VERIFICAÇÃO DO PARENTESCO EM PROGRAMAS DE MELHORAMENTO ANIMAL

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1 Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, VERIFICAÇÃO DO PARENTESCO EM PROGRAMAS DE MELHORAMENTO ANIMAL F. E. Madalena Departamento de Zootecnia Escola de Veterinária da UFMG Caixa Postal Belo Horizonte, MG SUMÁRIO 1. Introdução, Testes de parentesco, Tipagem de microssatélites, Lotes com vários reprodutores, Custos, Ganho genético, Benefícios econômicos, Testes por amostragem, Conclusões, Referências bibliográficas, INTRODUÇÃO Segundo Ron et al. (1996), os erros na paternidade de bovinos em diferentes países tem variado de 4 a 23% (Alemanha), 5 a 16% (Dinamarca), 8 a 16% (URSS), 1,3% (reino Unido), 8 a 20% (Irlanda) e 12% (Holanda). Taylor (1997) situou os erros de paternidade nos EUA em 5 a 10%. No Brasil, A. Rosa e F. Meirelles (comunicação pessoal) encontraram 15% de erro em amostra aleatória de Nelore. As causas dos erros de parentesco estão em erros de anotação, inseminação com mais de um reprodutor, touros ou vacas pulando cercas, troca de bezerros etc., além de possíveis causas intencionais. Os métodos modernos de avaliação genética, baseados no modelo animal (p.ex. Henderson, 1984), fazem uso das relações de parentesco entre os indivíduos registrados na raça ou na população em questão, visando aproveitar as informações do maior número possível de parentes do indivíduo avaliado, lograndose dessa forma, estimar o valor genético com muito maior acurácia que com os métodos anteriores. As vantagens do modelo animal, entretanto, ficam obviamente comprometidas se as 57

2 Madalena, Verificação de parentesco... informações sobre os parentescos são incorretas, levando a vieses na avaliação, em caso de erros sistemáticos ou deliberados, ou a perda de exatidão, em caso de erros aleatórios. Como a avaliação genética é a base de qualquer programa de seleção, os erros nas genealogias podem comprometer a eficiência do programa e afetar a sua credibilidade e valor comercial. Para evitar ou diminuir esse problema, em vários países vem se realizando ou estudando a realização de testes rotineiros de parentesco utilizando marcadores moleculares do DNA. Visando obter subsídios a respeito, colocamos recentemente, no Animal Genetics Discussion Group, na Internet, pergunta sobre os testes em andamento em diferentes países e sua viabilidade econômica, com cujas respostas e outras informações elaboramos este artigo, cujo objetivo é apenas o de levantar o assunto para discussão, face aos desenvolvimentos recentes, e salientar os pontos de pesquisa necessários no Brasil, mais do que pretender uma revisão exaustiva do tema ou entrar em detalhes das técnicas de laboratório utilizadas. 2. TESTES DE PARENTESCO Os testes de parentesco não provam a paternidade ou maternidade, senão que apenas a excluem, no caso em que o indivíduo não possua nenhum dos alelos presentes no progenitor indagado, como pode ser visto no exemplo da Tab. 1. Tabela 1. Exemplo mostrando os genótipos de dois possíveis pais e de possível mãe de dois indivíduos, para um loco com 4 alelos (x indica presença do alelo correspondente) Alelo Reprodutor 1 Reprodutor 2 Reprodutriz Indivíduo 1 Indivíduo 2 A 1 x x A 2 x x x x A 3 x x x A 4 Fonte: (Vankan & Burns, 1997). Neste exemplo, independentemente do genótipo materno, o indivíduo 2 não poderia ser filho do reprodutor 2, já que não possui nenhum dos marcadores desse reprodutor, o qual, portanto, seria excluído como seu pai. Já o indivíduo 1, poderia ser filho de qualquer um dos dois reprodutores, caso não se conhecesse o genótipo da mãe. Entretanto, se o genótipo da mãe fosse conhecido, o reprodutor 2 seria claramente excluído como pai. Ao se fazer os testes para vários locos diferentes, aumenta-se o número de combinações genéticas diferentes e, portanto, a probabilidade de exclusão dos parentescos errados. Assim, a confiabilidade do teste de 58

3 Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, parentesco mede-se pela sua probabilidade de exclusão (PE) do parentesco errado. Num teste de paternidade para reprodutor acasalado ao acaso, a PE de um único sistema polimórfico é PE = 1 ( 1 p i p j ) 2, onde p i e p j são as freqüências dos alelos i e j na população. Para um teste combinando n locos, a probabilidade de exclusão combinada (PEC) aumenta para PEC = 1 Π n (1-PE k ) onde PE k se refere ao k ésimo loco testado (Ron et al., 1996). Os testes de parentesco foram originalmente desenvolvidos com base nos grupos sangüíneos e polimorfismos bioquímicos. O PEC desses sistemas é similar ao PEC com os polimorfismos do DNA utilizados atualmente, como se discute abaixo, mas, como existe em todo o mundo um intenso esforço de pesquisa de DNA, é de se esperar um aumento do número de marcadores moleculares disponíveis para os testes. Por outra parte, a caracterização dos marcadores moleculares não implica em relações de dominância, sendo possível detectar os heterozigotos e, também, pode-se esperar redução no custo futuro dos testes com DNA que, por estes motivos tendem a prevalecer, principalmente naquelas espécies em que não existiam testes de grupos sangüíneos em grande escala. A técnica geralmente aceita para testes de parentesco baseados no DNA utiliza a amplificação de microssatélites através da reação em cadeia da polimerase (PCR) (Ron et al, 1996). Os microssatélites são elementos repetitivos de poucos tetranucleotídios que apresentam alto grau de polimorfismo. Eles podem ser multiplexados, isto é, amplificados simultaneamente, com procedimentos cada vez mais automatizados, e com tendência à redução dos custos. Bernoco et al. (1997) discutiram as vantagens e inconvenientes dos testes baseados em grupos sangüíneos e em polimorfismos do DNA. Trabalhando com uma grande amostra de 4800 Quarter Horse, Bowling et al. (1997) verificaram que a probabilidade de exclusão, testando-se para 15 locos de grupos sangüíneos, foi de 97,3%, similar à PE obtida testando-se 11 locos de microssatélites (98,2%). Validaram, assim, a tipagem de DNA que, segundo estes autores, tem a vantagem de poder facilmente atingir ainda maior eficiência, acrescentando-se novos locos nos casos duvidosos. Eles mostraram também que as falsas exclusões, devidas a raros casos de mutação ou erros de duplicação durante a tipagem do DNA, podiam ser evitadas baseando a exclusão em pelo menos dois locos. A freqüência de mutação dos microssatélites tem sido estimada em 10-3 por loco por gameta por geração, e a freqüência de erros de duplicação em 10-4 (Ron et al., 1996), de forma que a exclusão do parentesco com base em dois microssatélites é extremamente confiável. Vankam & Burns (1997) comunicaram que com uma bateria de 11 locos de microssatélites, tipando pais, mães e filhos, em 12 raças de bovinos, 59

4 Madalena, Verificação de parentesco... detectaram-se entre 98,5% (Polled Hereford) e 99,9% (Brahman) dos parentescos errados. Quando apenas pai e filho eram tipados, a eficiência caía para 88 a 99%, dependendo da raça. Num rebanho de seis carneiros meioirmãos, acasalados ao acaso com 92 ovelhas, Parsons et al. (1997) identificaram os pais de 85% das progênies e as mães de 40%, através da tipagem de todos os animais para 12 locos de microssatélites. 3. TIPAGEM DE MICROSSATÉLITES Para escolher quais microssatélites incluir no teste, são necessários estudos para caracterizar a variação existente na população de interesse. Por exemplo, Ron et al. (1996) descreveram os resultados da tipagem de 10 locos de microssatélites na raça Holstein Israelense (Tab. 2). Tabela 2. Freqüências dos alelos em cada um de 10 locos de microssatélites no gado Holstein Israelense. Microssat Cromoss Alelo N 1 élite omo D2S ,30 0,20 0,19 0,12 0,06 0,04 0,04 0,01 D2S ,38 0,20 0,18 0,09 0,09 0,03 0,03 D5S ,30 0,28 0,19 0,13 0,06 0,02 0,02 D7S ,45 0,24 0,15 0,10 0,02 0,02 0,02 D9S ,36 0,20 0,15 0,15 0,08 0,05 0,01 BRN ,44 0,22 0,08 0,08 0,06 0,04 0,04 0,02 0,02 HBB ,27 0,17 0,16 0,12 0,11 0,09 0,08 D18S ,47 0,20 0,17 0,13 0,03 D21S ,41 0,15 0,12 0,09 0,08 0,05 0,05 0,03 0,01 0,01 D21S ,58 0,16 0,14 0,12 CYP ,41 0,14 0,09 0,07 0,07 0,07 0,05 0,04 0,02 0,02 0,02 D25S ,38 0,36 0,18 0,04 0,02 0,02 N = Número de cromossomos. 1 Alelos em cada loco numerados da maior para a menor freqüência. Fonte: Ron et al. (1996). No estudo de Parsons et al. (1997), com Merino Australiano, 12 locos de microssatélites tiveram um conteúdo de informação polimórfica (PIC) variando de 0,49 a 0,87, considerado adequado para os testes de parentesco. Estes autores comunicaram a existência de um 13 o microssatélite (BM415) com uma significativa redução na freqüência dos heterozigotos que atribuíram à não amplificação de um alelo, de forma que o microssatélite não pôde ser utilizado para os testes de parentesco, salientando os autores, em conseqüência, a importância de se checar possíveis desvios das freqüências observadas com respeito às esperadas no equilíbrio de Hardy- Weimberg. 60

5 Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, LOTES COM VÁRIOS REPRODUTORES Os testes de parentesco são particularmente úteis no caso de monta natural não controlada e lotes com vários reprodutores, uma prática comum em gado de corte e outros ruminantes, usada para facilitar o manejo reprodutivo em lugar da inseminação artificial ou da monta controlada. A probabilidade de exclusão diminui com o número de reprodutores no lote, como pode ser visto na Tab. 3, que mostra a PEC esperada com 11 microssatélites, em Bos indicus, na Austrália. Vankan & Burns (1997) sugeriram que os grupos de reprodutores em cada lote fossem constituídos considerando os seus genótipos, de forma a incluir, na medida do possível, reprodutores que pudessem ser discriminados. Eles apresentaram resultados práticos confirmando as probabilidades teóricas em 16 rebanhos Santa Gertrudes e Brahman, com lotes variando de 5 a 34 touros (Tab. 4). Como mostrado na tabela, a PEC, se necessário, podia ser aumentada acrescentando-se marcadores tipados. Tabela 3. Probabilidades teóricas de exclusão de paternidade errada em lotes de vacas acasaladas com vários touros não aparentados (sendo tipados somente pais e filhos, mas não as mães). N o de touros no lote Probabilidade de exclusão (%) Fonte: De Vankan & Burns (1997) Tabela 4. Resultados de testes de paternidade em grupos com múltiplos reprodutores na Austrália, testando-se somente os pais e os bezerros. Rebanho Raça Bezerro Touro no lote Paternidade resolvida Com 11 marcadores Com 1 ou 2 marcadores extras N N % % 1 SG ,0 2 SG ,0 3 SG ,4 4 SG ,2 5 SG ,6 98,5 6 SG ,8 100,0 7 SG ,0 8 B ,1 98,3 9 B ,3 100,0 10 B ,5 11 B ,0 99,4 12 B ,1 97,1 13 B ,0 14 B ,5 99,2 15 B ,5 97,1 16 B ,7 95,5 61

6 Madalena, Verificação de parentesco... SG = Santa Gertrudes, B = Brahman Fonte: De Vankan & Burns (1997) Entretanto, Vankan & Burns (1997) encontraram na maioria dos rebanhos casos de bezerros cujos genótipos não correspondiam a nenhum dos touros do lote de acasalamento, o que atribuíram a algumas vacas já estarem prenhes de outros touros ou a touros ou vacas pulando cercas. Por exemplo, no rebanho 15, de 244 vacas acasaladas com um grupo de 16 touros, houve 5,4% de bezerros que não podiam ser filhos de nenhum dos 16. Porém, quando os outros 18 touros existentes na propriedade foram tipados, todos os bezerros puderam ser alocados a um pai. 5. CUSTOS Segundo Taylor (1997), o método de melhor custo/benefício para tipagem de DNA é o de sistemas multiplexados de microssatélites. Ron et al. (1996) indicaram o custo de US$5 de cada tipagem por microssatélite, em Israel. Barnett et al. (1997) indicaram o custo de US$16 por ovino na Austrália. Long (1997) comunicou que a organização Bell Ranch realiza anualmente genotipagem dos touros e novilhas de reposição em seu programa de compostos, objetivando identificar parentesco no rebanho em sistema de múltiplos touros, com custo de US$25 por animal (que aumenta nos casos duvidosos em que deve ser usado maior número de marcadores). Trus (1997) indicou que, no Canadá, os testes em cavalos custam US$39 por animal e em outras espécies, US$21 ou mais. Um dos componentes importantes do custo dos testes é a tomada de amostras de material para extrair o DNA. O CSIRO, da Austrália, que desenvolve estudos para baratear esses testes, verificou que as amostras de sangue de ovinos colhidas em papel de filtro eram tão eficientes para a extração e amplificação do DNA quanto as amostras colhidas em vacutainers ou de tecidos, sendo que as primeiras podiam ser facilmente enviadas ao laboratório (até pelo correio) e estocadas sem refrigeração por alguns meses (Demeny et al., 1997). Além do sangue, podem ser usados outros materiais biológicos, como sêmen e folículos pilosos. 6. GANHO GENÉTICO Van Vleck (1970a) indicou que a covariância mãe-filha é reduzida numa proporção p, no caso de freqüência de erros de parentesco = p, enquanto que a herdabilidade (h 2 ) é reduzida em [n(1 p) 2 +p 1]/(n 1), onde n é o número de filhas por reprodutor. A acurácia do teste de progênie (Van Vleck, 1970b).também é reduzida para r 2 = [(1-p) 2 n h 2 ]/{4+(1-p)[(1-p)n-1]h 2 } Gelderman et al. (1986) mostraram que além da redução na acurácia do valor genético estimado dos touros, perda de ganho genético decorre também da 62

7 Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, diminuição do diferencial de seleção, resultante da seleção de reprodutores errados. Eles apresentaram expressões para o cálculo da perda de ganho genético na seleção de touros por teste de progênie, a qual aumentava com maior taxa de erro de paternidade (p) e menor herdabilidade da característica selecionada (Tab. 5). Tabela 5. Redução percentual no diferencial de seleção genético dos touros, devido a erros de paternidade, em programa de teste de progênie de 300 touros avaliados com 80 filhas cada um. Freqüência dos erros de paternidade Herdabilidade 5% 15% 25% % 0, , , Fonte: Gelderman et al. (1986) Num teste de progênie, os erros de parentesco tem o efeito de nivelar os reprodutores, já que o valor genético dos melhores diminui e o valor genético dos piores aumenta. Numa verificação do parentesco das progênies de 15 touros na Alemanha, Gelderman et al. (1986) encontraram que a média de produção de leite de 1062 filhas com paternidade não excluída foi 5099kg, enquanto que 159 filhas excluídas tinham média de 4933kg (P<0,05). 7. BENEFÍCIOS ECONÔMICOS Os benefícios da melhor identificação dos progenitores decorrem principalmente do maior ganho genético logrado. Assim, uma forma de se quantificar esses benefícios é estimar o valor econômico das perdas no ganho genético devido aos erros de parentesco, que pode então ser comparado com o custo adicional. Ron et al. (1996) estimaram o valor presente líquido do investimento em teste de paternidade das filhas usadas para testar os touros jovens, para a situação de Israel, com 100 mil vacas na população e 50 touros testados anualmente, com 100 filhas cada. Com base nos resultados de Gelderman et al. (1986), eles estimaram o ganho genético adicional, decorrente da verificação da paternidade, em 5 kg/ano, com lucro de US$ 0,10/kg. Mesmo tendo aquele país uma taxa de erro de paternidade bastante baixa (5%), o lucro cumulativo descontado num horizonte de 20 anos seria de US$ 2,4 milhões de dólares. O custo da tipagem foi estimado em US$ 75 mil por ano, num programa de teste de três microssatélites por filha, com custo de US$ 15. A probabilidade de exclusão combinada (PEC) foi de 0,85, indicando que 15% dos erros ficariam não 63

8 Madalena, Verificação de parentesco... detectados (ou 0,75% do total de filhas). Entretanto, as vantagens da tipagem seriam ainda maiores no caso da seleção com modelo animal e não apenas com o teste de progênie. Por outra parte, os autores indicam que a PEC poderia aumentar para mais de 90%, escolhendose os locos especificamente para cada reprodutor. Assim, os autores concluem que a tipagem está economicamente justificada, estando Israel em vias de implementá-la no seu programa nacional de melhoramento de gado de leite (I.R. Weller, comunicação pessoal). Na Austrália, onde o CSIRO está estudando maneiras de reduzir o custo para a implementação da tipagem rotineira de DNA (O. Mayo, comunicação pessoal), Barnett et al.(1997) estudaram o benefício econômico da tipagem com uma abordagem diferente da de Ron et al. (1996), descrita acima. Eles consideraram o preço maior que os criadores de Merino receberiam pelos carneiros que tivessem genealogia com DNA, 5% a mais para os carneiros vendidos por até A$ 1000, e 10% a mais para os carneiros com preço acima desse valor. O programa proposto incluía tipagem inicial de todos os carneiros e ovelhas do rebanho e tipagem a cada ano de todos os carneiros (mas não das fêmeas) incorporados posteriormente. Consideraram ainda diferentes eficiências de seleção, levando em conta a ênfase que o criador dava à seleção visual vs. um índice de peso do velo e menor diâmetro da fibra, variando essa eficiência de 40 a 100%. Estimaram então, sob certas suposições, o ponto de equilíbrio econômico para a verificação de parentesco, a partir do seu valor presente líquido, num horizonte de 10 anos. Esse ponto de equilíbrio era maior com preços de venda mais altos e com maior ênfase na seleção objetiva. Assim, por exemplo, os criadores que vendessem seus carneiros por A$1000 poderiam pagar até A$15,36 pela tipagem de cada animal, enquanto os que vendesse por A$750 não poderiam pagar mais de A$ 10,45. Com custos de tipagem de A$20 por animal, somente os que vendessem por preços acima de A$1250 teriam lucro, e com custo de A$25 (o custo atual), somente com preços acima de A$1500. Assim, os autores concluem que à medida que os custos da tipagem venham a ser menores no futuro próximo, aquele país assistirá a enormes mudanças nos registros genealógicos no rebanho Merino. 8. TESTES POR AMOSTRAGEM Do ponto de vista de uma raça como um todo, a tipagem rotineira de amostras dos animais registrados, ao causar diminuição na freqüência de erros de genealogia, acarreta benefício econômico decorrente da maior confiabilidade geral na genealogia na raça,. Por exemplo, Bernoco et al. (1997) comunicaram que a freqüência de exclusão de paternidade de garanhões nos EUA, que era de 9 a 10%, caiu para 1 a 2 % após a implantação de testes rotineiros de parentesco naquele país. Gelderman et al. (1986) também comunicaram que, na Alemanha, os criadores de gado não sujeitos a verificação de parentesco incorriam em maior freqüência de exclusão de paternidade que os sujeitos a esses testes. 64

9 Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, No Canadá, muitas associações de criadores aplicam verificação do parentesco junto com o registro. Ha bastante variação no tamanho da amostra dessa verificação, indo de 1 a cada 25 a 1 a cada 1000 animais. Geralmente, a associação requer tipagem ao acaso dos animais quando chega a solicitação do registro, e só nesse momento o criador sabe que seu animal será verificado. Claro que existe também o direito da associação de requerer verificação específica em caso de animais contestados ou duvidosos (Trus, 1997). 9. CONCLUSÕES A tipagem de DNA apresenta-se como uma técnica de grande potencial para verificação de parentesco nos animais domésticos, podendo justificar-se economicamente a implantação de testes rotineiros de verificação, independentemente dos necessários esforços de conscientização para reduzir os erros de parentesco. A verificação do parentesco por amostragem rotineira reduz os erros nos animais registrados. Nos programas de melhoramento é aconselhável a verificação do parentesco de todos os animais cujos dados são utilizados nas avaliações genéticas. No Brasil são necessários estudos sobre a freqüência e as causas dos erros de parentesco, assim como sobre a freqüência dos alelos de microssatélites nas raças locais. 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARNETT, N.L., PURVIS, I.W., STEWART, V.A.M. et al. At what price is DNA pedigreeing cost effective for Merino breeders? In: Conf. Assoc. Adv. Anim. Breed. Genet., , Dubbo. Proceedings... Dubbo: AAABG, p ,. BERNOCO, D., OLIVEIRA, D.A.A., KUABARA, M.Y. Análise de parentesco em cavalos de grupos sangüíneos e polimorfismos bioquímicos à tipagem por DNA. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 21 p , BOWLING, A.T., EGGLESTON-STOTT, M.L., BYRNS, G., CLARK, R.S., DILEANIS, S., WICTUM, E. Validation of microsatellite markers for routine horse parentage testing. Anim. Genet., v. 28 p , DEMENY, D., PARSONS, Y.M., FRANLIN, I., COOPER, D.W. Low cost sampling methods for DNA based testing.. In: Conf. Assoc. Adv. Anim. Breed. Genet., , Dubbo. Proceedings... Dubbo: AAABG, p GELDERMAN, H., PIEPER, U., WEBER, W.E. Effect of misidentification on the estimation of breeding value and heritability in cattle. J. Anim. Sci., v.63 p , HENDERSON, C.R. Applications of linear models in animal breeding. Guelph: Univ. of Guelph, LONG, K. Anim. Genet. Disc. Group. Log., Internet, PARSONS, Y.M., FRICKE, B.L., FLEET, M.R., FRANLIN, I., COOPER, D.W. In: Conf. Assoc. Adv. Anim. Breed. Genet., , Dubbo. Proceedings... Dubbo: AAABG, p RON, M., BLANC, Y., EZRA, E., WELLER, J.I. Misidentification rate in the Israeli dairy cattle population and its implications for genetic improvement. J. Dairy Sci., v. 76, p , TAYLOR, J. Anim. Genet. Disc. Group. Log., Internet,

10 Madalena, Verificação de parentesco... TRUS, D. Anim. Genet. Disc. Group. Log., Internet, VANKAM, D., BURNS, B.M. DNA fingerprinting - How it works and applications for the beef industry.. In: Conf. Assoc. Adv. Anim. Breed. Genet., , Dubbo. Proceedings... Dubbo: AAABG, p , VAN VLECK. L.D. Misidentification in estimating the paternal sib correlation.. J. Dairy Sci., v. 53 p.1469, 1970a. VAN VLECK, L.D. Misidentification and sire evaluation. J. Dairy Sci., v. 53 p. 1697, 1970b. WEBER, J. L., WONG, C. Mutation of human short tandem repeats. Human Mol. Genet., v. 2 p ,