PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA AMBIENTAL MESTRADO

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1 0 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA AMBIENTAL MESTRADO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GESTÃO E TECNOLOGIA AMBIENTAL Marcelo Luis Kronbauer USO DA BIOAUMENTAÇÃO PARA REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL Santa Cruz do Sul 2014

2 1 Marcelo Luis Kronbauer USO DA BIOAUMENTAÇÃO PARA REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Tecnologia Ambiental Mestrado, Área de Concentração em Gestão e Tecnologia Ambiental, Universidade de Santa Cruz do Sul UNISC, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Tecnologia Ambiental. Orientador: Prof. Dr. Diosnel Antonio Rodriguez Lopez Colaboradora: Prof. Dra. Lisianne Brittes Benitez Santa Cruz do Sul 2014

3 2 Marcelo Luis Kronbauer USO DA BIOAUMENTAÇÃO PARA REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL Esta Dissertação foi submetida ao programa de Pós Graduação em Tecnologia Ambiental Mestrado, Área de Concentração Gestão Ambiental e Tecnologia Ambiental, Universidade de Santa Cruz do Sul UNISC, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Tecnologia Ambiental. Dr. Diosnel Antonio Rodriguez Lopez Professor Orientador - UNISC Dra. Lisianne Brittes Benitez Professora Colaboradora UNISC Dr. Rubens Müller Kautzmann Professor Examinador - UNILASALLE Dra. Maria Silvana Aranda Moraes Professora Examinadora UNISC Santa Cruz do Sul 2014

4 3 AGRADECIMENTOS Essa é talvez a ultima parte a ser feita no trabalho. É hora de agradecer a todos aqueles que de uma forma ou outra contribuíram para a realização desse trabalho e foram fundamentais durante a minha estadia na cidade Santa Cruz do Sul. Tenho cada vez mais a certeza de que ninguém passa por nossas vidas á toa, algum objetivo maior o universo tem com essa bifurcação de caminhos. Primeiramente agradeço aos meus maiores incentivadores e motivadores, a minha base nessa vida, minha família. Meus pais Agileu e Lizete, e meu irmão Vinicius. Sem o seu amparo, sei que jamais teria chegado aonde cheguei. A Carla, que pode não saber a dimensão da sua importância durante esse período, mas muitos momentos de desânimo sua presença energizante foi um grande incentivo e motivação. Ao professor Diosnel, pela confiança depositada em mim durante a execução desse trabalho, por todos os conhecimentos e sabedoria repassados. Mas acima de tudo tenho que agradecer pela amizade. A professora Lisianne, pelos conselhos fundamentais para execução desse trabalho e por sua dedicação. A todos os professores do programa de Pós Graduação em Tecnologia Ambiental, pelo conhecimento repassado, e que me auxiliaram de forma direta ou indireta durante o desenvolvimento desse trabalho. Em especial a professora e gremista Adriane. Um agradecimento especial também a Raquel. Agradeço à CAPES - Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - pela concessão da bolsa de estudos. A todos os meus colegas da turma de 2013: Fernanda, Jackson, Leonardo, Marília, e Paulo. Aos colegas e bolsistas CAPES Édila e Fernando. A todos as grandes pessoas que encontrei ou reencontrei no laboratório de engenharia ambiental da UNISC ao longo desse período, com os quais partilhei momentos inesquecíveis, que levarei para sempre na minha vida: Alexandre Straatmann, Felipe Previdi, Jéssica Vasquez, Priscila Mariani e Tiago Wermuth. Não poderia deixar de citar aqui, minhas duas companheiras (manas) de microbiologia Adriana Bee e Valéria Boettcher. Tenham certeza todos vocês, que guardarei com carinho as lembranças desses tempos aqui passados por toda a minha vida.

5 4 RESUMO O presente trabalho teve como objetivo avaliar a bioaumentação com três consórcios de micro-organismos previamente isolados como forma de remediação de um solo contaminado por óleo diesel em escala laboratorial. Os consórcios foram formados a partir de cepas previamente isoladas em um sistema de remediação de solos contaminados. A seleção dos micro-organismos foi realizada com base em sua capacidade de degradação do óleo diesel, estudada por meio do uso do indicador redox 2,6-Diclorofenol-indofenol. O primeiro consórcio, foi composto pelas bactérias B. pumilus, B. subtilis e B. licheniformis. O segundo consórcio, C2, foi composto pelas mesmas bactérias anteriormente citadas e o fungo Aspergillus fumigatus. O terceiro consórcio avaliado, C3 foi formado apenas por dois fungos, Aspergillus fumigatus e Cephalosporium sp. Para verificar a degradação dos hidrocarbonetos, análises físicoquímicas foram realizadas em amostras de solo retiradas periodicamente. Contagens das unidades formadoras de colônias foram realizadas para determinar as populações presentes nos solos inoculados ao longo do período de testes. A atividade respirométrica correspondente foi determinada fazendo-se o uso de respirômetros de Bartha. Os resultados encontrados atestam a eficiência dos fungos para degradar hidrocarbonetos derivados de petróleo, especialmente os compostos de um maior peso molecular. Os consórcios e C2 mostraram boa capacidade de degradação dos BTEX, degradando mais de 95% desses compostos num período de 45 dias. Com relação aos HPA s, os dois consórcios mostraram capacidades semelhantes na degradação desses compostos. O naftaleno foi reduzido em 79% pelos dois consórcios pesquisados. A grande diferença entre o e o C2 foi observada na degradação dos HTP, onde o consórcio C2 se mostrou mais eficiente que o, essa maior eficiência está associada à presença do fungo Aspergillus fumigatus. Assim o C2 removeu (62%) dos HTP, perante os 35% removidos pelo. As maiores taxas e percentuais de degradação foram obtidas através da utilização do consórcio C3, formado exclusivamente por fungos. Este consórcio foi capaz de degradar totalmente os BTEX num prazo de 30 dias. No mesmo período o consórcio C3 degradou 74,7% dos hidrocarbonetos totais de petróleo enquanto e C2 degradaram, respectivamente, 35% e 62% destes compostos. Estes valores mostram que consórcios de fungos são mais efetivos na degradação de moléculas orgânicas de elevado peso molecular, como as contidas no óleo diesel, do que os consórcios bacterianos aqui utilizados. Neste estudo o crescimento bacteriano aumenta rapidamente no período inicial de testes, possivelmente devido à elevada concentração de compostos de baixo peso molecular. Por sua vez, os fungos apresentam um crescimento mais lento, porém, o número de colônias se manteve mais estável ao longo do tempo de ensaio para os microcosmos inoculados com o consórcio C3. Palavras chave: Hidrocarbonetos; Biorremediação; Bioaumentação; Bactérias; Fungos.

