FERNANDA TAÍS MECABÔ

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1 FERNANDA TAÍS MECABÔ A RESTRIÇÃO PROTÉICA DURANTE A LACTAÇÃO ALTERA O CONTROLE PELO SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO DA SECREÇÃO DE INSULINA INDUZIDA PELA GLICOSE EM RATOS ADULTOS. Dissertação apresentada ao Curso de mestrado em Ciências Biológicas (áreas de concentração Biologia Celular), da Universidade Estadual de Maringá para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Maringá

2 PROTEIN RESTRICTION DURING LACTATION ALTERS THE AUTONOMIC NERVOUS SYSTEM CONTROL ON GLUCOSE-INDUCED INSULIN SECRETION IN ADULT RATS. Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar de Freitas Mathias Orientanda: Fernanda Taís Mecabô Maringá 2006

3 AGRADECIMENTOS: Aos meus pais: Gentil e Rozenete. Minha vovozinha Irma e minha irmã Carol, pelo apoio incondicional. Ao meu amor: Antonio, pelo carinho, compreensão e paciência. Aos colegas de laboratório: Dionizia, Sabrina, Ana Eliza, Fernanda, Diego, Anderson, Rodrigo, Marcelo e Carioca, pela ajuda nas dificuldades e pelos momentos de descontração. Às técnicas: Maroly e Clarice pelo auxílio e amizade. Ao Prof. Paulo por apostar na minha capacidade. Aos professores da pós-graduação pelo empenho em transmitir o conhecimento científico.

4 Resumo: 1. Objetivo geral: Avaliar a modulação promovida pelo sistema nervoso autônomo (SNA) na secreção de insulina de ratos adultos que foram submetidos à desnutrição protéica durante parte da lactação. Bases teóricas: A desnutrição protéica é um problema importante nos países em desenvolvimento. Quando mudanças no estado nutricional ocorrem no início da vida, podem afetar o desenvolvimento dos mecanismos de controle metabólico desse organismo. Evidências epidemiológicas indicam que há uma relação entre desnutrição protéica e um aumento na suscetibilidade a alterações na tolerância a glicose. Estudos em modelos experimentais de desnutrição protéica perinatal documentam alterações nas ilhotas pancreáticas. De maneira geral, ocorre uma diminuição na magnitude da resposta secretória da célula β pancreática e dessa forma, leva a uma permanente hipoinsulinemia. A glicose é considerada a biomolécula mais importante na estimulação das células β pancreáticas durante o processo de secreção de insulina. Todavia, o SNA constituído pelo Sistema Nervoso Parassimpático (SNP) e Sistema Nervoso Simpático (SNS) também exercem um importante papel na regulação da secreção de insulina. O SNP, liberando o seu principal neurotransmissor, a acetilcolina, através da ligação com receptores muscarínicos nas células β pancreáticas, potencializa a secreção de insulina estimulada por glicose. O SNS, liberando ou secretando catecolaminas (adrenalina e noradrenalina), exerce um papel dual na secreção de insulina, sendo inibitório via receptores α adrenérgico e estimulatório via receptores β adrenérgico. Ilhotas pancreáticas de animais que sofreram desnutrição protéica desenvolvem diversas alterações intrínsecas, como morfologia, expressão de genes, atividade enzimática, etc. Entretanto, essas evidências não excluem a possibilidade da participação do SNA como modulador da secreção deficiente de insulina. Foi observado que a desnutrição protéica depois do desmame provoca redução na atividade do SNP e aumento da atividade do SNS. No entanto, é provável que as alterações sofridas por um mamífero durante a lactação não sejam exatamente as mesmas que aquelas sofridas pelo animal jovem, levando-se em conta que a lactação é uma fase em que ocorre uma alta taxa de crescimento e desenvolvimento, particularmente no que se refere ao Sistema Nervoso. 2. Objetivos específicos: Observar a secreção de insulina in vivo e in vitro, estimulada por glicose e ainda a modulação exercida pelos agonistas e antagonistas dos receptores muscarínicos (acetilcolina e atropina) e dos receptores α adrenérgicos (yohimbina e oxymetazolina) e β adrenérgicos (isoproterenol). 3. Procedimentos: Ratos Wistar cujas mães receberam nos 14 primeiros dias da lactação uma dieta isocalórica contendo 4% de proteína (LP) ou uma dieta contendo 23% de proteína (NP). Aos 21 dias eram desmamados e aos 81dias parte dos animais de ambos os grupos foi submetido ao teste de tolerância à glicose intravenosa (ivgtt) associada ou não a aceticolina (ach), atropina (atr), yohimbina (yoh) e oxymetazolina (oxy). O restante dos animais foram sacrificados. Foi medido o comprimento e o peso corporal. O índice de Lee foi calculado [peso corporal(g) 1/3 /comprimento naso-anal (cm). Foram também isoladas e pesadas as gorduras periepididimais e

