Interleukin-6 ELISA BE C. Instruções de Utilização

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1 Instruções de Utilização Interleukin-6 ELISA Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa da interleucina-6 (IL-6) no soro e plasma humanos e nos sobrenadantes de culturas celulares. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 5a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D-335 Hamburg, GermanyFax: +49 (0)

2 TABELA DE CONTEÚDOS 1. Aplicações. Sumário 3. Princípio do Teste 4. Materiais Fornecidos 5. Instruções de conservação Kit ELISA 6. Recolha e armazenamento de amostras 7. Materiais Necessários Mas Não Fornecidos 8. Avisos e Precauções 9. Preparação de Reagentes 10. Procedimento do Ensaio 11. Cálculo de Resultados 1. Limitações do Procedimento 13. Características de Desempenho 14. Informações para pedidos 15. Sumário da Preparação de Reagentes 16. Sumário do Procedimento do Ensaio 17 Referências Bibliográficas do Produto (4) 1/18

3 1. APLICAÇÕES O ELISA para IL-6 humana é um ensaio imunossorvente ligado a enzima para a deteção quantitativa de IL- 6 humana. O ELISA para IL-6 humana destina-se ao uso em diagnóstico in vitro. Não se destina a ser usado em procedimentos terapêuticos.. SÚMARIO A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina multifuncional que regula as respostas imunitárias, as reações de fase aguda e a hematopoiése e pode desempenhar um papel fundamental nos mecanismos de defesa do hospedeiro. O gene para a IL-6 humana foi localizado no cromossoma 7p1. A sequência genómica já foi determinada. A IL-6 não é habitualmente produzida de modo constitutivo pelas células normais, mas a sua expressão é prontamente induzida por uma variedade de citocinas, lipopolissacarídeos ou infeções víricas. O produto do gene da IL-6 é uma proteína de cadeia simples com uma massa molecular que varia entre 1 e 8 kda, dependendo da origem celular. As amplas modificações pós-tradução, como a N-glicosilação e a O-glicosilação, bem como a fosforilação parecem explicar esta heterogeneidade. O ADNc para a IL-6 prevê uma proteína precursora de 1 aminoácidos. A IL-6 é uma citocina pleiotrópica produzida por uma variedade de células. Ela atua sobre uma ampla variedade de tecidos, exercendo indução do crescimento, inibição do crescimento e diferenciação respetivamente, dependendo da natureza das células alvo. A IL-6 está envolvida: - na indução da diferenciação das células B, - na indução das proteínas de fase aguda nas células hepáticas, - na promoção do crescimento das células do mieloma/ plasmacitoma/ hibridoma, - na indução da expressão da IL- e do recetor da IL-, - na proliferação e diferenciação das células T, - na inibição do crescimento de células de certas linhas celulares leucémicas mieloides e - na indução da sua diferenciação para os macrófagos, - no desenvolvimento de células formadoras de colónias multipotenciais induzidas por IL-3 em célulastronco hematopoiéticas e na indução da maturação de - megacariócitos como fator de crescimento trombopoiético, - na indução da proliferação celular mesangial, - na indução da diferenciação neural das células PC 1 e - na indução do crescimento dos queratinócitos. A produção anormal de IL-6 foi sugerida pela primeira vez como estando relacionada com a ativação das células B policlonais com produção de autoanticorpos em doentes com mixoma cardíaco. Desde então, tem sido sugerido que a IL-6 está envolvida na patogénese de diversas doenças. A medição dos níveis de IL-6 no soro e em outros fluidos corporais proporciona assim perceções mais detalhadas sobre várias situações patológicas. Infeções: Os fluidos corporais de doentes com infeções bacterianas ou víricas locais e o soro de doentes com bacteremia gram-negativa ou positiva contêm níveis elevados de IL-6 biologicamente ativa. Infeções obstétricas: A IL-6 surgiu como uma citocina indicadora das infeções intra-amnióticas. As doenças associadas a um sistema imunitário alterado (anomalias das células B policlonais ou doenças autoimunes): Níveis elevados de IL-6 em circulação foram detetados em doentes com mixoma cardíaco, doença de Castleman, artrite reumatoide, gamopatia IgM e naquelas pessoas com síndrome de imunodeficiência adquirida bem como com cirrose alcoólica. Doenças proliferativas: Níveis plasmáticos elevados de IL-6 são observados em doentes com psoríase e glomerulonefrite proliferativa mesangial (4) /18