6 5 ABSTRACT This study aimed to evaluate the bioaugmentation using three consortia of microorganisms previously isolated as a form of remediation of a soil contaminated by diesel fuel in a laboratory-scale soil. The consortia were formed of strains previously isolated in a system of remediation of contaminated soils. The selection of microorganisms was based on their ability to degrade diesel oil, studied by using the redox indicator 2,6- Dichlorophenol - indophenol. The first consortium was composed of bacteria B. pumilus, B. subtilis and B. licheniformis. The second consortium, C2, was composed of the same aforementioned bacteria and the fungus Aspergillus fumigatus. The third consortium evaluated, C3, was formed only of two fungi, Aspergillus fumigatus and Cephalosporium sp.. To verify the degradation of hydrocarbons, physical and chemical analysis were performed in soil samples collected periodically. Colony forming units were counted in order to determine the populations present in the soil inoculated during the testing period. The corresponding respiration activity was determined by making use of Bartha s respirometers. The results corroborate the efficiency of fungi to degrade hydrocarbons derived from petroleum, especially compounds of higher molecular weight. The consortia and C2 showed good ability of BTEX degradation, degrading more than 95% of these compounds within a period of 45 days. With respect to the HPA s, the two consortia showed similar abilities to degrade these compounds. The naphthalene was reduced by 79 % by the two consortia analyzed. The great difference between and C2 was observed in the degradation of HTP, where the consortium C2 was more efficient than. This greater efficiency is associated with the presence of the fungus Aspergillus fumigatus in the C2 consortium. The C2 consortium removed 62% of HTP, compared to the 35% removed by the consortium. Higher rates and degradation percentages were obtained by using C3 consortium formed exclusively by fungi. This consortium was able to completely degrade BTEX within 30 days. In the same period the C3 degraded 74.7 % of total petroleum hydrocarbons, while and C2 degraded 35% and 62%, respectively. These values show that fungal consortia are more effective in the degradation of organic molecules of high molecular weight such as those contained in the diesel oil, the bacterial consortium used herein. In this study, the bacterial growth increased rapidly during initial tests, possibly due to the high concentration of compounds with low molecular weight. In turn, the fungi showed slower growth, but the number of colonies remained at a fairly constant level during the testing time for the microcosm inoculated with C3 consortia. Keywords: Hydrocarbons, Bioremediation, Bioaugmentation, Bacteria, Fungus.

7 6 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Esquema 1 Estruturas e nomenclatura IUPAC dos HPA s mais frequentes. 20 Esquema 2 Transição tecnológica para o tratamento de solos contaminados. 25 Esquema 3 Esquema representativo do respirômetro de Bartha montado. 41 Esquema 4 Diluição das amostras de solo para estriamento e posterior contagem. 44 Esquema 5 Resumo da metodologia empregada. 45 Fotografia 1 - Solo padronizado utilizado nos testes de bioaumentação. 33 Fotografia 2 Microcosmo onde foi realizada a técnica de bioaumentação. 36 Fotografia 3 Tubos de ensaio com o cultivo de micro-organismos utilizados. 38 Fotografia 4 (A) Preparo das placas para estriamento da cultura de bactérias e fungos em meio sólido com adição de 1,5% de óleo diesel; (B) estriamento das culturas. 38 Fotografia 5 Centrífuga utilizada para o preparo dos inóculos. 39 Fotografia 6 Respirômetros de Bartha em operação. 41 Fotografia 7 (A) Remoção da solução de KOH; (B) Preparo da amostra; (C) titulação com solução de HCl. 42 Gráfico 1 Degradação dos compostos BTEX pelo consórcio. 47 Gráfico 2 Degradação dos compostos BTEX pelo consórcio C2. 48 Gráfico 3 Comparativo da degradação do acenafteno pelos consórcios e C2. 52 Gráfico 4 Resultados da degradação do acenaftileno pelos consórcios e C2. 53 Gráfico 5 Resultados da degradação do antraceno pelos consórcios e C2. 54 Gráfico 6 Resultado da degradação do benzo[a]antraceno pelos consórcios e C2. 55 Gráfico 7 Resultado da degradação do criseno pelos consórcios e C2. 56 Gráfico 8 Resultado da degradação do fenantreno pelos consórcios e C2. 57 Gráfico 9 Comparativo da degradação do fluoranteno pelos consórcios e C2. 58 Gráfico 10 Comparativo da degradação do fluoreno pelos consórcios e C2. 58 Gráfico 11 Comparativo da degradação do naftaleno pelos consórcios e C2. 59 Gráfico 12 Resultado da degradação do pireno pelos consórcios e C2. 61 Gráfico 13 Comportamento dos alcanos n0-n4 65 Gráfico 14 Comportamento da degradação dos alcanos n5 a n9. 67 Gráfico 15 Degradação dos n-alcanos nc20-nc Gráfico 16 Degradação n-alcanos nc25-nc30 69 Gráfico 17 Degradação dos n-alcanos nc31-nc34 69 Gráfico 18 Degradação dos n-alcanos. 70 Gráfico 19 Degradação dos hidrocarbonetos totais de petróleo. 73 Gráfico 20 Degradação dos HRP. 74 Gráfico 21 Degradação da UCM. 75 Gráfico 22 Degradação dos BTEX por meio do consórcio C3. 77 Gráfico 23 Resultado da degradação dos HPA s com dois anéis benzênicos. 78 Gráfico 24 Resultado da degradação dos HPA s com três e quatro anéis benzênicos. 79 Gráfico 26 Degradação dos grupos de n-alcanos pelo consórcio C3 80 Gráfico 27 Degradação do HTP, HRP e UCM pelo consórcio C3. 81 Gráfico 28 Resultados da atividade respirométrica para os consórcios, C2 e C3. 82 Gráfico 29 Monitoramento da população de micro-organismos nos microcosmos. 84