5 retroperitoneais para estimar a massa de gordura corporal e o cérebro para aferir possíveis alterações. As ilhotas pancreáticas foram isoladas pelo método da colagenase. Ilhotas do grupo NP e LP foram incubadas com glicose na presença ou ausência de epinefrina (100nM) com propranolol (100nm) ou com carbamilcolina (1mM) com e sem atr (10µM). Também foram feitas incubações com iso (10µM) com e sem yoh (10µM). 4. Resultados: Ratos submetidos à desnutrição protéica durante a lactação apresentaram o peso corporal reduzido em 23% e das gorduras periepididimal e retroperitoneal em 30% e 49%, respectivamente, tudo comparado aos NP. A insulinemia de jejum foi 41% menor nos LP sem, contudo apresentar diferença significativa na glicemia de jejum. O ivgtt mostrou que a desnutrição provocou intolerância à glicose e hipoinsulinemia. Os animais LP apresentaram I (calculado a partir da área sob a curva - AUC) 31% menor que os NP(p<0.05). Ach afetou os LP aumentando o I (AUC) 64% e em apenas 18% nos NP. Atr teve efeito somente nos NP reduzindo o I (AUC) em 22% (p<0.05). Oxy reduziu o I (AUC) em 25% apenas nos NP. Por outro lado, yoh aumentou o I(AUC) em 65% nos LP e em somente 32% nos NP (p<0.05). Em ilhotas, a carbamilcolina potencializou a secreção de insulina em 311% nos LP e em 594% nos NP (p<0.05). Epinefrina inibiu a secreção na mesma magnitude nos dois grupos. Isso potencializou em 70% a secreção nos LP e apenas 35% nos NP (p<0.05). 5. Conclusões: A desnutrição protéica perinatal induz mudanças no metabolismo que são mantidas na vida adulta. Dentre as alterações está o baixo peso e a hipoinsulinemia. Ilhotas pancreáticas de animais LP secretam menos insulina sob o estímulo da glicose tanto in vivo como in vitro. A resposta secretória das ilhotas aos moduladores autonômicos também está alterada. Dessa forma os resultados sugerem que a regulação da secreção de insulina está comprometida, não só o controle pela glicose, mas também os efeitos insulinotrópicos modulados pelo SNA em ratos adultos que sofreram desnutrição protéica durante parte da lactação.