4 Doenças neoplásicas: Níveis sistémicos aumentados de IL-6 têm sido detetados em doentes com mieloma múltiplo, outras discrasias de células B, linfoma de Lennert, doença de Castleman, carcinoma das células renais e vários outros tumores sólidos. Respostas inflamatórias: A IL-6 está envolvida na indução das proteínas de fase aguda e na indução da febre. Níveis elevados de IL- 6 também foram encontrados no soro de doentes com queimaduras graves, no soro e no plasma como marcador para a previsão de complicações pós-operatórias, no soro e na urina de pessoas submetidas a transplantes renais antes da rejeição, no soro de doentes com choque séptico e em doentes com artrite inflamatória e artrite traumática. 3. PRINCÍPIO DO TESTE Um anticorpo de revestimento anti-il-6 humana é adsorvido nos micropoços. Figura 1 Micropoços Revestidos Anticorpo do Revestimento A IL-6 humana presente na amostra ou no padrão liga-se aos anticorpos adsorvidos nos micropoços. Um anticorpo anti-il-6 humana conjugado com biotina é adicionado, ligando-se à IL-6 humana capturada pelo primeiro anticorpo. Figura Primeira Incubação Após a incubação, o anticorpo anti-il-6 humana conjugado com biotina não ligado é removido durante a lavagem. É adicionada Estreptavidina-HRP que se liga ao anticorpo anti-il-6 humana conjugado com biotina. Figura 3 Padrão o Amostra Conjugado de Biotina Segunda Incubação Estreptavidina-HRP (4) 3/18

5 Figura 4 Após a incubação, a Estreptavidina-HRP não ligada é removida durante a lavagem e adiciona-se aos poços um substrato reativo com HRP. Terceira Incubação Substrato Forma-se um produto colorido em proporção à quantidade de IL- 6 humana presente na amostra ou no padrão. A reação é terminada pela adição de ácido e a absorvância é medida a 450 nm. Uma curva padrão é preparada a partir de 7 diluições padrão de IL-6 humana e determina-se então a concentração da amostra de IL-6 humana. Figura 5 Substrato reagiu 4. MATERIAIS FORNECIDOS 1 bolsa de alumínio com uma placa de micropoços revestidos com anticorpo monoclonal de IL-6 humana 1 frasco (70 μl) Conjugado de Biotina anticorpo monoclonal anti-il-6 humana 1 frasco (150 µl) Estreptavidina-HRP frascos Padrão IL-6 humana liofilizados, 00 pg/ml após reconstituição 1 frasco Controle niveis altos 1 frasco Controle niveis baixos 1 frasco (5 ml) Tampão de Reacção Concentrado 0x (PBS con 1 % Tween 0, 10 % BSA) 1 bottle (50 ml) con Tampão de Lavagem Concentrado 0x (PBS con 1 % Tween 0) 1 frasco (15 ml) Solução de Substrato (tetrametilbenzidina) 1 frasco (15 ml) Solução de Paragem (1M Ácido Fosfórico) 4 Película Aderente 5. INSTRUÇÕES DE CONSERVAÇÃO KIT ELISA Conserve os reagentes do kit entre C e 8 C exceto os controlos. Conserve os controlos liofilizados a -0 C. Imediatamente após a utilização, os reagentes remanescentes devem ser colocados de novo no frio ( C a 8 C), e os controlos a -0 C, respetivamente. A data de validade do kit e dos reagentes está indicada nos rótulos. A data de validade dos componentes do kit só pode ser garantida se os componentes forem devidamente armazenados e, no caso de utilização repetida de um componente, se este reagente não for contaminado pela primeira manipulação (4) 4/18

6 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Sobrenadante de cultura celular, soro e plasma (EDTA, citrato, heparina) foram testados com este ensaio. Outros fluidos corporais podem ser adequadas para utilização no ensaio. Remova o soro do coágulo logo que possível após a coagulação. As amostras que contenham um precipitado visível devem ser clarificadas antes de utilizadas no ensaio. Não utilize espécimes grosseiramente hemolisados ou lipémicos. As amostras devem ser aliquotadas e conservadas congeladas a -0 C para evitar perda de IL-6 humana bioativa. Se as amostras forem testadas num prazo de 4 horas, podem ser conservadas a uma temperatura entre e 8 C (para estabilidade da amostra, consulte a secção 13.5). Evite ciclos repetidos de congelação-descongelação. Antes do ensaio, a amostra congelada deve atingir a temperatura ambiente lentamente e ser misturada suavemente. 7. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS - Pipetas graduadas de 5 ml e 10 ml - Micropipetas de canal único ajustáveis de 5 µl a 1000 µl com ponteiras descartáveis - Micropipetas multicanais ajustáveis de 50 µl a 300 µl com ponteiras descartáveis - Reservatório de micropipeta multicanais - Provetas, balões de vidro, cilindros necessários para a preparação dos reagentes - Dispositivo para descarga de solução de lavagem (garrafa de esguicho multicanal ou sistema de lavagem automática) - Leitor de tiras de micropoços com capacidade para ler a 450 nm (60 nm como comprimento de onda de referência opcional) - Agua bidestilada o deionizada - Calculadora estatística com programa para realizar análise de regressão 8. AVISOS E PRECAUÇÕES - Todos os produtos químicos devem ser considerados como potencialmente perigosos. Recomendamos, portanto, que este produto seja manuseado apenas por pessoas com formação em técnicas laboratoriais e que seja manuseado de acordo com os princípios das boas práticas laboratoriais. - Use vestuário protetor adequado, como bata de laboratório, óculos de proteção e luvas. Deve usar-se de cuidado para evitar o contacto com a pele ou os olhos. Em caso de contacto com a pele ou os olhos, lave imediatamente com água. Consulte a(s) ficha(s) de dados de segurança do material e/ou as declarações de segurança para obter instruções específicas. - Os reagentes destinam-se ao uso em diagnóstico in vitro e não se destinam a ser usados em procedimentos terapêuticos. - Não misture nem substitua os reagentes com os de outros lotes ou outras origens. - Não utilize os reagentes do kit depois de vencida a data de validade indicada no rótulo. - Não exponha os reagentes do kit à luz forte durante o período de armazenamento ou incubação. - Não pipete com a boca. - Não coma nem fume em áreas onde os reagentes ou as amostras do kit são manuseados. - Evite o contacto da pele ou das membranas mucosas com os reagentes ou os espécimes do kit (4) 5/18