8 7 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Valores de referência para solos contaminados por hidrocarbonetos resolução CONAMA nº Tabela 2 Métodos de remediação de solos contaminados. 25 Tabela 3 Tecnologias de biorremediação. 27 Tabela 4 Características básicas do solo utilizado nos testes. 34 Tabela 5 Micro-organismos utilizados para os consórcios, C2 e C3. 37 Tabela 6 Degradação dos compostos BTEX pelos consórcios e C2. 46 Tabela 7 Análise dos 16 HPA s presentes nos sistemas de bioaumentação. 51 Tabela 8 Degradação dos n-alcanos de n0 a nc36 pelos consórcios e C2. 64 Tabela 9 Soma dos n-alcanos compreendidos entre n0 e nc34 65 Tabela 10 Relação entre hidrocarbonetos biomarcadores nos solos. 72 Tabela 11 Degradação dos HRP, UCM e HTP pelos consórcios e C2. 73

9 8 LISTA DE ABREVIATURAS ANP BTEX CETESB CONAMA CTC DCPIP FEPAM HPA s HRP HTP MCNR MO PCB UCM UFC USEPA Agência Nacional do Petróleo Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e Xilenos Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental do estado de São Paulo Conselho Nacional do Meio Ambiente Capacidade de Troca Catiônica 2,6-diclorofenol indofenol Fundação Estadual de Proteção Ambiental do Rio Grande do Sul Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos Hidrocarbonetos Resolvidos de petróleo Hidrocarbonetos Totais de Petróleo Mistura Complexa não Resolvida Matéria Orgânica Bifenila Policlorada Unresolved Complex Misture Unidade Formadora de Colônia United States Environmental Protection Agency

10 9 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS REFERENCIAL TEÓRICO Contaminação do solo e das águas subterrâneas Características do petróleo e seus derivados Óleo diesel e seus hidrocarbonetos constituintes Legislação pertinente a contaminação de solos e águas subterrâneas por hidrocarbonetos no Brasil Origem da contaminação de hidrocarbonetos derivados de petróleo no ambiente Técnicas de remediação do solo A biorremediação de solos contaminados por hidrocarbonetos derivados de petróleo Bioestimulação Bioaumentação METODOLOGIA Solo utilizado Combustível utilizado na contaminação do solo Montagem dos sistemas de bioaumentação Preparo dos inóculos Testes de biodegradação utilizando o indicador redox DCPIP Testes respirométricos Contagem de unidades formadoras de colônias Operação e monitoramento dos sistemas inoculados Monitoramento da degradação dos hidrocarbonetos presentes no solo RESULTADOS E DISCUSSÃO Degradação dos hidrocarbonetos presentes no solo contaminado com óleo diesel pelos consórcios e C Degradação dos hidrocarbonetos BTEX pelos consórcios e C Degradação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos pelos consórcios e C Degradação dos n-alcanos pelos consórcios e C Relação entre alcanos e alcanos isoprenóides Degradação dos HTP, HRP e UCM pelos consórcios e C

11 Resultados da inoculação do solo com o consórcio C Degradação dos hidrocarbonetos BTEX pelo consórcio C Degradação dos Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos pelo consórcio C Degradação dos n-alcanos pelo consórcio C Degradação de HRP, UCM e HTP pelo consórcio C Resultados dos testes de respirometria pelos consórcios, C2 e C Contagens microbianas nos solos contaminados CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 90

12 11 1. INTRODUÇÃO O petróleo é a principal fonte de energia utilizada atualmente, e como consequência, a liberação de hidrocarbonetos no ambiente é crescente. O diesel é um contaminante de hidrocarbonetos frequentemente relatado (WOLICKA et al., 2009). O transporte e a distribuição de combustíveis derivados de petróleo (óleo diesel, gasolina e outros) representam atividades de elevado risco ambiental principalmente em função da possibilidade de acidentes durante o transporte e de vazamentos devidos a estocagem inadequada. Em eventos como esses, compostos orgânicos de baixa solubilidade em água se dissolvem gradualmente, formando plumas de águas poluídas na direção do fluxo da água, contaminando todo o volume do aquífero (Meira, 2007). Manzochi (2001) acompanhou atividades operacionais de abastecimento e descarga de combustíveis, troca de óleo e lavagem de veículos em um posto de abastecimento de combustíveis de Florianópolis (SC), ele alerta que, carregado pela chuva, o material derramado pode contaminar o solo e a água, atingindo rios, lençóis freáticos e galerias de águas pluviais. Considerando o vazamento de 10 ml por dia, durante um ano, haverá comprometimento de 3 milhões de litros de água. A extensão da contaminação depende do vazamento e das condições do local onde o posto esta instalado, como o tipo de solo da região e as características do material e por onde escoa a água subterrânea. O monitoramento destas contaminações pode ser realizado a partir de análises por cromatografia gasosa. De acordo com Mariano (2008), o óleo diesel contém de 2000 a 4000 hidrocarbonetos, uma mistura complexa de alcanos normais, ramificados e cíclicos e os compostos aromáticos, obtidos a partir da fração do meio-destilado durante a separação de petróleo. Alguns destes compostos podem ser utilizados como indicadores para a avaliação do processo de degradação do óleo diesel. Os compostos poliaromáticos fornecem também uma ferramenta útil para monitorar alterações ambientais. Alguns desses compostos no diesel estão entre os menos afetados pelos processos de intemperismo. Estes compostos semi-voláteis, com uma baixa solubilidade e características recalcitrantes podem persistir durante um longo período de tempo no ambiente. Considerando-se a poluição e toxicidade de hidrocarbonetos de petróleo, o desenvolvimento de uma estratégia eficaz e ambientalmente amigável para reduzi-la ainda permanece um desafio. A crescente pressão dos órgãos reguladores ambientais

