GABRIELA VASCONCELOS RIZO

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1 GABRIELA VASCONCELOS RIZO EFEITOS DA DIETA DE CAFETERIA SOBRE O INTESTINO GROSSO DE RATOS WISTAR Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Maringá 2008

2 GABRIELA VASCONCELOS RIZO EFEITOS DA DIETA DE CAFETERIA SOBRE O INTESTINO GROSSO DE RATOS WISTAR Profa. Dra. Maria Raquel Marçal Natali Orientadora

3 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) R627e Rizo, Gabriela Vasconcelos Efeitos da dieta de cafeteria sobre o intestino grosso de ratos wistar / Gabriela Vasconcelos Rizo. -- Maringá : [s.n.], [9] f. : il. Orientadora : Profa. Dra. Maria Raquel Marçal Natali. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Area de Concentração, Biologia Celular e Molecular, Histologia. 2. Parede intestinal. 3. Analise histológica. 4. Neurônios mientéricos. 5. Dieta cafeteria - Obesidade. 6. Intestino grosso - Dieta. 7. Disgestibilidade. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Cdd 21.ed

4 BIOGRAFIA Gabriela Vasconcelos Rizo, filha de Clovis da Silva Rizo e Mariza Vasconcelos Rizo, nasceu em Joinville, estado de Santa Catarina no dia 02 de março de Em janeiro de 2005 concluiu o curso em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá - UEM - Maringá, Paraná. Em maio de 2006 concluiu o Curso de Pós Graduação em Ciências Biológicas: Bases morfológicas e fisiológicas da integração do organismo com o meio ambiente, em nível Especialização, na Universidade Estadual de Maringá. Em março de 2006 iniciou o Curso de Pós Graduação em Ciências Biológicas (área de concentração - Biologia Celular e Molecular) em nível Mestrado, na Universidade Estadual de Maringá, realizando estudos na área de Neurônios Entéricos. Em agosto de 2008, submeteu-se a banca para obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas.

5 Agradecimentos

6 Agradeço... A Deus, por me permitir estar aqui para realizar meus sonhos e conquistar meus objetivos, me dando a certeza de estar sempre amparada. Aos meus pais Clovis e Mariza e meu irmão Rodrigo, por estarem sempre por perto me dando apoio e servindo de exemplo para minha vida. Ao meu namorado Fernando, por toda a compreensão, apoio e amor que foram imprescindíveis para que eu conquistasse mais essa etapa da minha vida. A minha orientadora Maria Raquel, pela confiança em meu trabalho, pelo exemplo diário de sabedoria e por tudo o que me ensinou durante este período de aprendizado profissional e também pessoal. Aos membros da banca por terem aceitado o convite para contribuírem com sabedoria e experiência para o enriquecimento deste trabalho. Ao programa de Pós-Graduação em Biologia Celular da Universidade Estadual de Maringá, pela oportunidade de realização do curso de mestrado. Às técnicas do Laboratório de Histologia Maria Eurides, Maria dos Anjos e Ana Paula, não só pelo suporte técnico, mas também por serem pessoas tão

7 especiais e terem se tornando indispensáveis para o meu convívio pessoal. Aos meus irmãos de laboratório Luciana Patrícia, Célia, Felipe e Marcelo, por estarem sempre dispostos a ajudar, por alegrarem os dias de trabalho e simplesmente por serem as pessoas especiais que são. Às professoras da Histologia por nunca negarem auxílio e por sempre contribuírem com sua sabedoria e experiência. Ao pessoal do laboratório de fisiologia, em especial à Elizete, Valéria e professora Solange Franzói por todo o apoio necessário à realização deste trabalho. Aos amigos do mestrado, em especial ao Antônio e Eduardo, por tornarem os dias de estudo muito mais agradáveis. Aos amigos de trabalho Cristiano, Eleandro, Carol, Renata, Ken e todos que sempre estiveram prontos a ajudar ou contribuíram para que os dias de trabalho fossem ainda melhores. Aos meus amigos do coração Fernanda, Lut, Thais, Robson e todos os meus amigos que, por estarem sempre presentes, sendo tão importantes para a minha construção pessoal, contribuíram também para que eu conquistasse mais esse objetivo. A todos que, embora não citados, tenham contribuído direta ou

8 indiretamente para a realização deste trabalho.

9 APRESENTAÇÃO Esta dissertação é composta por um artigo científico denominado: Efeitos da dieta de cafeteria sobre o intestino grosso de ratos Wistar. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de acordo com as normas da revista Neurogastroenterology & Motility (ISSN print version).