6 Summary: 6. Main Objective: To evaluate the modulation caused by the autonomic nervous system (SNA) on the insulin secretion in adult rats submitted to protein undernutrition during part of lactation. Theoretical foundations: Protein undernutrition is an important problem in developing countries. When changes in nutritional situation happen in the beginning of life, they may affect the development of the organism s metabolic control mechanisms. Epidemiologic evidences indicate that there is a relationship between protein undernutrition and increase in susceptibility to alterations in glucose tolerance. Studies in perinatal protein undernutrition experimental models show alterations in pancreatic islets. In a general way, there is a decrease in the magnitude of the secretory response of the β pancreatic cell, thus leading to permanent hypoinsulinemia. Glucose is considered to be the most important biomolecule to the β pancreatic cells stimulation, during the insulin secretion process. However, the SNA, consisting of the Parasympathetic Nervous System (SNP) and the Sympathetic Nervous System (SNS), also have an important role in the regulation of insulin secretion. The SNP, releasing acetylcholine its main neurotransmitter through the binding with muscarinic receptors in the pancreatic β cells, enhances glucose-stimulated insulin secretion. SNS, releasing or secreting catecholamines (adrenaline and noradrenaline), plays a dual role in insulin secretion, being an inhibitor through α adrenergic receptors and a stimulator through the β adrenergic receptors. Pancreatic islets from animals who have suffered protein undernutrition develop several intrinsic alterations, e.g. in morphology, genes expression, enzymatic activity, etc. However, these evidences do not exclude the possibility of the participation of the SNA as a modulator of the defective insulin secretion. It has been observed that the protein undernutrition after weaning provokes a decrease in SNP activity and increase in SNS activity. Nevertheless, it is possible that the alterations suffered by a mammal during lactation are not exactly the same as those ones suffered by the young animal, considering that lactation is a period in which there is a high rate of growth and development, especially regarding the central nervous system. 7. Specific Objectives: Observe glucose-induced insulin secretion in vivo and in vitro, and also the modulation induced by agonists and antagonists of the muscarinic receptors acetylcholine and atropine, respectively and of the α adrenergic receptors yohimbine and oxymetazoline and one β adrenergic agonist isoproterenol in adults rats whose were fed with protein restriction during part of lactation. 8. Procedures: Wistar rats whose mothers received an isocaloric diet containing 4% protein (LP) or a 23% protein diet (NP), in the 14 days following birth. They were weaned at the age of 21 days, and at the age of 81 days part of the animals from both groups was submitted to the intravenous glucose tolerance test (ivgtt), associated or not to acetylcholine (ach), atropine (atr), yohimbine (yoh) and oxymetazoline (oxy). The rest of the animals were killed. Length and body weight were measured. Lee index was calculated [body weight(g) 1/3 /nasoanal length (cm)]. Periepididymal and retroperitoneal fat was also isolated and weighed to estimate body fat mass, as well as the brain, to assess possible alterations.

7 Pancreatic islets were isolated by the collagenase method. Islets from the NP and LP groups were incubated with glucose in the presence and in the absence of epinephrine (100nM) or with cholinergic agonist carbamylcholine (1mM) with and without muscarinic antagonist atropine (10µM). Incubations were made also with a β adrenergic agonist isoproterenol (10µM), with and without yohimbine (10µM). 9. Results: Rats submitted to protein restriction during lactation presented their body weight reduced in 23% and their periepididymal and retroperitoneal fat pads in 30 and 49%, respectively, all when compared to NP rats. Fasting insulinemia was 41% lower in the LP rats though there were no significant differences in the fasting glycemia. Protein undernutrition provoked intolerance to glucose and hypoinsulinemia during ivgtt. LP animals presented I (calculated from the area under the curve) 31% lower than NP rats (p<0.05). Ach affected LP rats, provoking a 64% increase in their I, while increasing only 18% in the NP animals. Atr affected only NP animals, reducing I (AUC) by 22% (p<0.05). Oxy reduced I by 25% only in NP rats. On the other hand, yoh increased I by 65% in LP and only 32% in NP (p<0.05). In islets, carbamylcholine increased insulin secretion by 311% in the LP rats and 594% in the NP ones (p<0.05). Epinephrine inhibited secretion in the same rate for both groups. Isoproterenol increased secretion by 70% in LP and only 35% in NP (p<0.05). 10. Conclusions: Perinatal protein undernutrition induces changes in metabolism which remain during adult life. Among the alterations is low weight and hypoinsulinemia. Pancreatic islets from LP animals secrete less insulin under glucose stimulus both in vivo and in vitro. Results suggest that the regulation of insulin secretion is impaired, not only regarding glucose control as well as the insulinotropic effects modulated by the SNA in adult rats who suffered from protein underutrition during part of their lactation period.