7 - Devem usar-se luvas de latex descartáveis ou de borracha ao manusear os reagentes ou os espécimes do kit. - Evite o contacto do substrato com agentes oxidantes e com metal. - Evite salpicos ou a criação de aerossóis. - De modo a evitar a contaminação microbiana ou a contaminação cruzada de reagentes ou espécimes que possam invalidar o teste, use ponteiras nas pipetas e/ou pipetas descartáveis. - Utilize tabuleiros de reagentes limpos exclusivos para distribuir o conjugado e o reagente do substrato. - A exposição ao ácido inativa o conjugado. - Deve usar-se água destilada em vidro ou água desionizada na preparação dos reagentes. - O substrato deve estar à temperatura ambiente antes de ser usado. - Descontamine e elimine os espécimes e todos os materiais potencialmente contaminados, uma vez que podem conter agentes infeciosos. O método preferencial de descontaminação é por autoclavagem durante no mínimo 1 hora a 11.5 C. - Os resíduos líquidos que não contenham ácido e os resíduos neutralizados podem ser misturados com hipoclorito de sódio em volumes tais desde que a mistura final contenha 1.0 % de hipoclorito de sódio. Espere 30 minutos para uma descontaminação eficaz. Os resíduos líquidos que contenham ácido devem ser neutralizados antes da adição de hipoclorito de sódio. 9. PREPARAÇÃO DE REAGENTES Os concentrados de tampão devem atingir a temperatura ambiente e ser diluídos antes de iniciar o procedimento de teste. Se houver formação de cristais nos concentrados de tampão, aqueça-os ligeiramente até que fiquem totalmente dissolvidos Tampão de Lavagem (1x) Deite o conteúdo total (50 ml) do Concentrado de Tampão de Lavagem (0x) num cilindro graduado limpo de 1000 ml. Encha até ao volume total de 1000 ml com água destilada em vidro ou água desionizada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma. Transfira para um frasco para lavagem limpo e conserve a uma temperatura entre C e 5 C. Tenha em atenção que o Tampão de Lavagem (1x) se mantém estável durante 30 dias. O Tampão de Lavagem (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela: Número de tiras Tampão de Lavagem (0x) (ml) Agua bidest. (ml) Tampão de Reacção (1x) Deite o conteúdo total (5 ml) do Concentrado de Tampão de Reacção (0x) num cilindro graduado limpo de 100 ml. Encha até ao volume total de 100 ml com água destilada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma. Conserve entre C e 8 C. Tenha em atenção que o Tampão de Reacção (1x) se mantém estável durante 30 dias. O Tampão de Reacção (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela: Número de tiras Tampão de Reacção (0x) (ml) Agua bidest. (ml) (4) 6/18