10 RESUMO GERAL Os atuais índices de obesidade têm avançado de forma alarmante e em âmbito mundial, indicando que aspectos ambientais e comportamentais desempenham um papel primário nesta questão, sendo a porcentagem de energia proveniente de gordura na dieta diária, juntamente com a falta de atividade física, dois importantes fatores para o desenvolvimento da mesma. A instalação do quadro de obesidade repercute sobre diferentes órgãos e sistemas, entre eles, o trato gastrointestinal, o qual é inervado intrinsecamente pelo sistema nervoso entérico, responsável por controlar funções motoras, fluxo sangüíneo local, transportes e secreções da mucosa e modular funções endócrinas e imunes. Destacamos o plexo mioentérico, cujos gânglios se localizam entre as camadas de músculo liso da túnica muscular com atuação direcionada à modulação da motilidade intestinal. Dietas com baixo teor de fibra e elevado teor de gordura, açúcar solúvel e água, como a dieta de cafeteria, proporcionam baixa demanda mecânica na parede intestinal. O objetivo deste trabalho foi avaliar a digestibilidade da dieta de cafeteria, seu efeito sobre a população mioentérica e as características morfométricas da parede do intestino grosso de ratos obesos por ingestão desta dieta. Foram utilizados 16 ratos machos albinos (Rattus norvegicus), linhagem Wistar, a partir dos 70 dias de idade, com peso médio inicial de 271,75 gramas, distribuídos em 2 grupos: Grupo Controle (CO), alimentados com uma dieta padrão para roedores e livre acesso à água e Grupo Cafeteria (CA), alimentados com dieta de cafeteria, através de consumo de chips, chocolate, geléia de mocotó, salsicha, mortadela, paçoca, bolacha recheada e pellets comuns, tendo livre acesso à água e refrigerante. O peso corporal e consumo de líquidos foram monitorados três vezes por semana e o consumo alimentar em gramas e em calorias avaliado diariamente. Além disso, foi estimado o percentual de proteínas, extrato etéreo (lipídios) e fibras presentes na dieta. Amostras de fezes foram coletadas durante os três dias que antecederam a morte dos animais para posterior análise de seu conteúdo e cálculo da digestibilidade aparente. Aos 190 dias, os animais foram pesados, anestesiados e seu comprimento naso-

11 anal foi mensurado para determinação do Índice de Lee [peso corporal 1/3 (g)/comprimento naso-anal (cm) X 1000]. Em seguida, os animais foram laparatomizados e retirados seus tecidos adiposos periepididimal e retroperitonial e o intestino grosso. Os tecidos adiposos foram pesados e o intestino grosso mensurado em seu comprimento, sendo posteriormente isoladas amostras dos colos proximal e distal. Estas amostras foram destinadas aos seguintes protocolos: processamento histológico com inclusão em parafina e coloração com HE (hematoxilina-eosina) para estudo morfométrico das túnicas intestinais; inclusão em historesina e técnica histoquímica PAS (ácido periódico de Schiff) para quantificação das células caliciformes e preparados de membrana corados pelo método de Giemsa para avaliar população mioentérica total. Os resultados obtidos foram submetidos a análise estatística através do software GraphPad Prism e realizado teste t de Student. Os dados do ensaio de digestibilidade foram submetidos à análise de variância e para comparação das médias foi utilizado o teste Student-Newman Keuls (SNK) com nível de significância de 5%. A dieta cafeteria caracterizou-se como hiperlipídica, devido ao teor elevado de extrato etéreo, apresentando também baixos teores de proteína e fibras em relação à dieta controle. A quantidade de fezes excretada pelos animais do grupo CA foi menor do que no grupo CO e com elevado teor lipídico em seu conteúdo. Os valores de digestibilidade demonstraram que os animais do grupo CA tiveram maior aproveitamento dos nutrientes ingeridos, destacando-se que houve uma elevada absorção de lipídios. A obesidade induzida pela dieta cafeteria foi comprovada através do aumento significativo do peso corporal, tecidos adiposos periepididimal e retroperitonial e Índice de Lee nos animais do grupo CA, quando comparados com o grupo CO. A dieta cafeteria exerceu um efeito redutor significativo sobre o comprimento do intestino grosso no grupo CA e diminuição significativa na espessura das túnicas mucosa, muscular e parede total, acompanhada por um número reduzido de células caliciformes tanto no colo proximal quanto no colo distal, quando comparados com o grupo CO. O número de neurônios mioentéricos do intestino grosso não variou significativamente entre os grupos, embora tenha se apresentado mais elevado nos animais do grupo CA. Entretanto, foi observado número significativamente maior de neurônios no colo proximal em relação ao colo distal para o grupo CO.

12 A dieta cafeteria não influenciou a área do corpo celular neuronal, uma vez que a área média dos corpos celulares não variou entre os grupos para ambos os segmentos intestinais e o perfil celular predominante foi de 101 a 200 µm 2. Concluiu-se que o intestino grosso é vulnerável à uma dieta alimentar hiperlipídica, hipoprotéica e com baixo teor de fibras e que, apesar das alterações ocorridas na parede intestinal verificada nos ratos obesos, a população mioentérica foi preservada garantindo a sua ação sobre o controle da função intestinal em níveis aceitáveis para o desenvolvimento dos animais.

13 GENERAL ABSTRACT The current levels of obesity has been advancing worldwide in an alarming way, showing that environmental and behavioral aspects perform a primary role on this issue. The percentage of energy originated from fat on daily diet, along with lack of physical activity, are two important factors to the obesity development. The obesity condition reflects on different organs and systems, like the gastrointestinal tract, which is intrinsically innervated by the enteric nervous system (ENS). The ENS controls motor functions, local blood flow, mucosal transport and secretions, and modulates immune and endocrine functions. We emphasize the myenteric plexus, whose ganglions are localized between the smooth muscle layers of the tunica muscularis, and which performs functions related to the modulation of intestinal motility. Low fiber and high fat, soluble sugar and water diets, like the cafeteria diet, imposes low mechanical demands on the intestinal walls. The aim of this paper was the assessment of digestibility of the cafeteria diet, its effects on myenteric population and on morphometric characteristics of large intestine wall in obese rats. Sixteen male Wistar rats (Rattus norvegicus), with a beginning age of 70 days and grams of average weight, distributed in two groups: Control Group (CO), receiving standard rodent chow and water ad libitum, and Cafeteria Group (CA), receiving hyperlipidic diet, with consumption of foods such as chips, chocolate, marshmallow, sausage, bologna, bread, biscuit, associated with control diet and water and soda ad libitum. Body weight and liquid consumption were measured three times per week, and alimentary consumption, in grams and calories, was evaluated daily. The protein, ether extract (lipids) and fiber percentage in the diet was also estimated. Feces samples were collected during the three days before the end of experiment, to further analysis of their content and calculation of the apparent digestibility. At 190 days of age, the animals were weighed, anesthetized and their nasoanal length were measured to determine the Lee s Index [body weight 1/3 (g)/ nasoanal length (cm) X 1000]. Then, the animals were laparotomized and their retroperitoneal and

14 periepididimal adipose tissue and their large intestine were collected. The adipose tissues were weighed and the length of the large intestine were measured. Samples of the proximal and distal colon were further isolated. These samples were submitted to the following protocols: histologic processing with paraffin inclusion and HE (hematoxylin-eosin) stain for morphometric study of intestinal layers; historesin inclusion and PAS (Periodical Acid Schiff) histochemical technique for goblet cells quantification and whole mount preparations stained by Giemsa technique to evaluate the total myenteric population. The results were analyzed by the Student s t test, using the statistical software GraphPad Prism. The data from the digestibility test were submitted to variance analysis and to compare the means the Student-Newman Keuls (SNK) test were employed, with the significance level set at 5%. The cafeteria diet was characterized as hyperlipidic, due to the high levels of ether extract, with low levels of proteins and fibers when compared to control diet. The amount of feces excreted by animals from CA group were smaller than in CO group, with increased lipidic levels. The digestibility values showed that the CA group animals had better nutrient intake utilization and high lipidic absorption. The obesity induced by the cafeteria diet was verified through the increase (p<0.05) of the following parameters in the CA group animals: body weight, periepididimal and retroperitoneal adipose tissues weight and Lee s Index. The cafeteria diet carried out in the CA group animals a decreasing effect on the large intestine length, on the thickness of tunica mucosa, tunica muscularis and total wall, along with a decreased number of goblets cells (p<0.05), both on the proximal and distal colon. The number of myenteric neurons of the large intestine did not differ significantly between the groups, although it s higher in CA group. In the other hand, a increased number of neurons was observed on the proximal colon in CO group, when compared to distal colon (p<0.05). The cafeteria diet did not change the cellular body area of myenteric neurons, since the cellular body mean area did not differ between the groups for both of the intestinal segments and, in addition to that, the predominant cellular body area was 101 to 200 µm 2. We concluded that the large intestine is vulnerable to a hyperlipidic, hypoproteic and low fiber diet and that, although changes on the intestinal wall were observed in

15 obese rats, the myenteric population was preserved, ensuring the maintenance of intestinal function in acceptable levels to the animals development.