13 12 tem motivado as empresas a desenvolver tecnologias limpas, com destaque para a tecnologia de biorremediação (FERNÁNDEZ-LUQUEÑO et al., 2011). Nesse sentido, em função dos frequentes derramamentos, pesquisas na área de biorremediação de solos tem se intensificado. A remediação biológica é considerada mais segura e eficiente, em comparação aos processos físicos e químicos. Ela consiste no emprego de microorganismos, tais como bactérias, fungos filamentosos e leveduras, para transformar os compostos do petróleo em substâncias de baixa toxicidade (FARIAS, 2008). As estratégias de biorremediação incluem: a utilização de micro-organismos autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de outras tecnologias ativas de remediação, conhecida como biorremediação intrínseca ou natural; a adição de agentes estimulantes como nutrientes, oxigênio e surfactantes, processo conhecido como bioestimulação e a inoculação de consórcios microbianos enriquecidos, denominados de bioaumentação (BENTO et al., 2003). A biodegradação de hidrocarbonetos complexos geralmente requer a cooperação de mais de uma espécie. Isto é particularmente verdadeiro em poluentes que são constituídos de muitos compostos diferentes, tais como o petróleo bruto. Microorganismos individuais podem metabolizar apenas uma gama limitada de substratos de hidrocarbonetos. Por outro lado, grupos de micro-organismos (populações mistas) com grandes capacidades enzimáticas são necessárias para viabilizar uma elevada taxa e extensão da biodegradação dos derivados de petróleo (GHAZALI et al., 2004) A bioaumentação tem várias vantagens em relação a outras técnicas. Quando uma população microbiana específica é injetada o processo de degradação pode começar imediatamente, enquanto que, o bioestímulo, por exemplo, envolve um período de latência após a injeção de nutrientes enquanto a população microbiana se propaga. Os nutrientes também não são específicos, de modo que todos os micro-organismos potencialmente se propagam, diluindo o efeito dos nutrientes (ALISI et al., 2009). Tendo em vista a crescente demanda por tecnologias de tratamento eficientes para solos contaminados por hidrocarbonetos derivados de petróleo e o maior enfoque dado aos processos biológicos de remediação, o presente trabalho propõe avaliar o uso da técnica de bioaumentação, avaliando diferentes micro-organismos e sua capacidade de degradar diesel quando associados em consórcios.

14 13 2. OBJETIVOS Objetivo geral Avaliar e comparar a capacidade de degradação de hidrocarbonetos derivados de petróleo de diferentes consórcios microbianos em solos contaminados em escala laboratorial. Objetivos específicos Avaliar a capacidade de degradação de hidrocarbonetos pelos consórcios, formado pelas bactérias B. pumilus, B. subtilis e B. licheniformis, C2 formado pelas bactérias B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis e o fungo Aspergillus fumigatus e C3 formado pelos fungos Aspergillus fumigatus e Cephalosporium sp.. Avaliar a capacidade de degradação pelos consórcios dos compostos aromáticos BTEX e HPA s. Avaliar a capacidade de degradação de hidrocarbonetos pelos consórcios através de concentrações de n-alcanos com cadeias carbônicas entre 10 e 36 carbonos, HTP, HRP e UCM. Avaliar a atividade respirométrica dos micro-organismos durante a degradação. Avaliar o crescimento das populações microbianas inoculadas no solo.

15 14 3. REFERENCIAL TEÓRICO A presente revisão bibliográfica foi embasada em livros e artigos científicos relacionados ao tema de solos, sua contaminação por hidrocarbonetos derivados de petróleo e processos de remediação, com ênfase especialmente na técnica de biorremediação com uso de bioaumentação. 3.1 Contaminação do solo e das águas subterrâneas. Nas últimas décadas o uso da água subterrânea para abastecimento humano tem aumentado significativamente e mostra uma tendência nítida de crescimento. Esse aumento está relacionado aos menores custos de produção da água subterrânea se comparados com outras fontes, uma vez que são menores as necessidades de construção de infraestrutura e tratamento para seu uso (REBOUÇAS, 2006). Porém, o uso das águas subterrâneas está relacionado a uma crescente preocupação com relação aos riscos de contaminação provocada por poluentes de fontes antrópicas. É importante considerar neste ponto que a contaminação das águas subterrâneas está sempre atrelada à contaminação dos solos que contém os aquíferos considerados. De acordo Wendland e Marin (2013) a evolução da contaminação das águas subterrâneas depende da geologia, dos padrões de escoamento da água subterrânea, de processos físicos, químicos e biológicos em escala de poro e molécula. A migração da pluma de contaminação depende, entre outras coisas, da textura dos solos e das propriedades dos contaminantes. Existem as mais variadas definições para solos. De uma forma geral Meurer (2012) define os solos como corpos naturais com características próprias desenvolvidas durante seu processo de formação, o qual é condicionado pelos fatores ambientais com características morfológicas, físicas, químicas e mineralógicas relacionadas aos processos e fatores que lhe deram origem. Beck et al. (2000) definem o solo como um corpo natural da superfície terrestre, constituído de materiais minerais e orgânicos resultantes das interações dos fatores de formação (clima, organismos vivos, material de origem e relevo) através do tempo, contendo matéria viva e em parte modificado pela ação humana, capaz de sustentar plantas, de reter água, de armazenar e transformar resíduos e suportar edificações. Ainda, a composição mineralógica dos solos se reflete diretamente sobre a qualidade e composição química das águas subterrâneas.