8 9.3. Conjugado de Biotina Tenha em atenção que o Conjugado de Biotina deve ser usado no máximo de 30 minutos após a diluição. Faça uma diluição de 1:100 da solução concentrada de Conjugado de Biotina com Tampão de Reacção (1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela: Número de tiras Conjugado de Biotina (ml) Tampão de Reacção (1x) (ml) Estreptavidina-HRP Tenha em atenção que a Estreptavidina-HRP deve ser usada no máximo de 30 minutos após a diluição. Faça uma diluição de 1:00 da solução concentrada de Estreptavidina-HRP com Tampão de Reacção (1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela: Número de tiras Estreptavidina-HRP (ml) Tampão de Reacção (1x) (ml) Padrão IL-6 Humana Reconstitua o Padrão IL-6 humana adicionando água destilada. O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de vidro do padrão. Agite ou misture suavemente para garantir a solubilização completa e homogénea (concentração do padrão reconstituído = 00 pg/ml). Deixe que o padrão se reconstitua durante minutos. Misture bem antes de fazer as diluições. O padrão tem de ser usado imediatamente após o tempo de reconstituição e não pode ser guardado. As diluições do padrão podem ser preparadas diretamente na placa do micropoço (consulte a secção 10.c) ou, em alternativa, em tubos (consulte a secção 9.5.1) Diluição Padrão Externa Rotule 7 tubos, um para cada ponto do padrão. S1, S, S3, S4, S5, S6, S7. Depois prepare diluições em série de 1: para a curva padrão da seguinte forma: Pipete 5 µl de Tampão de Reacção (1x) para cada tubo. Pipete 5 µl de padrão reconstituído (concentração = 00 pg/ml) para o primeiro tubo, rotulado S1, e misture (concentração do padrão 1 = 100 pg/ml). Pipete 5 µl desta diluição para o segundo tubo, rotulado S, e misture bem antes da próxima transferência. Repita as diluições em série mais 5 vezes criando assim os pontos da curva padrão (veja a Figura 6). O Tampão de Reacção (1x) serve como teste em branco (4) 7/18

9 Figura 6 Transferir 5 µl S1 S S3 S4 - S7 IL-6 Humana Padrão Reconstituído Tampão de Reacção (1x) 5 µl Eliminar 5 µl 9.6. Controlos Reconstitua adicionando 300 μl de água destilada aos controlos liofilizados (10-30 minutos). Agite ou misture suavemente para garantir a solubilização completa e homogénea. Continue a tratar os controlos como as suas amostras do ensaio. Para os intervalos dos controlos, consulte o certificado de análise ou o rótulo do frasco de vidro. Conserve os controlos reconstituídos aliquotados a -0 C. Evite ciclos repetidos de congelação e descongelação. 10. PROCEDIMENTO DO ENSAIO a. Determine o número de tiras de micropoços necessário para testar o número desejado de amostras mais o número apropriado de poços necessários para executar os brancos e os padrões. Cada amostra, padrão, branco e amostra opcional de controlo deve ser testado em duplicado. Remova as tiras extra do micropoço do suporte e guarde num saco de alumínio com o dessecante fornecido a uma temperatura de -8 C fechado hermeticamente. b. Lave as tiras do micropoço duas vezes com aproximadamente 400 μl de Tampão de Lavagem por poço realizando uma aspiração completa do conteúdo do micropoço entre as lavagens. Permita que o tampão de lavagem repouse nos poços durante cerca de segundos antes de aspirar. Tome cuidado para não arranhar a superfície dos micropoços. Após o último passo de lavagem, esvazie os poços e bata com as tiras dos micropoços em papel absorvente ou toalhas de papel para remover o tampão de lavagem em excesso. Utilize as tiras dos micropoços imediatamente após a lavagem. Em alternativa, as tiras dos micropoços podem ser colocadas invertidas sobre um papel absorvente húmido durante 15 minutos no máximo. Não deixe que os poços sequem. c. Diluição de padrão na placa do micropoço (Em alternativa, a diluição de padrão pode ser preparada em tubos consulte a secção 9.5.1): Adicione 100 μl de Tampão de Reacção (1x) em duplicado em todos os poços de padrão. Pipete 100 μl do padrão preparado (consulte Preparação de Padrão na secção 9.5, concentração = 00 pg/ml) em duplicado no poço A1 e A (consulte a Tabela 1). Misture o conteúdo dos poços A1 e A por aspiração e ejeção repetida (concentração do padrão 1, S1 = 100 pg/ml), e transfira 100 μl para os poços B1 e B, respetivamente (consulte a Figura 7). Tenha cuidado para não arranhar a superfície interior dos micropoços. Continue este procedimento 5 vezes, criando duas filas de diluições padrão de IL-6 humana variando entre e 1.56 pg/ml. Elimine 100 μl do conteúdo dos últimos micropoços (G1, G) utilizados (4) 8/18

