CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FENOTÍPICA DE ISOLADOS MONOUREDINIAIS DE Phakopsora pachyrhizi

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1 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FENOTÍPICA DE ISOLADOS MONOUREDINIAIS DE Phakopsora pachyrhizi Heloisa Cerri de Souza (PIBIC/Fundação Araucária), Larissa de Assis Carretts, Henrique Spaulonci Silveira, Gabriela Rastelli Bermejo, Fernanda Machado Castanho, Profa. Dra. Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho, helocsouza@hotmail.com Universidade Estadual do Norte do Paraná/ Luiz Meneghel Genética - Genética Molecular Palavras-chave: FAS, isolados monourediniais, AFLP Resumo A ferrugem asiática causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi leva ao amarelecimento das folhas, diminuição da atividade fotossintética e ciclo da planta, consequentemente causando danos à produção. A sua disseminação ocorre por meio de esporos que são facilmente carregados pelo vento. Os principais métodos de controle da doença são a aplicação de fungicidas (que aumenta o custo da produção), estabelecimento de períodos de vazio sanitário e o uso de cultivares menos sensíveis a doença. O objetivo deste trabalho foi conhecer a variabilidade genética entre isolados monourediniais da ferrugem asiática da soja obtidos a partir de diversas regiões do país. Foram utilizados marcadores SSR e AFLP. Os primers SSR não apresentaram polimorfismo significativo entre os 6 isolados avaliados, já os marcadores AFLP foram eficientes em detectar diversidade genética entre os isolados, revelando baixos índices de similaridade. O isolado LGO112 foi o mais distante geneticamente dos demais, apresentando o maior número de marcas exclusivas, o que resultou na formação de um cluster isolado no dendograma. Não foi possível detectar correlação entre a distância genética e a distância geográfica dos isolados. Introdução A soja (Glycine max L. Merril), originária da Ásia, é a cultura economicamente mais importante no Brasil que atualmente ocupa o ranking de segundo maior produtor mundial desta leguminosa. A soja é principalmente ameaçada pela ferrugem asiática, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. A ferrugem asiática da soja (FAS) leva ao amarelecimento das folhas, diminuição da atividade fotossintética com consequente desfolha e não formação completa dos grãos, o que acaba conferindo perdas na produtividade que podem variar de 10% a 80% (Embrapasoja 2013). O controle da ferrugem é efetuado, através do uso de fungicidas e cultivos de genótipos menos suscetíveis a doença, juntamente com o vazio sanitário que corresponde a um período de 60 a 90 dias. Tais medidas, entretanto, não tem sido suficientes para o controle da doença principalmente pelo fato de que os genes relacionados à resistência a FAS na soja não conferem

2 resistência ampla. Os genes de resistência mapeados até o momento, Rpp1 a Rpp6 (Bromfield e Hartwig, 1980; Mclean e Byth, 1980; Hartwig e Bromfield, 1983; Hartwig, 1986; Garcia et al., 2012), conferem diferentes tipos de resposta quando a planta é exposta a isolados ou genótipos distintos do fungo. A planta é imune quando não apresenta lesões visíveis, resistente quando apresentam lesões marrom-avermelhadas (reações tipo RB, reddish-brown) caracterizadas pela formação de urédias com nenhum ou poucos esporos; e suscetível quando possui lesões bronzeadas (reações tipo TAN), característica de lesões com número maior de urédias e maior nível de esporulação que lesões RB (Miles et al., 2011). Uma vez obtidos, os isolados do patógeno podem ser molecularmente caracterizados em função de polimorfismos genéticos relacionados a marcadores moleculares dominantes (AFLP) ou codominantes (microssatélite). Os trabalhos que objetivaram estudar a variabilidade genética do fungo P. pachyrhizi utilizaram isolados de outros países ou apenas populações de esporos coletados no campo com marcadores microssatélites. Nesse trabalho utilizamos isolados de diversas regiões do Brasil para que pudéssemos representar a variabilidade genética e fenotípica atualmente encontrada nas lavouras brasileiras. Material e métodos O trabalho foi conduzido no laboratório de Biotecnologia da Universidade Estadual Norte do Paraná. Os isolados de P. pachyrhizi e as sementes de soja foram cedidos pela EMBRAPA- Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, e foram multiplicados em câmara de crescimento e casa de vegetação, respectivamente. Os isolados monourediniais foram multiplicados a fim de se obter quantidade suficiente de esporos para estudos posteriores. Para tanto, folhas sadias do genótipo suscetível Embrapa 48 foram utilizadas. As folhas foram previamente coletadas e lavadas em água corrente para retirada de impurezas e colocadas em recipiente com água destilada por 1 hora para reidratação. Finalmente, essa folhas foram transferidas individualmente com a face abaxial para cima em placas de Petri contendo meio ágar-água 1% autoclavado. A inoculação de esporos aconteceu com auxílio de uma alça de platina. As placas foram vedadas com plástico filme e mantidas em câmaras de crescimento de foto período de 16 horas em temperaturas de aproximadamente 25ºC, e mantidas no escuro por aproximadamente 12 horas para facilitar a germinação do esporo. Após 15 dias, novos esporos foram coletados com auxílio de um pincel em papel sulfite e transferidos para microtubos de 2mL, armazenados em freezer a 0 C para a preservação do material coletado. Após a coleta as folhas foram novamente mantidas, por mais dois dias, em câmara de crescimento para novo ciclo de esporulação e posterior coleta de esporos. Para extração do DNA genômico dos esporos foi realizada de acordo com protocolo proposto por Delaporta et al. (1983). O material foi ressuspendido em 30µL de tampão TE (1M Tris HCl; 0,5M EDTA) acrescido de RNAs e A (40µg/mL) e incubados a 37ºC por pelo menos 30 minutos. As amostras foram armazenadas em freezer -20ºC. Após a extração, o DNA foi quantificado em espectrofotômetro e sua integridade verificada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida 0,8%. Por fim, as amostras foram diluídas para se obter uma concentração final de 50 g/ L por amostra. Para avaliar a integridade do DNA foi realizado eletroforese em gel de agarose 1% a 100Vcm -1 por noventa minutos e observado em transluminador UV. A quantificação foi realizada a partir de espectrofotômetro da marca Marcone e modelo genova e o DNA foi diluído em TE para concentração 10ng/µl.