16 15 A poluição dos recursos naturais pelas atividades antrópicas não é fato recente, mas como afirmam Liu e Suflita (1993) os avanços na ciência e tecnologia desde a revolução industrial têm permitido aos humanos explorar de forma mais intensa os recursos naturais, o que tem gerado distúrbios importantes nos ciclos de energia globais. A súbita introdução de compostos químicos xenobióticos, ou a massiva realocação de recursos naturais para diferentes nichos ambientais, pode frequentemente sobrecarregar a capacidade de autodepuração dos ecossistemas receptores, resultando assim na acumulação de poluentes para níveis problemáticos ou mesmo perigosos. Para Evans e Furlong (2003), na essência, a poluição pode ser definida como a introdução de substâncias no ambiente as quais, em virtude de suas características, persistência ou quantidades envolvidas, são suscetíveis a danificar a saúde de humanos, animais e plantas, ou comprometer a habilidade ambiental de sustentar a vida. Deveria ser óbvio que isso está expressamente incluso na definição, abrangendo não simplesmente as substâncias mais tóxicas e nocivas, mas também outros materiais, os quais podem ter efeito poluente sobre certas circunstâncias. De acordo com Evans e Furlong (2003) a poluição pode apresentar diversas propriedades, tais como: Toxicidade, Persistência, Mobilidade, Facilidade de controle e Bioacumulação. As fontes de contaminação podem ser classificadas de várias formas, sendo divididas em pontuais e difusas. As fontes pontuais são geralmente pequenas, mas suas concentrações podem ser elevadas e gerar contaminações importantes. Dentre as fontes pontuais podem ser citados os vazamentos de tanques, acidentes com transporte, lançamento de esgoto por tubulações, estações de tratamento de esgoto, etc. Geralmente são mais fáceis de serem tratadas. Já as fontes difusas são maiores e sua distribuição espacial pode cobrir grandes áreas. Exemplos de fontes difusas são o arraste de nutrientes utilizados nas lavouras, a aplicação de agrotóxico, etc. (WENDLAND e MARIN, 2013). Dentre os pontos de contaminação, que vem recebendo especial atenção ao considerar a poluição de solos e das águas subterrâneas são os postos de distribuição de combustíveis, sendo que sua principal fonte de poluição são os hidrocarbonetos derivados de petróleo. As contaminações nestes locais se devem principalmente a derramamentos, dos tanques de armazenamento e bombas ou vazamentos acidentais (UDIWALL e PATEL, 2010). No Brasil, os postos de gasolinas são responsáveis por mais de 50% dos casos de contaminação de água e de solos, geralmente devido à falta

17 16 de monitoramento e aos elevados tempo de uso dos tanques de armazenamento de combustíveis subterrâneos, geralmente com mais de 25 anos (BRITO et al., 2010). 3.2 Características do petróleo e seus derivados Petróleo é o termo utilizado para designar ambos, o óleo e o gás natural. É um produto da decomposição de matéria orgânica armazenada em sedimentos, que migra através de aquíferos e fica aprisionado em reservatórios (CORRÊA, 2003). De acordo com Baird (2002) o petróleo ou óleo cru, é uma mistura complexa de centenas de compostos, muitos dos quais são hidrocarbonetos; as proporções dos compostos variam de um campo petrolífero a outro. O tipo mais abundante de hidrocarboneto é a série de alcanos, que podem ser genericamente designados pela fórmula C n H 2n+2. No petróleo, as moléculas de alcanos variam muito, desde o simples metano (CH 4 ), até moléculas contendo quase 100 carbonos. Segundo Baird (2002) o petróleo e os combustíveis feitos a partir deste, como a gasolina e o óleo diesel, possuem a grande vantagem de serem líquidos de densa energia, que são convenientes, relativamente seguros para o uso e relativamente baratos para se produzir. Virtualmente, todos os sistemas de transportes não elétricos, tanto no mundo desenvolvido quanto no em desenvolvimento, são baseados nos baratos combustíveis de petróleo. A importância do petróleo em nossa sociedade, tal como está atualmente organizada, é extensa e fundamental. O petróleo não é apenas umas das principais fontes de energia utilizadas pela humanidade. Além de sua importância como fornecedor de energia, os seus derivados são a matéria-prima para a manufatura de inúmeros bens de consumo e, deste modo, têm um papel cada dia mais presente e relevante na vida das pessoas (MARIANO, 2005). Cerqueira et al. (2011) aponta que a indústria do petróleo traz inúmeros benefícios a sociedade, mas são globalmente reconhecidos como uma atividade econômica com grandes impactos ambientais. Indústrias petroquímicas e refinarias geram uma grande quantidade de resíduos oleosos, classificados de acordo com a NBR como resíduos de classe I ou resíduos perigosos (resíduos que não podem ser reutilizados ou reciclados, e podem apresentar características como inflamabilidade, corrosividade, toxicidade, e patogênecidade).

18 17 Para Hickey e Smith (1996) e Chagas-Spinelli et al. (2012) solos e águas subterrâneas são geralmente contaminados com produtos de petróleo devido ao lançamento acidental ou atividades impróprias de disposição. Muitos dos constituintes individuais encontrados nos produtos do petróleo são considerados potencialmente carcinogênicos e, portanto, a remediação de solos e águas subterrâneas contaminados com estes compostos é ordenada pela legislação ambiental vigente. Considerando a poluição e toxicidade dos hidrocarbonetos derivados de petróleo, o desenvolvimento de uma estratégia efetiva e ambientalmente correta para reduzir elas continua sendo um desafio. A crescente pressão pelas agências regulatórias ambientais tem motivado o desenvolvimento de tecnologias limpas, destacando-se a tecnologia de biorremediação (FERNANDEZ et al., 2011) Óleo diesel e seus hidrocarbonetos constituintes O óleo diesel tornou-se um dos principais combustíveis atualmente em uso. No Brasil, cujo transporte de mercadorias é feito, em sua maior parte, por via rodoviária, sem falar no transporte de passageiros, as frotas de caminhões e ônibus são as principais responsáveis por seu consumo. Sendo constituído por hidrocarbonetos acima de C 18 (ou seja, com cadeias carbônicas com mais de 18 átomos de carbono), o óleo diesel é pouco volátil e pouco inflamável (FARIAS, 2008). De acordo com Mariano et al., (2008), o óleo diesel contém de 2000 a 4000 hidrocarbonetos, uma mistura complexa de alcanos normais, ramificados e cíclicos, e compostos aromáticos obtidos de uma fração meio destilado durante a separação do petróleo. Muitos desses compostos podem ser usados como indicadores para avaliação da intemperização do óleo diesel. Mudanças nas taxas de concentração de hidrocarbonetos como benzeno, tolueno, etilbenzeno, e xilenos (BTEX) são devido principalmente a processos de evaporação e dissolução. Estes compostos são caracterizados pela sua alta pressão de vapor e solubilidade em água. Benzeno e tolueno dissolvem-se preferencialmente na água subterrânea quando comparado ao etilbenzeno e xilenos, os quais tem uma baixa solubilidade e são mais resistentes a biodegração. O óleo diesel é uma mistura complexa de compostos consistindo primariamente de compostos parafinicos, oleofínicos e hidrocarbonetos aromáticos e quantidades menores de substâncias contendo enxofre, nitrogênio, metais e oxigênio. As moléculas