10 Figura 7 Transferir 100 µl S1 S S3 S4 - S7 IL-6 Humana Padrão Reconstituído Tampão de Reacção (1x) 100 µl Eliminar 100 µl No caso de uma diluição de padrão externo (consulte a secção 9.5.1), pipete 100 μl destas diluições de padrão (S1 - S7) nos poços de padrão de acordo com a Tabela 1. Tabela 1 A tabela representa um exemplo da disposição de testes em branco, padrões e amostras nas tiras dos micropoços: A Padrão 1 ( pg/ml) Padrão 1 ( pg/ml) Amostra 1 Amostra 1 B Padrão (50.00 pg/ml) Padrão (50.00 pg/ml) Amostra Amostra C Padrão 3 (5.00 pg/ml) Padrão 3 (5.00 pg/ml) Amostra 3 Amostra 3 D Padrão 4 (1.50 pg/ml) Padrão 4 (1.50 pg/ml) Amostra 4 Amostra 4 E Padrão 5 (6.5 pg/ml) Padrão 5 (6.5 pg/ml) Amostra 5 Amostra 5 F Padrão 6 (3.13 pg/ml) Padrão 6 (3.13 pg/ml) Amostra 6 Amostra 6 G Padrão 7 (1.56 pg/ml) Padrão 7 (1.56 pg/ml) Amostra 7 Amostra 7 H Blanco Blanco Amostra 8 Amostra (4) 9/18

11 d. Adicione 100 μl de Tampão de Reacção (1x) em duplicado aos poços em branco. e. Adicione 50 μl de Tampão de Reacção (1x) aos poços da amostra. f. Adicione 50 μl de cada amostra em duplicado aos poços da amostra. g. Prepare o Conjugado de Biotina (consulte Conjugado de Biotina na secção 9.3). h. Adicione 50 μl de Conjugado de Biotina a todos os poços. i. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-5 C) durante horas, num agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm. j. Prepare a Estreptavidina-HRP (consulte a preparação de Estreptavidina-HRP na secção 9.4). k. Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 4 vezes de acordo com o ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo. l. Adicione 100 µl de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços, incluindo os poços em branco. m. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-5 C) durante 1 hora num agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm. n. Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 4 vezes de acordo com o ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo. o. Pipete 100 μl de Substrato TMB para todos os poços. p. Incube as tiras do micropoço à temperatura ambiente (18-5 C) durante cerca de 10 min. Evite a exposição direta à luz intensa. O desenvolvimento de cor na placa deve ser monitorizado e a reação do substrato interrompida (veja o próximo ponto deste protocolo) antes que os poços positivos não possam ser devidamente registáveis. A determinação do período de tempo ideal para o desenvolvimento da cor tem de ser feita individualmente para cada ensaio. Recomenda-se adicionar a solução de paragem quando o padrão mais elevado tiver desenvolvido uma cor azul-escura. Em alternativa, o desenvolvimento da cor pode ser monitorizado a 60 nm pelo leitor de placas ELISA. A reação do substrato deve ser parada logo que o Padrão 1 atingiu uma DO de q Pare a reação da enzima ao pipetar rapidamente 100 μl de Solução de Paragem para cada poço. É importante que a solução de paragem seja espalhada rápida e uniformemente pelos micropoços para inativar completamente a enzima. Os resultados devem ser lidos imediatamente após a solução de paragem ser adicionada ou no período de uma hora se as tiras dos micropoços forem guardadas a uma temperatura de -8 C no escuro. r. Leia a absorvância de cada micropoço num espectrofotómetro usando 450 nm como o comprimento de onda principal (opcionalmente 60 nm como o comprimento de onda de referência; 610 nm a 650 nm é aceitável). Limpe o leitor de placas de acordo com as instruções do fabricante ao usar os poços para testes em branco. Determine a absorvância das amostras e dos padrões. Nota: No caso de incubação sem agitação, os valores da D.O. obtidos podem ser inferiores aos indicados abaixo. Não obstante os resultados continuam a ser válidos (4) 10/18

12 11. CÁLCULO DE RESULTADOS - Calcule os valores médios de absorvância para cada conjunto de padrões e amostras em duplicado. Os duplicados devem estar a 0 por cento do valor médio. - Crie uma curva padrão ao representar graficamente a absorvância média para cada concentração de padrão na ordenada face à concentração da IL-6 humana na abcissa. Desenhe a curva que melhor se ajusta através dos pontos no gráfico (recomenda-se um ajuste de curva de 5 parâmetros). - Para determinar a concentração de IL-6 humana em circulação para cada amostra, encontre primeiro o valor médio de absorvância na ordenada e prolongue uma linha horizontal para a curva padrão. No ponto de interseção, prolongue uma linha vertical para a abcissa e leia a concentração correspondente de IL-6 humana. - Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1: (50 μl amostra + 50 μl Tampão de Reacção (1x)), a concentração lida da curva padrão deverá ser multiplicada pelo fator de diluição (x ). - O cálculo das amostras com uma concentração que exceda o padrão 1 poderá resultar em níveis de IL-6 humana baixos e incorretos. Tais amostras exigem uma pré-diluição externa adicional de acordo com os valores esperados da IL-6 humana com o Tampão de Reacção (1x) de modo a quantificar com precisão o nível real de IL-6 humana. Tem-se sugerido que cada instituição de teste determine uma amostra de controlo da concentração conhecida de IL-6 humana e execute este controlo adicional com cada ensaio. Se os valores obtidos não se encontrarem dentro do intervalo esperado do controlo, os resultados do ensaio podem ser inválidos. A Figura 8 mostra uma curva padrão representativa. Esta curva não pode ser usada para obter resultados de teste. Cada laboratório deve preparar uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio. Figura 8 Curva padrão representativa do ELISA para IL-6 humana. A IL-6 humana foi diluída duas vezes em série em Tampão de Reacção (1x). Não use esta curva padrão para obter resultados de teste. Deve ser executada uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio Interleukin-6 ELISA DO (450 nm) (pg/ml) (4) 11/18