3 O AFLP foi obtido seguindo os métodos laboratoriais do laboratório de biotecnologia da UENP-CLM, onde o DNA após ser digerido foi realizada a reação de ligação para o acoplamento dos adaptadores, dando sequência ao pré-seletivo selecionando fragmentos específicos, onde foi diluído para 5 vezes para realização do seletivo. No seletivo, os pares de primers (Eco e Mse) se ligam a continuação do pré-seletivo (adaptador + base pré-seletivo+ base Eco/Mse). Para amplificação dos primers de microssatélites foram utilizados os seguintes reagentes para formação do mix:mgcl 2mM= 0,5µL, dntp 0,2mM= 0,5µL, taq =0,2µL, DNA=1µL Primer F= volume do primer varia de acordo com recomendações do fabricante Primer R= volume do primer varia de acordo com recomendações do fabricante Tampão =1,25 µl H2O= o necessário para gerar um volume final de 12,5 µl Posteriormente as amostras foram colocadas em termociclador com a seguinte programação 95ºC durante 30 segundos, ciclos, 72ºC- 60segundos e 72ºC -10minutos Após amplificação as amostras foram colocadas em gel de poliacrilamida 0,8%. A corrida foi feita em cuba vertical de eletroforese durante 4 horas. O gel foi corado de acordo com a bateria de coloração a seguir: 100ml de fixador durante 3 minutos acrescentar mais 1000µL de nitrato de prata por mais 3 minutos, enxaguar, acrescentar 100ml de relevador com 1000 µl de formaldeído por aproximadamente 8 minutos enxaguar, colocar 100ml de fixador por 1 minuto, enxaguar e colocar o gel secar embalado em celofane. Os resultados foram analisados com base em presença ou ausência das bandas no gel. Foram utilizados 19 primers de microssatélite desenvolvidos para ferrugem asiática da soja, seguindo especificações do artigo Desenvolvimento de marcador molecular SSR para o fungo da ferrugem da soja Phakopsora pachyrhizi (Sharon et al 2008). A partir do dendrograma, é possível observar a diversidade genética. Resultados e Discussão A partir dos 19 primer s SSR desenvolvidos por Sharon et al. (2008), 4 não resultaram na amplificação de marcas e os demais não apresentaram polimorfismo significativo entre os 6 isolados. Os resultados obtidos com o marcador molecular AFLP mostram, com base no dendrograma (Figura 1), que há grande diversidade genética entre os isolados, principalmente observada pelo índice de similaridade entre os isolados LCA4A12 e LRV212 de 69%. O isolado LGO112 apresentou 30 bandas exclusivas, é o mais distante geneticamente e formou uma chave única fora do cluster dos demais isolados representando, portanto uma possível fonte importante de inoculo aos programas voltados ao desenvolvimento de cultivares destinadas a região de Goiás. De tal forma o trabalho contribuiu para demonstrar a diversidade genética entre os isolados de diversas regiões do Brasil e demostrando uma provável fonte de inoculo vista no cluster mais distante representado pela região de Goiás e mais próximos no cluster entre as regiões de Passo Fundo, Conceição das Alagoas, São Lucas do Rio Verde e Campo Grande além do genótipo de população.

4 Figura 1: Dendrograma: analises de marcadores moleculares AFLP Conclusões Os isolados monourediniais de FAS avaliados nesse trabalho apresentam grande variabilidade genética entre si o que indica que possivelmente apresentarão respostas distintas quando inoculados em diferentes genótipos de soja. Espera-se assim, ser possível utilizar os materiais geneticamente mais distintos como fonte de inóculo para os programas de melhoramento que objetivam o desenvolvimento de cultivares resistentes à doença. Para tanto, ainda será necessária a fenotipagem de cada interação: soja-fas, o que permitirá maior clareza na escolha dos isolados como fonte de inóculo. Agradecimentos Agradeço primeiramente ao CNPq pela bolsa de iniciação científica, à minha orientadora Profa. Dra. Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho pelo apoio e auxílio. A EMBRAPA - Soja por ceder material, aos meus pais Roseli e Israel por toda ajuda, compreensão, paciência e amor incondicional e aos amigos pela força e amizade. Referências ANDERSON, S.J.; STONE, C.L.; POSADA-BUITRAGO, M.L.; BOORE, J.L.; NEELAM, B.A; STEPHENS, R.M.; LUSTER, D.G.; FREDERICK. R.D.; PEDLEY, K.F.Development of simple sequence repeat markers for the soybean rust fungus, Phakopsora pachyrhizi.molecular Ecology Resources, 8: , ASSUNÇAO, M. S.; GODOI, C. V.; GUERZONI, R. A.; NUNES JUNIOR, J.; MOREIRA, C. T.; MONTEIRO, P. M. F. O.; SEII, A. H.; SILVA, L. H.C.P.; SILVA, L. O.SILVA, S, A,; NUNES SOBRINHO, J, B.; SOUZA, R. P.; SOUZA, I. M.; YORINORI, J. T. Ferrugem da soja: evolução, sintomas, danos e controle. goiânia: ctpa, p BEDIN, C.; MENDES, B. L.; TRECENTE, C. V.; LOPES, L. B. R.; BOSQUÊ, G. G.; Técnicas disponíveis para o controle da ferrugem asiática na cultura da soja. Faculdade de agronomia e engenharia florestal de garça, Garça. 2007

5 BROMFIELD, K.R.; MELCHING, J.S.; KINGSOLVER, C.H. Virulence and aggressiveness of Phakopsora pachyrhizi isolates causing soybean rust. Phytopathology, 70:17-21, DARBEN, M. L. Obtenção e caracterização molecular e fenotípica de isolados monourediniais de Phakopsora pachyrhizi coletados em diferentes regiões do Brasil f. tese (Doutorado em Genética e Melhoramento) Universidade Estadual de Maringá, Maringá EMBRAPA-Tecnologia de produção de soja Região central do Brasil Sistemas de produção/ Embrapa Soja, ISSN ;n.15, HARTWIG, E.E.; BROMFIELD, K.R. Relationships among three genes conferring specific resistance to rust in soybeans. Crop Science, 23: , HARTWIG, E.E. Identification of a fourth major gene conferring resistance to soybean rust. Crop Science, 26: , KAWUKI, R.S.; ADIPALA, E.; TUKAMUHABWA, P. Yield loss associated with soya bean rust (Phakopsora pachyrhizi Syd.) in Uganda. Journal of Phytopathology, v.151, p.7-12, 2003 MCLEAN, R.J.; BYTH, D.E. Inheritance of resistance to rust (Phakopsora pachyrhizi) in soybeans. Australian Journal of Agricultural Research, 31: , MAPA-ministério da agricultura pecuária e abastecimento ( Acesso em junho de 2015 MILES. M.R.; BONDE, M.R.; NESTER. S.E.; BERNER, D.K.; FREDERICK, R.D. Characterizing resistance to Phakopsora pachyrhizi in soybean. Plant Disease, 95: , MORALES, A.M.A.P.; PEREIRA, A.A.; BRITO JUNIOR, S.L.; ROMERO, C.C.; BORÉM, A.; MARCELINO-GUIMARÃES, F.C.; GRAHAM, M.A.; ABDELNOOR, R. V. Caracterização molecular e microscópica da resistência à ferrugem asiática da soja mediada pelo gene Rpp4. MUELLER, U.G.; WOLFENBARGER, L.L.R. Genotyping and fingerprinting. Trends in Ecology & Evolution, Cambridge, v. 14, n 10, p , 1999 SHARON J. ANDERSON; CHRISTINE L. STONE; MARTHA LUCIA POSADA-BUITRAGO; JEFFREY L. BOORE; BEENA A. NEELAM; ROBERT M. STEPHENS; DOUGLAS G. LUSTER; REID D. FREDERICK; ANDKERRY F. PEDLEY. Development of simple sequence repeat markers for the soybean rust fungus, Phakopsora pachyrhizi , GARCIA, A,; CALVO, E.S; KIIHL, R.A.S.; HARADA, A.; HIRROMOTO,DM.; VIEIRA, L.G.E. Molecular mapping of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) resistance genes: discovery of a novel locus and alleles. Theoretical and Appliend Genetics, New York, v. 117, n. 4, p , DELLAPORTA, S. L; WOOD, J. & HICKS. J. B. A plant minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter 1 (4):