19 18 de hidrocarbonetos contém de 8 a 40 átomos de carbono e são geralmente mais pesadas que aquelas encontradas na gasolina (VIEIRA, 2009). Os n-alcanos constituem-se por hidrocarbonetos alifáticos saturados de cadeia linear, são os maiores constituintes do petróleo. Os n-alcanos mais frequentemente investigados no ambiente são os que possuem cadeias que variam de n2 nc34 pela possibilidade analítica. Os n-alcanos podem ser gerados por processos biológicos ou nos estágios primitivos de diagênese (conjunto de processos físicos e químicos que atuam sobre o sedimento até sua consolidação) (COIMBRA, 2006). A remoção destes compostos do solo pode ser avaliada pela análise dos hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP). Neste caso, perfis cromatográficos do diesel comercial, geralmente apresentam uma resolução satisfatória de todos os n-alcanos e alguns outros alcanos isoprenóides, como o pristeno (2,6,10,14- tetramethylpentadecane) e o fitano (2,6,10,14-tetramethylhexadecane) (MARIANO, 2008). A identificação dos alcanos isoprenóides, juntamente com os n-alcanos tem sido intensamente utilizada em estudos de combustíveis fósseis com vários propósitos, como caracterização do óleo e outras correlações que avaliam o grau de biodegradação e origem da maior contribuição de hidrocarbonetos. As razões Pristano/7 e Fitano/8 são utilizadas para determinar se os hidrocarbonetos de petróleo presentes no ambiente são recentes, podendo serem utilizadas para caracterizar o grau de degradação e intemperismo do petróleo no ambiente, isso porque os alcanos de cadeias normais são facilmente biodegradados por micro-organismos, portanto baixos valores (< 2) sugerem presença de óleo degradado (OLIVEIRA et al. 2007, COLOMBO et al., 1989). Micro-organismos degradadores de hidrocarbonetos usualmente degradam alcanos ramificados e compostos isoprenóides a taxas muito mais lentas do que os alcanos de cadeia linear. Portanto a relação dos alcanos de cadeia linear, com estes compostos biomarcadores altamente ramificados, pode refletir o grau em que os microorganismos têm degradado os hidrocarbonetos no óleo diesel. Os hidrocarbonetos contidos em óleo diesel intemperizado são principalmente caracterizados por alcanos isoprenóides e pela MCNR (Mistura Complexa não Resolvida) (MARIANO, 2008). De acordo com Mariano, (2008), a maior fração do óleo diesel não é caracterizada por que a maioria dos componentes não pode ser resolvida e eles aparecem nos cromatogramas como picos, que é chamada de "unresolved complex

20 19 mixture (UCM) ou Mistura Complexa não Resolvida (MCNR)", a qual presumidamente inclui alcanos cíclicos e ramificados e produtos de transformações polares. Os hidrocarbonetos resolvidos de petróleo são chamados de (TRH) sigla que advém de total resolvable hydrocarbons e o TPH é a soma do TRH e UCM. Os TRH são hidrocarbonetos não degradados, e eles aparecem como picos nos cromatogramas. Um dos indicadores mais convincentes da presença de petróleo degradado em amostra de sedimento é a presença desta mistura complexa não resolvida (Volkman et al., 1992). Estudos feitos por Gough & Rowland (1990), mostraram que, devido as suas estruturas, os compostos não resolvidos são resistentes à degradação, gerando o acúmulo destes compostos no ambiente. Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos são compostos por carbono e hidrogênio com anéis de benzeno ligados de forma linear, angular e agrupados em arranjos. Alguns deles podem ser considerados moléculas heterocíclicas com a substituição de um anel aromático de carbono por nitrogênio, oxigênio ou enxofre (MÜNCNEROVÁ e AUGUSTIN, 1994; MAKKAR et al., 2003). Para a maioria dos HPA s, um aumento na hidrofobicidade e estabilidade eletroquímica são correlacionados com um aumento no peso molecular e angularidade da molécula do HPA. A estabilidade molecular e hidrofobicidade são dois fatores primários que contribuem para a persistência de HPA s com alto peso molecular no ambiente como mostrado em diversos estudos correlacionando taxas de degradação e tamanho molecular do HPA. A genotoxicidade dos HPA s também é conhecida por aumentar de acordo com o peso molecular. Devido a sua natureza lipolítica, os HPA s têm alto potencial de biomagnificação através dos diferentes níveis tróficos (MAKKAR et al, 2003) Segundo Makkar et al. (2003) a taxa de biorremediação dos HPA s no ambiente é limitada por vários fatores, sendo um dos principais a sua limitada biodisponibilidade, devido a sua baixa solubilidade e forte ou até mesmo irreversível sorção dos mesmos no solo. Além disso, muitos HPA s com alto peso molecular são também suscetíveis a pelo menos uma degradação parcial pelas basctérias utilizandos outros hidrocarbonetos de peso molecular mais baixo como fonte de carbono e energia. Para Mariano et al. (2008) os HPA s fornecem outra ferramenta útil para o monitoramento as alterações ambientais. Alguns dos compostos de HPA s do óleo diesel estão entre os menos afetados pelo processo de intemperização. Estes compostos semivoláteis com baixa solubilidade e características recalcitrantes podem persistir por

21 20 um longo tempo no ambiente. O Esquema 1 traz a estrutura química de alguns dos HPA s. Esquema 1 Estruturas e nomenclatura IUPAC dos HPA s mais frequentes. Adaptado de (Silva,2005)

22 Legislação pertinente a contaminação de solos e águas subterrâneas por hidrocarbonetos no Brasil. A legislação pertinente a hidrocarbonetos e sua contaminação de solos e águas subterrâneas é muito recente. A resolução nº 420, de 28 de dezembro de 2009 dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de atividades antrópicas. A Tabela 1 apresenta uma síntese dessas substâncias e seus valores orientadores. Tabela 1 Valores de referência para solos contaminados por hidrocarbonetos resolução CONAMA nº 420. Água Solo (mg.kg -1 de peso seco) subterrânea Substância (μg.l -1 ) Referência Prevenção Investigação Investigação qualidade de Agrícola Residencial Industrial Hidrocarbonetos monoaromáticos voláteis Benzeno na 0,03 0,06 0,08 0,15 5 Estireno na 0, Etilbenzeno na 6, Tolueno na 0, Xilenos na 0, Principais hidrocarbonetos policíclicos aromáticos Antraceno na 0, Benzo(a)antraceno na 0, ,75 Benzo(a)fluoranteno na 0, Benzo(g,h,i)perileno na 0, Benzo(a)pireno na 0,052 0,4 1,5 3,5 0,7 Criseno na 8, Dibenzo(a,h)antraceno na 0,08 0,15 0,6 1,3 0,18 Fenantreno na 3, Indeno(1,2,3- c,d)pireno na 0, ,17 Naftaleno na 0, na não se aplica para substâncias orgânicas. Fonte: Adaptado da Resolução CONAMA n 420/2009. No âmbito do estado do Rio Grande do Sul, a Portaria nº 16, de 20 de abril de 2010, define resíduos de classe I com características de inflamabilidade não passíveis de destinação final em aterros de classe I e central de recebimento e destinação de resíduos classe I. A critérios da FEPAM, os seguintes resíduos são considerados classe I: - Borras Oleosas; - Borras de processos petroquímicos;

23 22 - Borras de fundo de tanques de combustíveis e de produtos inflamáveis; - Elementos filtrantes de filtros de combustíveis e lubrificantes; - Solventes e borras de solventes; - Borras de tintas a base de solventes; - Ceras contendo solventes; - Panos, estopas, serragem, EPI s, elementos filtrantes e absorventes contaminados com óleos lubrificantes, solventes ou combustíveis (álcool, gasolina, óleo diesel, etc.); - Lodo de caixa separadora de óleo com mais de 5% de hidrocarbonetos derivados de petróleo ou mais 70% de umidade; - Solo contaminado com combustíveis ou com qualquer um dos componentes acima identificados; Sendo assim se faz necessário aplicar alguma forma de tratamento para a posterior disposição final dos resíduos contaminados com hidrocarbonetos. As técnicas envolvendo processos biológicos tornam-se extremamente atrativas nesse contexto. 3.4 Origem da contaminação de hidrocarbonetos derivados de petróleo no ambiente. No Brasil, postos de gasolina são responsáveis por mais da metade dos casos de contaminação do solo e aquíferos, em grande parte devido à falta de um acompanhamento eficaz e os longos tempos de vida dos tanques de armazenamento subterrâneo de aproximadamente 25 anos (BRITO et al., 2010). Segundo a ANP (2013), o Brasil possui atualmente mais de postos de combustíveis. Mais recentemente com os órgãos ambientais fiscalizando mais intensamente a atividade de abastecimento veicular, observa-se um crescente aumento na quantidade de áreas diagnosticadas com contaminações por hidrocarbonetos no Brasil. A CETESB, Companhia Ambiental do Estado de São Paulo, é a agência do governo do estado de São Paulo responsável pelo controle, fiscalização, monitoramento e licenciamento de atividades geradoras de poluição. No ano de 2002 foi liberado o primeiro relatório de áreas contaminadas, sendo no mesmo diagnosticadas 255 áreas contaminadas, das quais pelo menos 154 apresentavam como contaminantes hidrocarbonetos derivados de petróleo. Em 2012 o numero de áreas contaminadas ou sob investigação saltou para 4572, das quais 3510 são provenientes de postos de abastecimento (CETESB, 2013).

24 23 Para uma maior noção da dimensão do problema relacionado aos combustíveis no Brasil, no ano de 2012 foram comercializados m 3 de óleo diesel sendo somente no Rio Grande do Sul, foram comercializados m 3 (ANP, 2013). Do ponto de vista do derramamento de petróleo e derivados no solo, é relativamente comum a ocorrência de vazamentos em sistemas de armazenamento subterrâneos de combustível (em postos de gasolina, por exemplo). Infelizmente, na grande maioria dos casos, tanto contaminações superficiais provocadas junto a bombas e locais de enchimento dos reservatórios, bem como os vazamentos em tanques de armazenamento e tubulações subterrâneas, terminam, com frequência por atingir galerias de esgoto, redes de drenagem de águas pluviais, poços de abastecimento de água, etc. (FARIAS, 2008). Outra problemática, conforme citado por Vieira et al. (2009) devido as grandes dimensões do Brasil, a gasolina e o óleo diesel são transportadas das refinarias até os terminais de combustível em centros urbanos através de rede de tanques de distribuição de combustível. Nestes terminais caminhões tanque são carregados diariamente para realização do processo de transporte para outras partes do país utilizando o sistema de estradas interestaduais. Os caminhões são tipicamente divididos em compartimentos para permitir o transporte de diferentes combustíveis no interior do mesmo veículo. Ainda segundo Vieira et al. (2009) o derramamento de combustíveis é uma ocorrência frequente durante o carregamento. A água utilizada para lavagem dos caminhões e áreas de carregamento gera um efluente contaminado com óleo diesel e gasolina. Efluentes com as mesmas características são também encontrados em postos de combustíveis e durante acidentes com contaminação superficial por óleo diesel e gasolina. Este tipo de efluente geralmente apresenta uma alta carga orgânica incluindo muitos hidrocarbonetos que são resistentes à degradação microbiológica. 3.5 Técnicas de remediação do solo. Problemas associados com a limpeza de áreas contaminadas com petróleo tem demonstrado que há a necessidade de desenvolver tecnologias de remediação que sejam viáveis, rápidas e implementáveis em uma grande variedade de configurações físicas. Governo, indústria e a população reconhecem o perigo potencial que misturas químicas complexas como hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP), policloro bifenis (PCB s),