13 Dados típicos usando o IL-6 humano ELISA Comprimento de onda: 450 nm Comprimento de onda de referência: 60 nm Tabela Padrão Concentração da D.O. IL-6 Humana (pg/ml) (450 nm) Blanco D.O. Media C.V. (%) Os valores da D.O. da curva padrão podem variar de acordo com as condições de execução do ensaio (p. ex., funcionário, técnica de pipetagem, técnica de lavagem ou efeitos da temperatura). Além disso, a vida útil do kit pode afetar a atividade enzimática e, assim, a intensidade da cor. Os valores medidos continuam a ser válidos. 1. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO - Uma vez que as condições exatas podem variar de um ensaio para outro, deve ser criada uma curva padrão para cada série de testes. - A contaminação bacteriana ou fúngica das amostras a testar ou dos reagentes ou a contaminação cruzada entre os reagentes pode dar origem a resultados erróneos. - É preferível usar ponteiras de pipetas descartáveis, frascos ou material de vidro; o material de vidro reutilizável deverá ser lavado e todos os detergentes deverão ser eliminados antes de o material ser usado novamente. - A lavagem inadequada ou insuficiente em qualquer fase do procedimento dará origem a resultados falso positivos ou falso negativos. Esvazie os poços completamente antes de distribuir solução de lavagem fresca, encha com tampão de lavagem conforme indicado para cada ciclo de lavagem e não deixe que os poços fiquem destapados ou sequem durante períodos prolongados. - O uso de imunorradioterapia tem aumentado significativamente o número de doentes com anticorpos humanos IgG anti-rato (HAMA). HAMA pode interferir nos ensaios que utilizam anticorpos monoclonais murinos, dando origem tanto a resultados falso positivos como falso negativos. - Amostras de soro contendo anticorpos de imunoglobulinas murinas ainda podem ser analisadas em tais ensaios quando as imunoglobulinas murinas (soro, fluido ascítico ou anticorpos monoclonais de especificidade irrelevante) são adicionadas à amostra (4) 1/18

14 13. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade O limite de deteção da IL-6 humano definida como a concentração do analito que resulta numa absorvância significativamente maior do que a do meio de diluição (média mais desvios padrão) foi determinado como 0.9 pg/ml (média de 6 ensaios independentes) Reprodutibilidade Intra-Ensaio A reprodutibilidade dentro do ensaio foi avaliada em experiências independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 8 amostras de soro contendo concentrações diferentes de IL-6 humana. Foram executadas curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da IL-6 humana e o coeficiente de variação para cada amostra (veja a Tabela 3). O coeficiente de variação global calculado intra-ensaio foi de 3.4 % Tabela 3 A concentração média da IL-6 humana e o coeficiente de variação de cada amostra. Amostra Experimento Concentração Média de IL-6 Humana (pg/ml) Coeficiente de Variação (%) (4) 13/18

15 13... Inter-Ensaio A reprodutibilidade de ensaio para ensaio no mesmo laboratório foi avaliada em experiências independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 8 amostras de soro contendo concentrações diferentes de IL-6 humana. Foram executadas curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da IL-6 humana e o coeficiente de variação calculados em 18 determinações de cada amostra (veja a Tabela 4). O coeficiente de variação global calculado entre ensaios foi de 5. %. Tabela 4 A concentração média da IL-6 humana e o coeficiente de variação de cada amostra. Amostra Concentração Média de IL-6 Humana (pg/ml) Coeficiente de Variação (%) Recuperação do reforço A recuperação do reforço foi avaliada ao reforçar 4 níveis de IL-6 humana no soro. As recuperações foram determinadas em experiências independentes com 8 réplicas cada. O soro não reforçado foi usado como branco nestas experiências. A recuperação variou entre 78 % e 105 % com uma recuperação global média de 88 % Paralelismo de diluição Amostras de soro com diferentes níveis de IL-6 humana foram analisadas em diluições em série com 4 réplicas cada. A recuperação variou entre 98 % e 111 % com uma recuperação global média de 105 % (veja Tabela 5). Tabela 5 Amostra 1 3 Diluição 1: 1:4 1:8 1: 1:4 1:8 1: 1:4 1:8 Concentração Esperada da IL-6 humana (pg/ml) Concentração Observada da IL-6 humana (pg/ml) Recuperação da Concentração Esperada (%) (4) 14/18

