vácuo. Figura 1: Material para extração da clorofila. Figura 2: Encaixe a bomba de vácuo e despeje o extrato, com o filtro, diretamente do tubo de ensaio para o "funil" da unidade de filtração. Figura 3: Pressione a bomba para filtrar o extrato. Obs 5 : Esse procedimento possibilita a remoção de resíduos do filtro de fibra de vidro e de células do fitoplâncton. 4 - Com uma pisseta adicione um pouco de acetona 90% nas paredes internas do sistema de filtração, para que eventuais fragmentos do filtro aderidos às paredes sejam retidos pelo filtro. 5 Após a filtração determine o volume de extrato com uma proveta e anote o volume em ml (v). O volume final de extrato deve ser de aproximadamente 10 ml. 6

7 VII - Determinação da clorofila por fluorimetria Material: tubos de ensaio de 13 mm (cubetas); Solução de HCl (Ácido clorídrico) 0,1N: Diluir 1mL de HCl em 100mL de água destilada. Armazenar num frasco, devidamente identificado, com conta-gotas,. Procedimento: 1 - Aproximadamente 8 ml do extrato filtrado deverão ser despejados numa cubeta (tubo de ensaio de 13 mm de diâmetro) para leitura no fluorímetro. Obs 5 : As cubetas devem estar isentas de vestígio de ácido e devem ser enxaguadas entre uma leitura e outra com acetona 90%. É recomendável limpar a cubeta com um papel fino (papel higiênico) para retirar as impressões digitais na parede externa do frasco. Use sempre as mesmas cubetas. Um jogo de quatro cubetas é suficiente. ESQUEMA DA ANÁLISE 7

8 VIII - Operação do fluorímetro (TD-700) Ligue o fluorímetro (o botão está localizado na parte posterior do aparelho) e aguarde o aquecimento. Toda vez que a lâmpada do aparelho for instalada é necessário proceder com a calibração do equipamento. TURNER DESIGNS T7-1A 03/ XXX µg/l <ENT>- Setup&Cal Tela inicial para aquecimento do equipamento (contagem até 600 segundos). Durante essa fase o equipamento não responde aos comandos. Tela para leitura da amostra. Coloque a cubeta, limpa de impressões digitais, no suporte de 13 mm, feche a tampa e acione a tecla <*> (asterisco). Essa tecla aciona a função de leitura média durante um período de 12 segundos, evitando as oscilações. Na tela irá aparecer as letras DLY, posteriormente as letras AVG (para o período de 12 segundos) e finalmente END, com o valor médio da leitura. DLY XXX µg/l <ENT>- Setup&Cal AVG XXX µg/l <ENT>- Setup&Cal END XXX µg/l <ENT>- Setup&Cal Tela para leitura da amostra na opção de leitura média. Indica o período de 12 segundos antes de obter o valor médio da leitura. Valor médio da leitura. O número permanece na tela por apenas 5 segundos, devendo ser anotado na planilha rapidamente. Obs 6 : O número obtido não representa a concentração final de clorofila na amostra. Este número deverá ser utilizado nos cálculos para determinação de clorofila a e feopigmentos (seção IX). Obs 7 : Repita os passos anteriores após pingar duas gotas de HCl 1% na cubeta e invertê-la por duas vezes. A primeira leitura é considerada como antes da acidificação (antes H + ), enquanto que a segunda leitura eqüivale a depois da acidificação (depois H + ). Obs 8 : Para evitar significativas variações nas leituras não deixe amostras por muito tempo dentro do equipamento,. Além disso, a exposição à luz e o aquecimento da amostra resultam na redução da fluorescência. 8