25 24 hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA s), metais pesados e pesticidas perante a saúde humana e ambiental. (KHAN et al., 2004) Para Higarashi (1999) as tecnologias de imobilização consistem na criação de barreiras físicas para evitar a migração dos contaminantes. A destruição consiste em encontrar meios para degradar o contaminante para compostos menos tóxicos ou, no caso ideal, mineralizá-los. A separação consiste em se extrair o contaminante para uma fase de gerenciamento mais fácil (líquida ou gasosa) ou para uma fase mais concentrada, reduzindo o volume do material a ser remediado ou disposto. De acordo com Sayara et al. (2011) cada tecnologia tem suas ótimas condições de operação, a quais são moldadas pelas propriedades (físico-químicas) ou prevalecendo as condições ambientais. O custo da tecnologia de remediação é um fator crucial na sua escolha e implementação. Neste contexto, a biorremediação, a qual depende principalmente dos micro-organismos para degradar contaminantes específicos, é uma tecnologia promissora por sua eficiência e atrativa relação entre custo-benefício. Os solos e sedimentos contaminados por hidrocarbonetos podem ser remediados por métodos in situ e ex situ. Porém, do ponto de vista econômico e ambiental a descontaminação in situ está adquirindo uma elevada importância, de modo que, no presente momento, muitos esforços de investigação têm sido utilizados para encontrar métodos adequados para a descontaminação, utilizando técnicas não invasivas. (VAZ, 2010). O processo de transição tecnológica, de técnicas de tratamento in situ, para ex situ, passa pelo crivo das seguintes variáveis, como pode ser visualizado no Esquema 2. Primeiramente devido a considerações de custo e tempo, Makkar et al. (2003), afirma que o método de landfilling do solo contaminado é atualmente o mais amplamente utilizado método de remediação. Porém, a remediação biológica em combinação com outros métodos tem ganhado lugar entre as tecnologias de restauração do solo.

26 25 Esquema 2 Transição tecnológica para o tratamento de solos contaminados. Adaptado de Evans e Furlong, (2003). Os processos de tratamento de solos contaminados encontram-se resumidos na Tabela 2, onde as técnicas são classificadas basicamente em três grandes grupos, de acordo com sua característica. Tabela 2 Métodos de remediação de solos contaminados. Método Característica Tecnologia Física Incineração Química Declorificação Destruição Atenuação natural Biológica Biorremediação Lavagem do solo Steam stripping Separação Física Extração (vácuo) Extração (solvente) Dessorção térmica Separação de partícula Química Estabilização Contenção Hidráulica Manejo da pluma Contenção Remoção Landfill Física Barreira/ Cover Solidificação/ Vitrificação Adaptado de Evans e Furlong (2003). Há muito métodos para a remoção destes poluentes no solo. Eles envolvem tanto abordagens físico-químicas e biológicas. Embora as primeiras sejam mais efetivas que

27 26 os métodos biológicos, elas são mais caras, requerem uma alta demanda de energia e o consumo de diversos reagentes químicos. Por essa razão que o uso de micro-organismos capazes de degradar compostos tóxicos, conhecida como biorremediação tem se tornado uma tecnologia atrativa (MROZIK e SEGET 2010 apud HAMDI et al., 2007) A biorremediação de solos contaminados por hidrocarbonetos derivados de petróleo. Devido ao escopo do presente trabalho, maior ênfase será dada para técnicas de remediação que envolvem processos de degradação envolvendo micro-organismos. Conforme afirma Lebkowska et al. (2011) o processo de biodegradação de hidrocarbonetos é realizado por diversos microrganismos presentes no solo, mas há relativamente poucos microrganismos que usam hidrocarbonetos como única fonte de carbono e energia comparado ao número geral de bactérias. A biorremediação pode ser definida como um conjunto de tecnologias, que utilizam processo(s) biológico(s), aplicadas à recuperação ou remediação de áreas contaminadas, ou ao tratamento de compostos orgânicos voláteis tóxicos ou efluentes, contendo resíduos, que devam ser eliminados antes da descarga no ambiente. Para isto, em geral, utilizam-se microrganismos, plantas ou produtos biológicos, como enzimas e componentes celulares, com a finalidade de realizar uma mineralização, a qual, possivelmente, resulta em gás carbônico e água como produtos finais (DIAS, 2000). Para Liu et al. (1993) a biorremediação, é um processo que explora as capacidades catalíticas de organismos vivos para aumentar a taxa ou extensão de destruição do poluente, sendo uma importante ferramenta na tentativa de mitigar a contaminação ambiental. Boopathy (2000) classifica as tecnologias de biorremediação de uma forma ampla, como ex situ e in situ. Tecnologias ex situ são aqueles tratamentos os quais envolvem a remoção física do material contaminado para um processo de tratamento. Em contraste, as técnicas in situ envolvem o tratamento do material contaminado no local de sua geração. Alguns exemplos de processo de tratamento são dados na Tabela 3.

28 27 Tabela 3 Tecnologias de biorremediação. Técnica Característica Land farming Sistema de tratamento de fase sólida para solos contaminados: pode ser feito in situ ou ex situ. Compostagem Aeróbico, o processo de tratamento termofilico em que material contaminado seja misturado com um agente espessante, pode ser feito usando pilhas estáticas ou pilhas aeradas. Bioreatores Biodegradação num contentor ou num reactor, pode ser usado para tratar líquidos ou pastas Biofiltros O uso de colunas de stripping microbianas para tratar as emissões atmosféricas. Bioventilação Método de tratamento de solos contaminados por desenhar o oxigênio através do solo para estimular a atividade microbiana. Bioaumentação A adição de culturas bacterianas para um meio contaminado; freqüentemente usado tanto in situ e ex situ de sistemas. Bioestimulação Estimulação das populações microbianas indígenas em solos ou águas subterrâneas, fornecendo nutrientes necessários. Biorremediação intrinseca Biorremediação sem assistência do contaminante, apenas acompanhamento regular é feito. Bombeamento e águas subterrâneas para a superfície, o tratamento, e tratamento reinjeção. Adaptado de Boopathy (2000). A biorremediação é reconhecida como uma tecnologia barata, efetiva e ambientalmente segura, que oferece novos caminhos para a depleção de resíduos perigosos. Entretanto, apesar do alto potencial desta tecnologia, o uso da biorremediação é limitado por um incompleto entendimento do processo de biodegradação, especialmente no controle e aprimoramento desse processo em diferentes matrizes e pela ausência de diversas técnicas de engenharia que são requeridas para uma ampla aplicação (HICKEY E SMITH, 1996) Bioestimulação. A bioestimulação concentra-se unicamente na microfauna existente, estimulando sua atividade pela manipulação das condições ambientais locais (EVANS e FURLONG, 2003). A bioestimulação é a adição de nutrientes a uma área poluída com o intuito de estimular o crescimento dos micro-organismos de ocorrência natural degradadores dos compostos químicos presentes (MROZIK e SEGET, 2010).