16 13.5. Estabilidade da amostra Estabilidade durante a congelação-descongelação Alíquotas de soro (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -0 C e descongeladas 5 vezes, e determinaram-se os níveis de IL-6 humana. Não houve perda significativa da imunorreatividade detetada da IL-6 humana através da congelação e descongelação Estabilidade de conservação Alíquotas de soro (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -0 C, -8 C, à temperatura ambiente e a 37 C, e o nível da IL-6 humana foi determinado após 4 h. Não houve perda significativa da imunorreatividade detetada da IL-6 humana durante a conservação nas condições acima descritas Comparação do soro e do plasma Foram avaliados soro e EDTA, citrato e plasma com heparina obtidos de dois indivíduos no mesmo momento temporal. As concentrações de IL-6 humana não foram significativamente diferentes e, portanto, todos estes fluidos corporais são adequados para o ensaio. Não obstante, recomenda-se vivamente que se assegure a uniformidade das preparações de sangue Especificidade A interferência dos fatores em circulação do sistema imunitário foi avaliada ao reforçar estas proteínas em concentrações fisiologicamente relevantes num soro positivo de IL-6 humana. Não se detetou reatividade cruzada Valores esperados Um painel de amostras de dadores aparentemente saudáveis e aleatoriamente selecionados (do sexo masculino e feminino) foi testado quando à IL-6 humana. Os níveis medidos podem variar com o conjunto de amostras usado. Para os níveis detetados de IL-6 humana, consulte a Tabela 6 Tabla 6 Matriz de Número de amostras Intervalo Média de Detetáveis % Detetável amostras avaliadas (pg/ml) (pg/ml) Soro 40 nd* Plasma (EDTA) 40 nd* Plasma (Citrato) 40 nd* Plasma (Heparina) 40 nd* *nd = não detetáveis amostras medidas abaixo do ponto mais baixo do padrão são consideradas como sendo não detetáveis Calibração O imunoensaio é calibrado com IL-6 humana recombinante altamente purificada que foi avaliada em relação ao Padrão de Referência internacional NIBSC 89/548 e mostrou ser equivalente. O NIBSC 89/548 está quantificado em unidades internacionais (UI), sendo que 1 UI corresponde a 10 pg de IL-6 humana (4) 15/18

17 14. INFORMAÇÕES PARA PEDIDOS Para encomendas entre em contacto com: Veja a última página. Para obter informações técnicas, por favor contacte: IBL@IBL-International.com SUMARIO DA PREPARAÇÃO DE REAGENTES Tampão de Lavagem (1x) Adicione Concentrado de Tampão de Lavagem 0x (50 ml) a 950 ml de água destilada. Número de tiras Tampão de Lavagem Concentrado (ml) Agua Bidest. (ml) Tampão de Reacção Adicione Concentrado de Tampão de Reacção 0x (5 ml) a 95 ml de água destilada. Número de tiras Tampão de Reacção Concentrado (ml) Agua Bidest. (ml) Conjugato de Biotina Faça uma diluição de 1:100 de Conjugado de Biotina em Tampão de Reacção (1x): Número de tiras Conjugado de Biotina (ml) Tampão de Reacção (1x) (ml) Estreptavidina-HRP Faça uma diluição de 1:00 de Estreptavidina-HRP em Tampão de Reacção (1x): Número de tiras Estreptavidina-HRP (ml) Tampão de Reacção (1x) (ml) Padrão IL-6 Humana Reconstitua o padrão de IL-6 humana liofilizado com água destilada. (O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de padrão.) Controlos Adicione 300 μl de água destilada aos controlos liofilizados (4) 16/18

18 16. SUMÁRIO DO PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Determine o número de tiras de micropoços necessário.. Lave as tiras dos micropoços duas vezes com Tampão de Lavagem. 3. Diluição de padrão na placa do micropoço: Adicione 100 μl de Tampão de Reacção (1x), em duplicado, a todos os poços de padrão. Pipete 100 μl do padrão preparado para os primeiros poços e crie diluições de padrão para transferir 100 μl de poço para poço. Elimine 100 μl dos últimos poços. Em alternativa, diluição de padrão externa em tubos (consulte a secção 9.5.1): Pipete 100 μl destas diluições de padrão nas tiras dos micropoços. 4. Adicione 100 μl de Tampão de Reacção (1x), em duplicado, aos poços em branco. 5. Adicione 50 μl de Tampão de Reacção (1x) aos poços com as amostras. 6. Adicione 50 μl da amostra em duplicado aos poços de amostra designados. 7. Prepare o Conjugado de Biotina. 8. Adicione 50 μl de Conjugado de Biotina a todos os poços. 9. Cubra as tiras dos micropoços e incube horas à temperatura ambiente (18 C a 5 C). 10. Prepare Estreptavidina-HRP. 11. Esvazie e lave as tiras dos micropoços 4 vezes com Tampão de Lavagem. 1. Adicione 100 μl de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços. 13. Cubra as tiras dos micropoços e incube 1 hora à temperatura ambiente (18 C a 5 C). 14. Esvazie e lave as tiras dos micropoços 4 vezes com Tampão de Lavagem. 15. Adicione 100 μl de Solução de Substrato TMB a todos os poços 16. Incube as tiras dos micropoços durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente (18-5 C). 17. Adicione 100 μl de Solução de Paragem a todos os poços. 18. Ponha em branco o leitor dos micropoços e meça a intensidade da cor a 450 nm. Nota: Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1: (50 μl amostra + 50 μl Tampão de Reacção (1x)), a concentração lida da curva padrão deverá ser multiplicada pelo fator de diluição (x ) (4) 17/18