9 IX - Cálculo da concentração de clorofila a e feopigmentos Visando facilitar os cálculos para determinação das concentrações de clorofila a e feopigmentos foram elaboradas planilhas de cálculos no arquivo TD700Calcs.xls (Excel 97). Entre com as seguintes informações nas colunas em azul da planilha TD- 700 Data (Tabela 1): identificação da amostra (coluna A linha 13 em diante); volume de extrato em ml (coluna B linha 13 em diante); volume filtrado em ml (coluna C linha 13 em diante); leitura antes da acidificação (coluna D linha 13 em diante); leitura depois da acidificação (coluna E linha 13 em diante). Nas colunas F e G (cor amarela) estão inseridas as fórmulas para cálculo da clorofila a (Fórmula 1) e feopigmentos (Fórmula 2), respectivamente. Tabela 1: Exemplo da planilha TD-700 Data do arquivo TD700Calcs.xls para cálculo de clorofila a e feopigmentos (valores correspondentes ao cálculo manual da página 10). Instrument Turner Designs TD-700 BMLP Chlorophyll Programs. J. L. Littlepage Version of 14 May 98 Dados dos extratos das amostras Células amarelas estão protegidas e automaticamente calculadas. Células azuis indicam dados a serem inseridos. Colunas/ linhas Fator para Feopigmentos r = 1,91000 r/r-1= 2,10 A B C D E F G 11 Identificação Vol. Extrato Vol. Filtrado Leitura Leitura Chloro a Feopigm. 12 da amostra ml ml Antes H+ depois H+ ug/l Ug/L 13 Cultivo ,835 1,044 1,66 0, Clorofila a µg/l = (r/r-1) (R a - R d ) (v/v) (Fórmula 1) Feopigmentos µg/l = (r/r-1) (rr d - R a ) (v/v) (Fórmula 2) Onde: r = razão das leituras entre antes e depois da acidificação de uma solução pura de clorofila a (normalmente é um valor próximo a 2,2); R a = leitura antes da acidificação; R d = leitura depois da acidificação; v = volume do extrato em ml; V = volume de amostra filtrada em ml. Os resultados são expressos em µg/l (microgramas por litro) ou mg/m 3 (miligramas por metro cúbico). 9

10 Obs 9 : Para evitar que as fórmulas (colunas F e G da planilha TD-700 Data) sejam apagadas o arquivo TD700Calcs.xls foi protegido e não permite que o mesmo seja salvo. Abra um arquivo no Excel e utilize a opção salvar como no menu arquivo e atribua uma identificação para a planilha com a qual você vai trabalhar. Assim, o arquivo TD700Calcs.xls funcionará como uma matriz. X - Exemplo para cálculo manual de clorofila a e feopigmentos O exemplo abaixo refere-se à concentração de clorofila a e feopigmentos numa cultura de fitoplâncton marinho em fase exponencial de crescimento. Razão das leituras "antes" e "depois" da acidificação de soluções padrão de clorofila a: baixa e alta concentração (r) = 1.91 Leitura da amostra antes de acidificar (R a ) = Leitura da amostra depois de acidificar (R d ) = Volume filtrado (V) = 10 ml Volume de extrato (v) = 10 ml Clorofila a µg/l = (r/r-1) (R a - R d ) (v/v) (Fórmula 1) {[1.91/(1.91-1)] x ( ) x (10/10)} {[1.91/0.91] x x 1} {2.098 x x 1} = 1.66 µg clorofila a/l Feopigmentos µg/l = (r/r-1) (rr d - R a ) (v/v) (Fórmula 2) {[1.91/(1.91-1)] x [(1.91x1.044) ] x (10/10)} {[1.91/0.91] x [(1.91x1.044) ] x (10/10)} {2.098 x [ ] x 1} {2.098 x x 1} = 0.33 µg feopigmentos/l Obs 10 : A técnica é bastante sensível à razão R d /R a. O valor 1,91 pode ser um pouco baixo, o que poderia resultar em concentrações negativas de feopigmentos. Conforme a razão R d /R a se aproxima de 2,2, valores negativos ocorrem numa menor frequência. Eventuais valores negativos de feopigmentos devem ser considerados como zero. 10

11 XI Calibração do Fluorímetro TD-700 O procedimento de calibração ajusta o aparelho para a faixa de concentração das amostras e a sensibilidade da análise baseando-se numa solução padrão (standard solution) de clorofila a. 1 Necessidade de calibração: a calibração visa uma maior acuracidade (avalia o grau em que resultado se aproxima do valor verdadeiro da variável que está sendo analisada) das análises e deve ser repetida sempre que a lâmpada do equipamento for trocada ou em função da necessidade de se analisarem soluções de concentrações muito diferentes. Por exemplo, se o aparelho está calibrado para análises de águas estuarinas em condições normais e houver a necessidade de se proceder a análise com amostras de cultivo de fitoplâncton que apresentam concentrações bastante elevadas. A primeira calibração será realizada com duas soluções padrão de clorofila a e as posteriores calibrações deverão ser realizadas com o padrão sólido. 2 - Modo de calibração: Este protocolo adotou o modo de calibração multiopcional - Concentração direta (Multi-optional - Direct Concentration). 3 - Soluções padrão de clorofila a: a calibração inicial do aparelho será feita com base em 2 (dois) padrões elaborados pela Turner Designs. A concentração de cada padrão está escrita na embalagem e na folha de especificação dos padrões:. Exemplo de solução padrão de clorofila a em acetona 90% para concentrações mais elevadas (High standard): µg Clorofila a /L e 2.0 µg Feofitina a /L. Exemplo de solução padrão padrão de clorofila a em acetona 90% para concentrações mais baixas (Low standard): 22.4 µg Clorofila a /L e 0.41 µg Feofitina a /L Obs 10 : As soluções padrão devem ser mantidas em freezer (-20ºC) e envoltas em papel alumínio até a hora da calibração. XXX µg/l <ENT>- Setup&Cal 1. Setup 2. Calibration 1. Mode 3. Units 2. Cal Procedure Simple <Multi-optional> A partir da tela inicial acione a tecla <ENT>. Tela principal de configuração e calibração: acione a tecla <1> (Setup). Tela de opções de configuração: acione a tecla <1>. Com a tecla < > selecione a opção <Multi-Optional>. Acione a tecla <ESC>. O modo de configuração "Multi-Optional" permite a subtração automática do branco. 11

12 Raw Fluor <Direct Conc.> Tela de modo de calibração: acione a tecla < > para escolher o modo <Direct Conc.>. Acione a tecla <ESC>. Obs 11 : O modo de configuração "Direct Conc." estabelece automaticamente o grau de sensibilidade, além de calcular a curva padrão. ppb ppm <ug/l> ppt ug/ml ng/ml Tela de modo de calibração: acione a tecla < > para escolher a unidade <ug/l>. Acione a tecla <ESC>. Obs 12 : Apesar de estabelecermos o modo de concentração direta (Direct Concentration) os números obtidos na leitura das amostras não representa a concentração final de clorofila a ou feopigmentos. 1. Setup 2. Calibration Max Range: XXX 1.OK 9.Change A tecla <ESC> retorna à tela principal de configuração e calibração: para acessar a seqüência de calibração acione a tecla <2> (Setup). A tecla <1> confirma o atual valor para concentração máxima que você deseja ler e a tecla <9> permite entrar com um novo valor. Ao optar pela tecla <9> entre com um valor entre e acione a tecla <ENT>. Max Conc: XXX New: <ENT> Number of Stds (1-5) = X <ENT> Entre com o número de padrões (standards) que você utilizará e acione a tecla <ENT>. É recomendado que o valor para o padrão de concentração mais elevada seja próximo a 80% da concentração máxima das amostras que você pretende ler. Quando utilizar dois padrões para calibração é importante que os padrões estejam dentro da faixa da curva de calibração. Inicie a leitura dos padrões sempre com o de maior concentração. Enter higest Conc Std first Hi Std Conc: XXX.X 1.OK 9.Change Nesta tela o aparelho está solicitando a concentração do padrão (standard) de concentração mais elevada. A tecla <1> confirma o atual valor do 1º padrão de maior concentração que você deseja ler. A tecla <9> permite entrar com um novo valor. Ao optar pela tecla <9> entre com um valor para o padrão e acione a tecla <ENT>. Repare que o valor tem uma casa decimal. Hi Std Conc: XXX.X New: <ENT> Insert 2 Std and press <*> Encha uma cubeta (tubo de ensaio de 13mm ) limpa com o padrão de maior concentração. Limpe e seque as paredes externas da cubeta e acione a tecla <*>. SETTING sens Sens Factor: XX Sensivity Set Sens Factor: XX Reading Hi Std WAIT 12

13 O aparelho irá ajustar a sensibilidade para o nível do padrão de maior concentração e logo em seguida irá proceder com a leitura do mesmo. 2 Std Conc: XXX.X 1.OK 9.Change A tecla <1> confirma o atual valor do 2º padrão de maior concentração que você deseja ler e a tecla <9> permite entrar com um novo valor. Ao optar pela tecla <9> entre com um valor para o padrão e acione a tecla <ENT>. Repare que o valor tem uma casa decimal. 2 Std Conc: XXX.X New: <ENT> Insert 2 Std and press <*> Encha uma cubeta limpa (tubo de ensaio de 13mm ) com o 2º padrão de maior concentração. Limpe e seque as paredes externas da cubeta e acione a tecla <*>. SETTING sens Sens Factor: XX Sensivity Set Sens Factor: XX Reading Hi Std WAIT O aparelho irá ajustar a sensibilidade para o nível do 2º padrão e logo em seguida irá proceder com a leitura do mesmo. Insert Blank and press <ENT> Press <0> when value stable Reading Blank WAIT Blank = XXX Encha uma cubeta limpa (tubo de ensaio de 13mm ) com a solução de acetona 90% (branco). Limpe e seque as paredes externas da cubeta e acione a tecla <*>. Acione a tecla <0> quando o valor estabilizar. Aguarde a leitura do branco. Valor da leitura do branco. Calibration Complete Calibração completada. A etapa seguinte consiste na determinação da razão R a /R d, a qual será utilizada nos cálculos da concentração de clorofila a e feopigmentos. A Tabela 2 apresenta um exemplo real da leitura antes e depois da acidificação dos padrões. Tabela 2: Razão das leituras "antes" e "depois" da acidificação das soluções padrão de clorofila a: baixa e alta concentração. Fluorímetro TD 700 (01/05/98) Padrão (Standard) Leitura antes da acidificação (R a ) Leitura depois da acidificação (R d ) R a / R d Baixa (low) Elevada (high) Os valores obtidos antes (R a ) e depois (R d ) da acidificação deverão ser inseridos na planilha TD-700 Stds. do arquivo TD700Calcs.xls (Microsoft Excel). 13

14 Insira o valor de R a na célula de cor amarela na coluna B e linha 14. O valor de R d deverá ser inserido na célula de cor amarela na coluna D e linha Padrão sólido: recentemente a Turner Designs desenvolveu um padrão sólido (Solid Standard Standard, RD, TD700) que consiste num cilindro com um filtro de excitação e outro de emissão. Esse padrão servirá para checar a estabilidade do aparelho Repare que as laterais do cilindro do padrão sólido tem marcadas as letras "L" e "H". A letra "L" indica o filtro para baixa concentração (Low) enquanto a letra "H" indica elevada concentração (High) Remova o suporte da cubeta do aparelho e insira o padrão sólido com a letra "L" voltada para a sua mão esquerda. Acione a tecla <*> e registre o valor obtido na etiqueta na parte inferior do cilindro, como baixa concentração (L) Remova o padrão sólido e insira-o com a letra "H" voltada para a sua mão esquerda. Acione a tecla <*> e registre o valor obtido na etiqueta na parte inferior do cilindro, como alta concentração (L). A Tabela 3 está organizada para você anotar os valores obtidos em diferentes leituras do seu padrão sólido. Tabela 3: Registro das leituras do padrão sólido no fluorímetro TD-700 (modo multiopicional e concentração direta). Leitura Data Unidade (Unit) 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º Faixa máxima (Max Range) Leitura para baixa concentração ("L" reading) Leitura para alta concentração ("H" reading) 14

15 XII - Determinação de clorofila a em culturas de fitoplâncton (determinação in vivo). A determinação direta da fluorescência de células vivas é conhecida como determinação in vivo, ou seja sem a extração dos pigmentos. Uma das aplicações desse método visa a determinação in vivo de clorofila a em amostras de cultivos de microalgas. Entretanto, esse procedimento não é muito sensível quando comparado ao método de extração (in vitro). Além disso o método in vivo não faz distinção entre a clorofila e os feopigmentos. Em fases iniciais de culturas em crescimento (fase exponencial), esse não é um problema significativo pois nessa fase a população (cultura unialgal) ou a comunidade (cultura mista) é jovem e não apresenta uma concentração significativa de feopigmentos. Nesse caso, as determinações in vivo podem ser bastante práticas como um método alternativo para se saber o volume necessário do cultivo de microalgas para alimentação de rotíferos e das fases larvais em larviculturas de camarões e ostras. Nesse método você irá trabalhar com duas planilhas do arquivo TD700 Calcs.xls. A planilha TD-700 Stds (Tabela 4). deverá ser utilizada na determinação do fator in vivo (Fator iv), enquanto a planilha TD-700 In-vivo (Tabela 5) deverá ser utilizada na determinação a concentração de clorofila a nas amostras de cultura de microalgas 1 - A partir de uma amostra de cultura retire 3 alíquotas de igual volume (10mL) para proceder com a análise em triplicata pelo método de extração. Calcule os valores de clorofila a e obtenha um valor médio para calibração. Entre com a concentração média de clorofila a da amostra na coluna B, linhas 46, 47 e 48 da planilha TD-700 Stds (Tabela 4). 2 - Retire alíquotas, correspondentes aos volumes das cubetas (tubos de ensaio) de 13 e 25mm, da mesma amostra de cultura e proceda com a determinação in vivo. Se necessário dilua as alíquotas. A partir da tela de leitura proceda com a determinação da fluorescência para as amostras nas cubetas de 13 e 25mm. XXX µg/l <ENT>- Setup&Cal 3 - Calcule o fator in vivo (Fator iv) para as cubetas de 13 e 25mm. Entre com as leituras para a cubeta de 13 mm na coluna C, linhas 46, 47 e 48 da planilha TD-700 Stds (Tabela 4). As leituras das cubetas de 25mm deverão entrar na coluna D, linhas 46, 47 e 48 desta mesma planilha. Fator iv 13mm : Clorofila a / leitura cubeta 13 mm (Fórmula 3) Fator iv 25mm : Clorofila a / leitura cubeta 25mm (Fórmula 4) 15

16 Tabela 4: Planilha TD-700 Stds. do arquivo TD700 Calcs.xls para determinação do fator in vivo. Cálculo do fator In-vivo Coluna\ A B C D E F Linha 44 Identific. Clorofila Leitura In-vivo Leitura In-vivo FATOR FATOR 45 amostra ug/l tubo 13 mm Tubo 25 mm IV13 IV Média do fator In-vivo r clorofila r mixed 55 Valor atual de r = 4 - Calcule a concentração de clorofila a nas amostras de cultura de microalgas. Entre com as leituras para a cubeta de 13 e 25 mm na coluna C, linhas 14 em diante da planilha In-vivo (Tabela 5). Clorofila a = leitura in vivo x Fator iv 13mm (Fórmula 5) Clorofila a = leitura in vivo x Fator iv 25mm (Fórmula 6) Exemplo: Clorofila a do extrato da cultura mista = 30 µg/l Leitura da cubeta de 13mm = 15 F iv 13mm = 30 µg/l / 15 = 2,0 µg/l Tabela 5: Planilha In-vivo do arquivo TD700 Calcs.xls para determinação da concentração de clorofila a nas amostras de cultura de microalgas. Instrument Turner Designs TD-700 BMLP Chlorophyll Programs. J. L. Littlepage Version of 14 May 98 Determinação da clorofila: análise in vivo. Células amarelas estão protegidas e automaticamente calculadas. Células azuis indicam dados a serem inseridos. Estimativa da clorofila: In-Vivo Coluna/ linha A B C D 9 Fator iv 13mm = Fator iv 25mm = Adicione abaixo os dados: In-Vivo 12 Identificação Diâmetro Cubeta Leitura Clorofila 13 da amostra (13 ou 25 mm) In-Vivo ug/l

17 XIII Considerações finais 1 - Configuração óptica do fluorímetro TD-700: a configuração óptica (Tabela 6) está otimizada para amostras onde a proporção entre clorofila b e clorofila a é baixa. De acordo com a literatura os sistemas marinhos apresentam essa baixa proporção. Deste modo a fluorescência da clorofila a é amplamente aceita para pesquisa em ambientes marinhos. Devido a elevada proporção de clorofila b e clorofila a em sistemas de água doce o método deverá ser modificado quanto as características dos filtros do fluorímetro. Tabela 6: Configuração óptica do fluorímetro TD-700 para análise de clorofila a e feopigementos pelo método tradicional de acidificação e para análise da clorofila a in vivo, conforme Turner Designs. Aplicação Kit óptico Lâmpada Filtro de excitação Método de extração da clorofila (método tradicional com acidificação) Método para determinação in vivo (método tradicional) Luz do dia (10-045) nm (10-050R BG 12) Filtro de emissão >665nm (10-051R RG 665) 2 Segurança no laboratório e descarte da acetona usada: Acetona é um solvente volátil, tóxico e inflamável. Em caso de derramamento lave bem a superfície exposta com bastante água. Altas concentrações ou exposição prolongada ao solvente podem causar dor de cabeça, narcose e irritação na pele, olhos e trato respiratório. Em caso de combustão utilize os seguintes meios para extinguir o fogo: CO 2, pó químico, água e espuma. Mantenha o frasco de acetona bem fechado e protegido contra eventuais danos físicos. O armazenamento do frasco deve ser feito em local fresco e bem ventilado, longe do calor, fagulhas, chamas e outras fontes de ignição. Para segurança pessoal é recomendável o uso de jaleco de laboratório, luvas e óculos de proteção contra eventual contato da acetona com a pele. A acetona usada não deve ser descartada na pia do laboratório, devendo ser armazenada em um frasco de 5L e identificado por uma etiqueta informando se tratar de "acetona usada". O destino final da acetona usada deverá ser providenciado pelas normas de segurança dos laboratórios da sua Universidade e controle de poluição pela agência municipal, estadual ou federal de meio ambiente. 3 - Cubetas: diferenças nas cubetas (tubos de ensaio) resultantes do processo de fabricação podem influenciar na fluorescência do extrato, principalmente em relação às réplicas das amostras. Para minimizar esse problema é recomendável selecionar um jogo de 6 ou 4 cubetas que apresentem baixa fluorescência para acetona 90%. Para selecionar as cubetas adicione aproximadamente 8mL de acetona 90% numa cubeta previamente limpa e seca, sem impressões digitais, e proceda com a leitura. Gire a cubeta cerca de 90º e faça uma nova leitura. No caso de grande variação entre as duas leituras da mesma cubeta, a mesma não deverá ser utilizada na análise. Selecione apenas as cubetas que apresentaram os mais baixos valores de fluorescência. 4 - Funcionamento do aparelho: Dois dias antes de iniciar os procedimentos de calibração do aparelho sugerimos que o fluorímetro seja ligado no início do dia e desligado ao final do expediente. É melhor deixar o instrumento ligado do que ligá-lo 17

18 e desligá-lo diversas vezes ao dia. De um modo geral os aparelhos não respondem bem ao funcionamento em curtos períodos. 5 - Informações na Internet sobre Turner Designs Inc.: No site existem informações complementares sobre a análise de clorofila a e outros equipamentos e acessórios. Bibliografia American Public Health Association. Standards methods for the examination of water and wastewater. 19ª ed., Baltimore, 1995 Jeffery, G.H.; Basset, J.; Mendham, J. & Denney, R.C. Vogel: Análise química quantitativa. Rio de Janeiro, Ed. Guanabara Koogan. 712 p Littlepage, J.L. A laboratory and shipboard manual of oceanographic techniques: chemical and biological oceanography. Department of Biology, University of Victoria, 230p., 1998 Paranhos, R. Alguns métodos para análise da água. Rio de Janeiro, Cadernos Didáticos UFRJ, 19, 200p., 1996 Strickland, J.D.H. & Parsons, T.R. A pratical handbook of seawater analysis. Fisheries Research Board of Canada, Ottawa, 310p., 1972 United States Environmental Protection Agency (USEPA). Method 445.0: In vitro determination of chlorophyll a and pheophytin a in marine and freshwater phytoplankton by fluorescence. 14p., 1992 Turner Designs. Fluorometric facts: chlorophyll and pheophytin. Bulletin p., 1995 Turner Designs. TD-700 laboratory fluorometer: operating manual. Version 1.4, 53p., 1997 Welschmeyer, N.A. Fluorimetric analysis of chlorophyll a in the presence of chlorophyll b and pheopigments. Limnol. Oceanogr. 39(8): , 1994 Agradecimentos: Gostaríamos de agradecer às biólogas Alessandra Delazari pela revisão do texto e a Patricia Summers por providenciar os equipamentos e materiais necessários e pelas sugestões. 18

19 Anotações 19

20 Anotações 20

21 Anotações 21