19 17. Referências Bibliográficas do Produto 1. Helfgott, D. C.; Tatter, S. B.; Santhanam, U.; Clarick, R. H.; Bhardwaj, N.; May, L. T.; Sehgal, P. B.. Multiple forms of IFN-beta /IL-6 in serum and body fluids during acute bacterial infection. J.Immunol. 1989; 14: Ueyama, M.; Maruyama, I.; Osame, M.; Sawada, Y.. Marked increase in plasma interleukin-6 in burn patients. J.Lab Clin.Med. 199; 10: May, L. T.; Santhanam, U.; Tatter, S. B.; Bhardwaj, N.; Ghrayeb, J.; Sehgal, P. B.. Phosphorylation of secreted forms of human beta -interferon/hepatocyte stimulating factor/interleukin-6. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1988; 15: Martinez-Maza, O.. IL6 and AIDS. Res.Immunol. 199; 143: Santhanam, U.; Avila, C.; Romero, R.; Viguet, H.; Ida, N.; Sakurai, S.; Sehgal, P. B.. Cytokines in normal and abnormal parturition: elevated amniotic fluid interleukin-6 levels in women with premature rupture of membranes associated with intrauterine infection. Cytokine 1991; 3: Nakajima, K.; Martinez-Maza, O.; Hirano, T.; Breen, E. C.; Nishanian, P. G.; Salazar-Gonzalez, J. F.; Fahey, J. L.; Kishimoto, T.. Induction of IL-6 (B cell stimulatory factor-/ifn-beta ) production by HIV. J.Immunol. 1989; 14: Cayphas, S.; Van, Damme J.; Vink, A.; Simpson, R. J.; Billiau, A.; Van, Snick J.. Identification of an interleukin HP1-like plasmacytoma growth factor produced by L cells in response to viral infection. J.Immunol. 1987; 139: Koj Aleksander. Regulation of the acute phase and immune responses: interleukin-6. Ann.N Y.Acad.Sci. 1989; 557: Hirano, T.; Matsuda, T.; Turner, M.; Miyasaka, N.; Buchan, G.; Tang, B.; Sato, K.; Shimizu, M.; Maini, R.; Feldmann, M.;.. Excessive production of interleukin 6/B cell stimulatory factor- in rheumatoid arthritis. Eur.J.Immunol. 1988; 18: Sheron, N.; Bird, G.; Goka, J.; Alexander, G.; Williams, R.. Elevated plasma interleukin-6 and increased severity and mortality in alcoholic hepatitis. 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Role of interleukin-6 in the progression of mesangial proliferative glomerulonephritis. Kidney Int.Suppl 1993; 39:S71-S Ray, A.; Tatter, S. B.; Santhanam, U.; Helfgott, D. C.; May, L. T.; Sehgal, P. B.. Regulation of expression of interleukin-6. Molecular and clinical studies. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1989;557: Hirano, T.; Akira, S.; Taga, T.; Kishimoto, T.. Biological and clinical aspects of interleukin 6. Immunol.Today 1990; 11: Elder, J. T.; Sartor, C. I.; Boman, D. K.; Benrazavi, S.; Fisher, G. J.; Pittelkow, M. R.. Interleukin-6 in psoriasis: expression and mitogenicity studies. Arch.Dermatol.Res. 199; 84: Merico, F.; Bergui, L.; Gregoretti, M. G.; Ghia, P.; Aimo, G.; Lindley, I. J.; Caligaris-Cappio, F.. Cytokines involved in the progression of multiple myeloma. Clin.Exp.Immunol. 1993; 9: Seguchi, T.; Yokokawa, K.; Sugao, H.; Nakano, E.; Sonoda, T.; Okuyama, A.. Interleukin-6 activity in urine and serum in patients with bladder carcinoma. 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20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 5A, 335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /