Citotaxonomia de roedores do gênero Proechimys (Echimyidae) da região amazônica, Brasil Eduardo Schmidt Eler

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1 INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS Citotaxonomia de roedores do gênero Proechimys (Echimyidae) da região amazônica, Brasil Eduardo Schmidt Eler MANAUS, AMAZONAS JUNHO/2007

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3 Eduardo Schmidt Eler Citotaxonomia de roedores do gênero Proechimys (Echimyidae) da região amazônica, Brasil ORIENTADORA: Eliana Feldberg, Dra. CO-ORIENTADORA: Maria Nazareth Ferreira da Silva, PhD. Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, área de concentração em GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA. MANAUS, AMAZONAS JUNHO/2007 ii

4 FICHA CATALOGRÁFICA E39 Eler, Eduardo Schmidt Citotaxonomia de roedores do gênero Proechimys (Echimyidae) da região amazônica, Brasil / Eduardo Schmidt Eler - Manaus: INPA/UFAM, xiii, 59 f. : il. Dissertação (mestrado)--inpa/ufam, Manaus, Orientadora: Eliana Feldberg Co-orientadora: Maria Nazareth Ferreira da Silva Área de Concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Proechimys Amazônia 2. Proechimys Citotaxonomia CDD 19ª ed Sinopse: Com o intuito de verificar marcadores citotaxonômicos para o gênero Proechimys, foram estudados indivíduos de duas localidades da bacia amazônica: médio rio Madeira (AM) e Vale do Jari (PA). As análises revelaram três números diplóides: 28 (P. cuvieri e P. gr. longicaudatus), 38 (Proechimys gr. guyannensis) e 40 (P. gardneri). Porém, P. gr. longicaudatus apresentou duas formas cariotípicas, evidenciadas por meio da RON e banda C. Palavras-chave: Amazônia; Sistemática; Roedores; Echimyidae; Diversidade Cariotípica; Rearranjos Cromossômicos; Heterocromatina Constitutiva; RON iii

5 A meus pais, Sérgio e Cidnéa, meus maiores incentivadores e exemplo de vida. À Tahisa e Isabelle: vocês são o que melhor existiu em meu mestrado. iv

6 A ignorância gera confiança com mais freqüência do que o conhecimento: são aqueles que sabem pouco, e não aqueles que sabem muito, que tão positivamente afirmam que esse ou aquele problema jamais será resolvido pela ciência Charles Darwin "A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de Deus, e a mais notável" Galileu Galilei v

7 A realização deste trabalho foi possível devido: Ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Universidade Federal do Amazonas (UFAM), curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Ao laboratório de Genética de Peixes do INPA / CPBA e Coleção de Mamíferos do INPA, onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvido. Ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudo. Ao Banco Mundial, GEF (fundo para o meio ambiente mundial), CNPq e Ministério do Meio Ambiente, financiadores do projeto Inventário Faunístico do Médio rio Madeira - CNPq-PROBIO, convênio /02, coordenado pela Dra. Lúcia Helena Rapp Py-Daniel (INPA). À Darwin Initiative - DEFRA (Department of Environment, Food and Rural Affairs), financiadora do projeto O valor biológico e funcional de florestas primárias, secundárias e monocultivadas na Amazônia, coordenado pelo Dr. Carlos A. Peres (University of East Anglia, Inglaterra). Ao CNPq, financiador do projeto Sistemática, genética e ecologia de pequenos mamíferos do vale do rio Jari, Pará e Amapá. CNPq /04 4, coordenado pela Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva (INPA) À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e ao INPA pelo financiamento de material laboratorial e viagens para divulgação de resultados, pela logística antes e depois das coletas de campo. Ao Programa Beca (IEB), pelo auxílio financeiro para treinamento externo e aquisição de livros. Ao IBAMA, pela concessão das licenças. vi

8 AGRADECIMENTOS Acima de tudo agradeço a Deus, por me capacitar e por guiar cada passo meu até aqui. Agradeço por me dar ânimo e força para suportar a distância e a saudade dos meus pais, irmãos e amigos. À minha orientadora, Dra. Eliana Feldberg, pelo acolhimento quando cheguei à Manaus, pelo tempo investido em mim, pela confiança, conselhos, ensinamentos, por disponibilizar e providenciar tudo o que foi necessário para o desenvolvimento deste trabalho, pelas broncas nos momentos certos e pela amizade. À minha co-orientadora, Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, por acreditar no meu trabalho, por desejar sempre o melhor para mim, pelo exemplo de competência na pesquisa científica, por topar todas as minhas empreitadas e disponibilizar o material da Coleção de Mamíferos do INPA, pelos conselhos, ensinamentos, confiança, autonomia concedida a mim, pelas horas de conversa que muito me enriqueceram profissional e pessoalmente e, acima de tudo, pela amizade. Aos amigos polacos Carlos Schneider, Maria Cláudia Gross e Maria Leandra Terêncio, pela valiosa contribuição neste trabalho, especialmente na parte final. Obrigado pela boa vizinhança, pela divertida convivência no laboratório e sala de alunos, pela força nos momentos difíceis, por tantos favores, conselhos e incentivo. À Hercília e Alessandra, secretárias do curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, por quebrarem o meu galho tantas vezes. À Hercília Joana o meu muito obrigado pela amizade e pelos conselhos. Ao colega Rafael do N. Leite, pelo auxílio na coleta e preparação de pequenos mamíferos no Jari e por ceder a fotografia de Proechimys utilizada neste trabalho. À Maria Clara A. Uribe, pelo auxílio na coleta de pequenos mamíferos durante o PROBIO. Ao José Ribeiro, meu auxiliar e bom companheiro de campo, por dividir a batalha diária e tantas histórias inusitadas. Ao Dr. Jorge Dergam, meu grande mentor e amigo, pelos primeiros ensinamentos na citogenética e na pesquisa científica, por ter me preparado para alçar vôos maiores, pelos conselhos e apoio constantes. Meu agradecimento ainda pela correção do abstract deste trabalho. vii

9 Ao Dr. Jorge Porto, pelos conselhos, discussões e críticas ao longo do trabalho, pela amizade e incentivo profissional. Aos membros da banca de qualificação e referees do trabalho, pelas críticas e sugestões. Ao professor Paulo César M. Andrade, pelo incentivo, confiança e pela oportunidade de conhecer e coletar na Amazônia. Aos amigos Luciano Pinheiro, Maria de Fátima Pinto, Raimundo Junior, Aline Matos, Walfran Rojas, Carlos Eduardo Faresin, Marco Schetino, Tatiana Menicucci, Vinícius Carvalho, Anndson B. Oliveira, Wander da S. Rodrigues, Carlos Dias A. Jr., Jonathas P. Nascimento e Paulo Henrique Oliveira pelos muitos momentos de descontração, brincadeiras, trocas de experiência, vivência na Amazônia e contribuições científicas. À Tahisa e Isabelle, minha família, por me proporcionarem os melhores dias da minha vida. Tata, obrigado pelo carinho, pelo apoio incondicional, pelas críticas, sugestões e apoio técnico durante o mestrado, por nossa família e nosso lar. Obrigado por estar ao meu lado e entender a minha ausência constante. Isabelle Piscareli, obrigado pelo seu sorriso (ainda que quase sem dentes!), pelos abraços, por ser tão ingênua e mostrar que vale à pena sonhar, e acima de tudo obrigado pela confiança quando me chama de pai. Vocês me ensinam muito a cada dia. Ao casal de amigos Maria Cláudia e Carlos, e ao meu grande amigo Rafael Zerbini Coutinho. Obrigado por essa amizade tão sincera, pelo exemplo na profissão, pelos conselhos e pela preocupação e apoio dedicados a mim, Tahisa e Isabelle. Meu sincero agradecimento à Cláudia, por ser a minha terceira orientadora. Vocês são verdadeiros irmãos. Aos meus pais, Sérgio e Cidnéa, e meus irmãos Lílian e Luiz Felipe. É muito difícil não ter vocês por perto. Pai e mãe, muito obrigado por tirarem tanto de vocês para dar a mim, por garantirem todas as condições para que eu estudasse e por me incentivarem nesse caminho sempre. Ipe e Milha, obrigado por diminuir a distância nas conversas ao telefone e pelo desejo sincero de que eu obtenha sucesso. Aos meus comparsas da Galerazig e de faculdade (Bio 2000/UFV). Vocês estão sempre presentes, apesar da imensa distância, e sempre possuem uma palavra de incentivo. Sempre existe em vocês um bom exemplo de luta e de vitória. Obrigado a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho e para o meu crescimento profissional e pessoal. viii

10 RESUMO Ratos espinhosos do gênero Proechimys estão entre os mais diversos roedores neotropicais e, na Amazônia, suas espécies estão amplamente distribuídas. Devido à sistemática deste grupo ser extremamente complexa, a genética tem sido cada vez mais evocada para auxiliar na delimitação das espécies. Dentro deste cenário, este trabalho teve como objetivo detectar marcadores cromossômicos que pudessem ser utilizados na taxonomia desse gênero. Para tanto, foram analisados citogeneticamente 17 indivíduos de Proechimys da região do médio rio Madeira (interflúvios Purus-Madeira, Madeira-Aripuanã e Aripuanã-Tapajós) (AM) e sete do vale do rio Jari (PA), totalizando 686 células examinadas. Dentre os caracteres cromossômicos, o número diplóide e o número de braços permitiram agrupar esses indivíduos em três grupos distintos: 2n=28, NF A =46 (P. cuvieri e um táxon ainda não determinado provavelmente relacionado ao grupo longicaudatus - sensu Patton que aqui denominamos P. gr. longicaudatus vale do rio Jari e margem direita do rio Madeira, respectivamente); 2n=38, NF A =52 (Proechimys gr. guyannensis sensu Patton 1987, proveniente do vale do rio Jari); 2n=40, NF A =54 (P. gardneri margem esquerda do rio Madeira). A morfologia e bandeamento dos cromossomos sexuais também foram espécie-específicos. O bandeamento G permitiu emparelhar corretamente os homólogos e em Proechimys gr. guyannensis. e P. gardneri auxiliou na determinação do par sexual. A RON esteve presente numa constricção secundária, intersticial no braço longo, de um par de submetacêntricos médios, como visto para todas as espécies de Proechimys já analisadas. Entretanto, sua posição no cariótipo foi variável. Ainda, uma duplicação dessa região em um dos homólogos foi detectada apenas em P. gr. longicaudatus do interflúvio Aripuanã-Tapajós (margem direita do rio Madeira). A heterocromatina constitutiva esteve presente na região pericentromérica da maioria dos cromossomos de Proechimys gr. guyannensis e P. gardneri, porém variando os pares marcados entre as duas espécies; já o cromossomo Y apresentou-se totalmente heterocromático em Proechimys gr. guyannensis e sem marcação alguma em P. gardneri. Em P. gr. longicaudatus, o padrão da heterocromatina constitutiva separou a população do interflúvio Aripuanã-Tapajós (citótipo A), com marcações pericentroméricas em alguns pares cromossômicos marcação, das populações do interflúvio Madeira-Aripuanã (citótipo B), com blocos heterocromáticos na região pericentromérica de todos os cromossomos. P. cuvieri apresentou padrão de banda C similar ao citótipo A de P. gr. longicaudatus. O padrão da heterocromatina constitutiva e da RON foram marcadores fundamentais para a identificação de duas unidades evolutivas de P. gr. longicaudatus na região do médio rio Madeira. Os dados obtidos neste trabalho confirmam a grande diversidade cariotípica do gênero Proechimys e comprovam o uso dos bandeamentos cromossômicos como boa ferramenta na delimitação das espécies. Foi sugerido uma ampliação na distribuição geográfica de P. gardneri e P. gr. longicaudatus e, para as espécies de Proechimys com 2n=38 cromossomos, foi verificado que a ocorrência, por enquanto, está restrita a leste do rio Negro e ao norte do rio Amazonas. ix

11 ABSTRACT Spiny rats of the genus Proechimys are among the most diverse neotropical rodents and its species are widely distributed in the Amazon Rain Forest. Due the complex systematics of this group, genetic data have been useful to determine species boundaries. The objectives of this work were to contribute towards a better understanding of Proechimys cytogenetic taxonomy and evolutionary trends. Seventeen specimens of Proechimys from mid-madeira River (Purus-Madeira, Madeira-Aripuanã and Aripuanã-Tapajós interfluviums) (state of Amazonas) and seven specimens from Jari River Valley (state of Pará) were collected and analyzed cytogenetically. Diploid chromosome arm (fundamental) numbers allowed grouping of individuals in three distinct groups: 2n=28, FN=46 (P. cuvieri and P. gr. longicaudatus, occurring on the Jari region and on the right side of Madeira River, respectly); 2n=38, NF=52 (Proechimys gr. guyannensis, in the Jari region); 2n=40, NF=54 (P. gardneri, in the left side of Madeira River). Sexual chromosome morphology and banding were also species-specific. G-banding allowed correct homolog pairing and sexual chromosome identification in Proechimys gr. guyannensis and P. gardneri. The NOR was also evident as a secondary interstitial constriction in the long arm of a medium-sized submetacentric pair, as recognized for this genus in previous works; however, NOR position varied among karyotypes (it was species-specific or population-specific). A duplication of NOR was an autapomorphy of P. gr. longicaudatus from Aripuanã-Tapajós interfluvium (right bank of Madeira River). The constitutive heterochromatin was pericentromeric in most chromosomes of Proechimys gr. guyannensis and P. gardneri, showing high levels of variation between these two species. The Y chromosome was entirely heterochromatic in Proechimys gr. guyannensis and unmarked in P. gardneri. Constitutive heterochromatin and NOR patterns allowed the characterization of two citotypes in P. gr. longicaudatus: population from Aripuanã-Tapajós interfluvium (citotype A) showed some marked homolog pairs that differed from Madeira- Aripuanã interfluvium (citotype B), which showed heterochromatic blocks in the pericentromeric region of all chromosomes. P. cuvieri from Jari region was characterized by the presence of heterochromatic blocks in the pericentromeric region of all chromosomes and the RON pattern was similar to citotype B of P. gr. longicaudatus. The C band and NOR patterns were fundamental markers to identify two evolutionary units of P. gr. longicaudatus from mid-madeira River. This work confirmed the levels of great karyotypic diversity in Proechimys and allowed a better understanding of the geographic distribution of P. gardneri and P. gr. longicaudatus, as well as a restriction of 2n=38 chromosomes Proechimys species to the east of the Negro River and north of the Amazonas River. x

12 SUMÁRIO 1. Introdução Aspectos Gerais A família Echimyidae e o gênero Proechimys Citogenética de roedores Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos Material e Métodos Material Métodos Coleta e processamento dos espécimes Obtenção dos cromossomos mitóticos (tratamento in vivo ) Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) Detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) Banda G (GTG) Análise cariotípica Resultados Proechimys gr. longicaudatus 2n= Proechimys cuvieri 2n= Proechimys gr. guyannensis 2n= Proechimys gardneri 2n= Discussão Características cromossômicas de Proechimys Proechimys gr. longicaudatus e P. cuvieri 2n= Proechimys gr. guyannensis 2n= Proechimys gardneri 2n= Bandeamentos cromossômicos em Proechimys Conclusões Referências Bibliográficas...47 APÊNDICE xi

13 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Indivíduo de Proechimys spp., da região do médio rio Madeira...9 Figura 2: Mapa de parte da América do Sul, indicando os locais de coleta...10 Figura 3: Região do médio rio Madeira, com os pontos de coleta conforme indicados na Tabela Figura 4: Características cariotípicas de Proechimys gr. longicaudatus (2n=28) Citótipo A...21 Figura 5: Características cariotípicas de Proechimys gr. longicaudatus (2n=28) Citótipo B...22 Figura 6: Características cariotípicas de Proechimys cuvieri (2n=28)...24 Figura 7: Características cariotípicas de Proechimys gr. guyannensis (2n=38)...26 Figura 8: Características cariotípicas de Proechimys gardneri (2n=40)...28 Figura 9: Mapa de distribuição das formas cariotípicas do grupo longicaudatus...35 Figura 10: Mapa dos locais de ocorrência de Proechimys 2n= Figura 11: Mapa de distribuição das formas cariotípicas de P. gardneri...39 xii

14 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Áreas de coleta dos indivíduos e respectivos interflúvios na região do médio rio Madeira Tabela 2: Áreas de coleta dos indivíduos na região do Vale do Jari...13 Tabela 3: Número diplóide, freqüência relativa (%), total de células analisadas e locais de coleta, para machos e fêmeas de Proechimys Tabela 4: Formas cromossômicas determinadas para o gênero Proechimys compiladas da literatura e determinadas no presente trabalho (2n=número diplóide; NF=número de braços) xiii

15 1. Introdução 1.1. Aspectos Gerais A Amazônia estende-se do oceano Atlântico às encostas orientais da Cordilheira dos Andes até aproximadamente 600m de altitude (Ab'Saber, 1977), cobrindo nove países sul-americanos. O Brasil possui uma área aproximada de 5 milhões de quilômetros quadrados de floresta amazônica (Amazônia brasileira), abrangendo os estados do Acre, Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia e Roraima e parte dos estados do Mato Grosso, Maranhão e Tocantins (INPE, 1999). A Amazônia brasileira corresponde a 40% do total de florestas úmidas no planeta e abriga 40% de toda a diversidade biológica existente (Laurance et al., 2001). Dentre os fatores ecológicos responsáveis pela imensa riqueza de espécies desse bioma estão a estabilidade climática ao longo do tempo geológico, a fertilidade do solo e a densidade do sub-bosque, sendo a quantidade e o padrão de chuvas menos importantes (Wiens & Donoghue, 2004; Emmons, 1984). O desmatamento da Amazônia é muito alto e crescente ultrapassando 25 mil quilômetros quadrados ao ano (INPE, 2003), apesar do importante papel da floresta na regulação do clima em escala regional e global e nos ciclos de água e carbono (Shukla et al., 1990; Skole & Tucker, 1993; Houghton et al., 2000). A área desmatada já atinge cerca de 548 mil quilômetros quadrados, área equivalente a todo o território da França (Fearnside, 2001). Isso evidencia a necessidade urgente de estudos faunísticos e florísticos, contribuindo assim com informações que subsidiem ações de conservação. A degradação do meio ambiente pode tornar algumas espécies raras ou até mesmo extintas, especialmente devido à perda de hábitats, diminuição de recursos disponíveis, migração de espécies para áreas onde não ocorriam, gerando assim sobreposição de nichos e por conseqüência a competição, entre outros (Danielson, 1991). Estima-se que existam 4600 espécies viventes de mamíferos (Wilson & Reeder, 2005), e dessas, cerca de ocorrem na região neotropical, sendo 80% delas endêmicas (Patterson, 1994). Atualmente são descritas 311 espécies de mamíferos para a Amazônia brasileira, e destas, 72 são de roedores, grupo de interesse neste estudo. Este número deve ser considerado aproximado, e certamente será alterado à medida que novos estudos forem feitos, tanto estudos de revisão taxonômica quanto amostragens em novas áreas (da Silva et al., 2001). Existem grandes lacunas no conhecimento científico sobre a fauna de 1

16 mamíferos amazônicos. Essas lacunas são atribuídas à grande riqueza de espécies, diversidade de hábitats e especialmente grande extensão da floresta. Voss & Emmons (1996) listaram dez sítios nas matas neotropicais onde inventários da mastofauna podem ser considerados exemplares e desses, somente dois situam-se na Amazônia brasileira. Desde então, pode-se acrescentar alguns outros sítios a essa lista, como os trabalhos desenvolvidos por Patton et al. (2000), Voss et al. (2001) e da Silva et al. (2007). Apesar desses esforços, a elaboração de listas de espécies de mamíferos amazônicos ainda é uma tarefa difícil, especialmente entre os roedores, marsupiais e quirópteros, que correspondem a cerca de dois terços da diversidade total de mamíferos (da Silva et al, 2001). Portanto, inventários abrangentes ainda precisam ser realizados em praticamente toda a região. Segundo Emmons (1984) existe um decréscimo na diversidade de espécies de oeste para leste da Amazônia. Peres (1997) sugere que para primatas, a riqueza de espécies está intimamente relacionada com o tipo de floresta, e esta é maior nas matas de terra firme, porém com densidade e biomassa menores do que na várzea. Esse padrão também foi encontrado por Patton et al. (2000) para roedores e marsupiais da região do rio Juruá. Estudos preliminares com roedores e marsupiais sugerem ainda que na Amazônia, os sistemas de água preta (segundo Sioli (1990), águas de cor escura, pobres em material em suspensão e ricas em substâncias húmicas dissolvidas) podem ser muito mais sensíveis a ações antrópicas, uma vez que a abundância relativa de espécies é menor nessas áreas do que em áreas de água branca (águas com coloração barrenta devido à grande quantidade de sedimentos em suspensão; Sioli, 1990) (da Silva & Patton, dados não publicados). Em áreas não amostradas suficientemente, ou mesmo nas já amostradas, novos táxons são continuamente descobertos quando dados de levantamentos são combinados com outras técnicas (Van-Gelder, 1969; da Silva et al., 2001), como a citogenética e a biologia molecular. Em relação aos pequenos mamíferos (roedores, marsupiais e quirópteros) esse problema é ainda mais evidente. Em um levantamento de roedores e marsupiais realizado ao longo da região do rio Juruá, nove novas espécies foram descritas, correspondendo a 20% do total de espécies de roedores e marsupiais existentes (Patton & da Silva, 1995; da Silva, 1998; Patton et al., 2000). Cerca de 70% dos táxons, para os quais o limite de espécie ainda não está bem definido, é composto por roedores, marsupiais e quirópteros. Dentro da ordem 2

17 Rodentia os exemplos mais notórios são os seguintes gêneros: Microsciurus, Sciurus, Neacomys, Nectomys, Oecomys, Oryzomys, Rhipidomys, Coendou, Dasyprocta, Myoprocta, Echimys, Mesomys e Proechimys, o mais amplamente distribuído e diverso (Voss & Emmons, 1996). Espécies do gênero Proechimys são caracterizadas por uma extensa variabilidade morfológica, sobrepondo em muitos caracteres com espécies de outros gêneros (Thomas, 1928). Comparando a relação entre a composição das comunidades de mamíferos não-voadores da região do rio Juruá com outros 14 sítios, foi percebida a existência de dois grupos geográficos claramente definidos na Amazônia, representando duas unidades distintas: uma do leste e outra do oeste, limitadas pelo rio Negro, ao norte do eixo Solimões-Amazonas e uma região ainda não muito bem definida entre os rios Madeira e Xingu, ao sul (Patton et al., 2000). O reconhecimento dessa divisão é extremamente importante do ponto de vista conservacionista, uma vez que essas áreas são unidades evolutivas diferentes e isso deve ser levado em conta na definição de áreas prioritárias para conservação (da Silva et al., 2001). Nesse contexto, a caracterização da biodiversidade é fundamental A família Echimyidae e o gênero Proechimys Os roedores, como são conhecidos os indivíduos da ordem Rodentia, são distribuídos em todo o planeta exceto na Antártica, e tiveram sua origem na Eurásia (Myers, 2000). Na América do Sul, as famílias mais representativas são Echimyidae e Cricetidae, as quais colonizaram este continente em pelo menos dois eventos distintos: equimídeos são bem representados desde o Oligoceno inferior até o presente, enquanto cricetídeos chegaram à América do Sul posteriormente, provavelmente no Plioceno (Eisenberg & Redford, 1989). Ambas famílias estão amplamente distribuídas em toda a região amazônica (Emmons & Feer, 1997). Os equimídeos, ou ratos espinhosos são encontrados nas regiões Neotropicais das Américas Central e do Sul, possuem aproximadamente 78 espécies (algumas já extintas), divididas em 20 gêneros. Dessas, 24 espécies são encontradas na Amazônia (Voss & Emmons, 1996; Patton et al., 2000; da Silva et al., 2001). É a família mais diversa dos roedores hystricognatos sul-americanos em termos de número de espécies e possivelmente de diversidade ecológica. Os equimídeos são animais de tamanho médio, possuindo de 80 a 500mm de comprimento cabeça-corpo. Possuem focinho pontudo, olhos e orelhas de tamanho 3

18 médio e o comprimento da cauda varia de menos da metade do comprimento do corpo até consideravelmente maior que o corpo. A cauda freqüentemente é quebrada e perdida em alguns gêneros como Proechimys e Mesomys. As patas dianteiras possuem quatro dedos funcionais e as patas traseiras cinco. O comprimento dos dedos varia de acordo com o hábito da espécie. Equimídeos são assim denominados devido à presença de pêlos espinhosos ou eriçados ao menos na parte posterior do corpo, embora várias espécies possuam pêlos macios em todo o corpo. A cor da pelagem também é variável entre as espécies, podendo ser uniformemente escura, dourada e até branca, apresentando muitas vezes listras faciais e um padrão geral de coloração bastante bonito e atraente. Eles ocupam uma grande variedade de nichos. Alguns são completamente arbóreos, provavelmente nunca descendo da copa das árvores. Outros passam a vida toda no chão da floresta, e outros ainda podem explorar mais de um extrato da vegetação. Existem ainda espécies fossoriais. Os hábitos alimentares também são variados, podendo ser de folhas de bambu, frutos, castanhas ou insetos. A maioria das espécies é solitária, com exceção de algumas, por exemplo, Trynomys yonenagae (dunas do São Francisco, BA) e as do gênero Clyomys, que vivem em colônias. São divididos em diversas sub-famílias, incluindo Eumysopinae (sub-família a qual pertence o gênero Proechimys), Dactylomyinae, Heteropsomyinae e Echimyinae, sendo esta última a que detém a maioria das espécies da família. Algumas espécies podem vocalizar à noite, como por exemplo espécies de Dactylomys e Proechimys (Nowak & Paradiso, 1983; McDonald, 1984; Vaughan, 1986; Eisenberg & Redford, 1989; Feldhamer et al., 1999; Myers, 2001; Wilson & Reeder, 2005). No Brasil, cinco espécies de equimídeos (Callistomys pictus, Carterodon sulcidens, Phyllomys brasiliensis, P. thomasi e P. unicolor) estão ameaçadas de extinção, mas nenhuma delas ocorre na Amazônia (MMA, 2007). O gênero Proechimys é o mais abundante dentre os mamíferos nãovoadores nas florestas neotropicais. Os indivíduos são de hábito terrestre; possuem orelhas grandes e eretas; cabeça alongada; pés estreitos, compridos e de coloração marrom escura ou preta na região ventral; a cauda é menor ou aproximadamente igual ao comprimento do corpo. A coloração do ventre é branca e da região dorsal marrom-avermelhado ou amarelado. Quando adultos, possuem pêlos aristiformes facilmente identificados na região dorsal do indivíduo (Patton et al., 2000). No Brasil, populações de Proechimys guyannensis são indicadas como reservatórios importantes de Leishmania tegumentaria, fato também observado no 4

19 Panamá (P. semispinosus) e na Venezuela (P. guyannensis). Além disso, já foi registrada uma população parasitada por Trypanosoma cruzi na Venezuela, e ainda existem evidências de que este gênero tenha relação com a história natural de arbovirus. Ainda, na Colômbia, foi relatada a existência de populações que hospedam naturalmente o vírus da EEV (Encefalite Eqüina Venezuelana), dentre outras zoonozes (Bueno et al, 1989). Desta forma, é necessário grande conhecimento sobre a diversidade e biologia do gênero (Reig & Useche, 1976). A sistemática desse grupo é extremamente complexa e na Amazônia há vários relatos de espécies ocorrendo em simpatria (Moojen, 1948; Patton & Gardner 1972; Patton et al., 2000). Vários caracteres morfológicos têm sido usados para conseguir uma delimitação das espécies, tais como morfologia do crânio, do báculo peniano, de pêlos, dentição, bula timpânica e coloração dos pêlos. Um dos mais importantes trabalhos de sistemática desse gênero foi feito por Patton (1987), o qual utilizou caracteres qualitativos de crânio, dentição e báculo para agrupar os 59 nomes válidos para o gênero em nove grupos distintos: guyannensis, goeldii, longicaudatus, simonsi, cuvieri, trinitatus, semispinosus, canicollis e decumanus. Apesar deste esforço, não é possível reconhecer cada uma das espécies apenas por meio de caracteres morfológicos, já que vários desses caracteres possuem variação geográfica, etária e sexual, muito embora eles sejam úteis para diferenciar espécies simpátricas (Patton & Gardner 1972, Gardner & Emmons, 1984). A combinação de caracteres morfológicos associados a informações extraídas do cariótipo e seqüenciamento de DNA tem se revelado como ferramenta poderosa para o entendimento da diversidade existente em Proechimys (Patton & Gardner 1972; da Silva 1998; Patton et al., 2000; Weksler et al., 2001). Contudo, ainda não existe uma filogenia robusta para as espécies desse gênero, o que dificulta o entendimento das relações de parentesco entre as espécies, o estudo de evolução dos caracteres e especialmente o estudo de evolução cromossômica. Atualmente são atribuídas 25 espécies a esse gênero (Wilson & Reeder, 2005), mas esse número poderá mudar uma vez que novas áreas sejam amostradas e novos estudos sobre a sistemática de Proechimys sejam realizados combinando dados ecológicos, morfológicos, citogenéticos e moleculares. 5

20 1.3. Citogenética de roedores A taxonomia dos roedores muitas vezes é dificultada pelas variações discretas na morfologia externa e craniana dos indivíduos (Bonvicino & Almeida, 2000; Gonçalves & Oliveira, 2004). Assim, o número de espécies de pequenos mamíferos terrestres conhecidos atualmente, provavelmente, encontra-se subestimado. Inicialmente, a determinação e distinção das espécies e suas relações de parentesco realizavam-se com base em suas diferenças e semelhanças morfológicas (Guerra, 1988). Em alguns casos, duas espécies podem apresentar padrões morfológicos com diferenças sutis ou até mesmo indistinguíveis, sendo consideradas espécies crípticas (Futuyma, 1992), necessitando assim a utilização de técnicas mais acuradas para seu reconhecimento. Nesse sentido, a citogenética constitui uma ferramenta fundamental para a separação de espécies crípticas ou complexos de espécies especialmente quando ocorrem em simpatria (Aniskin & Volobouev, 1999; Weksler et al., 2001; Granjon & Domigny, 2003; Lima et al., 2003), conforme observado em estudos nos gêneros Proechimys (Gardner & Emmons, 1984; Patton et al., 2000; Weksler et al., 2001) e Oryzomys (Musser et al., 1998; Volobouev & Aniskin, 2000). Algumas espécies de roedores apresentam o cariótipo bastante similar entre si, contudo, apresentam variação intraespecífica tanto na morfologia como no número de cromossomos (Aniskin & Volobouev, 1999), evidenciando a presença de rearranjos cromossômicos. Os dados citogenéticos mais comumente utilizados para a caracterização de espécies são o número, a morfologia e o padrão de bandeamentos cromossômicos (G ou C) (Guerra, 1988). Estes estudos permitem detectar polimorfismos cromossômicos (inversões, deleções, fissões, fusões e duplicações), os quais podem gerar a formação de indivíduos com cariótipos diversos na população, podendo ou não ocasionar a diferenciação de uma espécie por isolamento reprodutivo (meiose inviável) e conseqüente especiação (Volobouev & Catzeflis, 2000). A descoberta de diferenciação cariotípica em espécies nominais tem freqüentemente iniciado estudos de outros caracteres, resultando em descoberta de novas espécies (Capanna et al., 1977; Zima, 2000). Assim, investigações cromossômicas em espécies ainda não estudadas cariotipicamente podem contribuir para o entendimento da sistemática das mesmas, quando combinadas com análises morfológicas e moleculares. (Zima, 2000; Ventura et al., 2004). Os roedores ocupam uma posição de destaque na citogenética animal, 6

21 especialmente porque, comumente apresentam uma grande variabilidade cariotípica inter e intra-específica, além de uma alta freqüência de polimorfismo cromossômico, o que faz a caracterização cromossômica, nesse grupo, ser cada vez mais útil para a sistemática (Leal-Mesquita, 1991). Análises citogenéticas têm fornecido dados importantes sobre organização, variação e evolução cromossômica, além de, em alguns casos, serem caracteres diagnósticos em nível de espécie. No Brasil, os estudos citogenéticos nos pequenos mamíferos terrestres começaram em 1939, com um trabalho sobre Didelphis aurita, e somente depois de quase 30 anos outros esforços foram aplicados nessa área (Yonenaga-Yassuda et al., 1976). Na Amazônia poucos estudos citogenéticos com roedores têm sido feitos, tanto pela carência de recursos humanos e financeiros, como pelas dificuldades logísticas proporcionadas pela própria região, como por exemplo, o deslocamento a regiões mais distantes. Aproximadamente 45 espécies de roedores amazônicos foram cariotipadas, sendo os gêneros Proechimys, Oryzomys e Oecomys os mais representados. Entretanto, poucos desses trabalhos apresentaram dados de bandeamentos cromossômicos. A análise dos cromossomos mitóticos é determinante na caracterização e diferenciação de espécies de roedores, especialmente na Amazônia, onde muitas dessas espécies apresentam difícil separação morfológica. Estudos no gênero Proechimys revelam que a maioria das espécies possui cariótipos distinguíveis, mas nem sempre esses dados estão disponíveis ou o padrão geral não é diferente entre as espécies (Garder & Emmons, 1984). Dados cariotípicos têm sido úteis principalmente para a diferenciação de espécies simpátricas (Patton & Gardner, 1972; da Silva 1995; da Silva, 1998), todavia apresentando grande variação geográfica (Reig et al., 1980; Gardner & Emmons, 1984). Deste modo, este trabalho buscou fazer a caracterização citogenética de espécies do gênero Proechimys, dados esses que, quando associados a outras técnicas, auxiliarão na determinação do status taxonômico dessas espécies e no elucidamento do seu processo evolutivo e limites de distribuição. 7

22 1.4. Objetivos Objetivo geral Detectar marcadores cromossômicos espécie-específicos em espécies do gênero Proechimys, da região do Médio rio Madeira e vale do rio Jari (Amazônia), fornecendo dados que auxiliem na taxonomia das espécies Objetivos específicos Revisar os dados citogenéticos do gênero Proechimys, disponíveis na literatura. Apresentar o cariótipo de espécies do gênero Proechimys, da região do médio rio Madeira e vale do Jari (Amazônia). Estabelecer o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (Banda C), das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) e padrão de Banda G nos cromossomos mitóticos das espécies estudadas. 8

23 2. Material e Métodos 2.1. Material Os animais utilizados nesse estudo foram obtidos a partir da colaboração estabelecida com os seguintes projetos: (1) Inventário Faunístico do Médio rio Madeira - CNPq-PROBIO/MMA, (2) Sistemática, genética e ecologia de pequenos mamíferos do Vale do rio Jari, Pará e Amapá - CNPq /04, e (3) O Valor Biológico e Funcional de Florestas Primárias, Secundárias e Monocultivadas na Amazônia. Foram coletados 52 indivíduos do gênero Proechimys (Figura 1), sendo 45 da região do médio rio Madeira e sete do vale do rio Jari (Figuras 2 e 3; Tabelas 1 e 2). Figura 1: Indivíduo de Proechimys spp., capturado na região do médio rio Madeira. 9

24 Figura 2: Mapa da região norte da América do Sul, indicando os locais de coleta: 1 região do médio rio Madeira; 2 região do vale do rio Jari. O vale do rio Madeira engloba aproximadamente 1,4 milhões de quilômetros quadrados, cobrindo cerca de 20% da bacia amazônica. O rio Madeira nasce na Bolívia a cerca de quilômetros da sua desembocadura no rio Amazonas, sendo o seu mais longo tributário. Caracteriza-se por possuir águas fortemente barrentas ou brancas, enquanto seus tributários, como os rios Aripuanã e Machado (Ji-Paranã), localizados na margem direita, apresentam águas claras. Apresenta ainda, tributários de menor porte com águas pretas (Goulding et al., 2003). A maior parte da bacia em solo brasileiro corre em um vale aluvial, sujeito a inundações temporárias. A flutuação nesta parte do rio Madeira pode chegar a pouco mais de 10 metros e boa parte desta marcada flutuação é causada pelo barramento do rio Amazonas. Na região do médio rio Madeira localiza-se a desembocadura do rio Aripuanã, último grande afluente da porção médio-inferior na margem direita do Madeira, que está localizada em frente à cidade de Novo Aripuanã, a cerca de 400 quilômetros da boca do rio Madeira (Rapp Py-Daniel et al., 2007). 10

25 O rio Madeira tem sido apontado como divisor faunístico das regiões oeste e leste meridionais na Amazônia, desde os estudos de Wallace (1852) com primatas (o divisor setentrional seria o rio Negro e o rio Solimões/Amazonas o eixo divisor N- S). Trata-se também de uma importante via fluvial na região e mais recentemente foi aprovado o projeto de implantação do Gasoduto/ Petrobrás (Fase II Urucu Porto Velho), que percorrerá a área de interflúvio Madeira-Purus, com conseqüências ambientais ainda não estimadas. Para inventariar a área, foram escolhidos trechos nos rios Madeira e Aripuanã que possibilitassem acesso às duas margens de ambos os rios e representassem diferentes ambientes: várzea, terra firme e campina. Tabela 1: Áreas de coleta dos indivíduos e respectivos interflúvios na região do médio rio Madeira. Ponto Estação Área Interflúvio Coordenadas N 1 seca 2 seca 3 seca 4 seca 5 chuva 6 chuva 7 chuva Boca do Juma, margem direita do rio Aripuanã Lago Açaí, margem esquerda do rio Aripuanã Itapinima, margem direita do rio Madeira Cachoeirinha, margem esquerda do rio Madeira Trilha Pau Rosa, margem direita do rio Aripuanã Igarapé Arauazinho, margem esquerda do rio Aripuanã Comunidade Bela Vista, margem esquerda do rio Madeira Aripuanã-Tapajós Madeira-Aripuanã Madeira-Aripuanã Madeira-Purus Aripuanã-Tapajós Madeira-Aripuanã Madeira-Purus 06 o 00'53 S 60 o 10'45 W 06 o 00'52.7 S 60 o 12'32.4 W 05 o 25'28.1 S 60 o 42'54.8 W 05 o 29'26.6 S 60 o 49'28.5 W 06 o 17'45 S 60 o 23'35 W 06 o 17'44.3 S 60 o 23'33.99 W 05 o 14'45.97 S 60 o 42'50.58 W

26 Figura 3: Região do médio rio Madeira, com os pontos de coleta conforme indicados na Tabela 1 (modificado de da Silva et al., 2007). A região do vale do rio Jari abrange uma área de 17 mil quilômetros quadrados, divididos entre os estados do Pará (55%) e Amapá (45%), às margens do rio Jari (norte da bacia amazônica - 0 o 27'S; 51 o 40'W e 1 o 30'S; 53 o 20'W). Esta área pertence à empresa de Silvicultura Jari Celulose S.A., uma das maiores empresas do Brasil no ramo. A área é caracterizada por uma extensa plantação de Eucalyptus urograndis, com ciclo de rotação de seis anos, intercaladas e circundadas por áreas de florestas primárias e secundárias (Jari S.A., 2005), oferecendo um mosaico de ambientes naturais e antropogênicos, o que permite avaliar os efeitos desse cenário sobre a biodiversidade da região. As médias da temperatura anual e precipitação são de 26,4 o C e 2.115mm, respectivamente (Spangenberg et al., 1996; Leite, 2006). 12

27 Tabela 2: Áreas de coleta dos indivíduos na região do Vale do Jari. A nomenclatura das áreas é a mesma utilizada pela empresa Jari Celulose S.A. Estação Área Tipo de vegetação Coordenadas N seca Trilha 56, Monte Dourado, Pará Floresta secundária seca Área 14, Monte Dourado, Pará Floresta de eucalipto seca Área 55, Monte Dourado, Pará Floresta secundária seca Mata da Bituba, Monte Dourado, Pará Floresta primária 0 o 42'42.64 S 52 o 40'0.86 W 0 o 49'58.65 S 52 o 39'29.69 W 0 o 35'13.05 S 52 o 39'31.63 W 01 o 11'28.3 S 52 o 38'5.85 W

28 2.2 Métodos Coleta e processamento dos espécimes Na região do médio rio Madeira foram abertos sete transectos de metros de extensão em matas primárias, sendo dois no interflúvio Madeira Purus, três no interflúvio Madeira Aripuanã e dois no interflúvio Aripuanã Tapajós, perpendiculares à margem do rio. No vale do Jari foram abertos nove transectos também com metros de extensão, sendo três em matas primárias, três em matas secundárias (capoeira) e três em matas de eucalipto. Esses transectos foram feitos após um recuo de pelo menos 200m da borda da mata. A cada 20 metros foram colocadas duas armadilhas, uma do tipo Tomahawk (14x14x40cm) e outra do tipo Sherman (8x8x23cm). Nas estações ímpares, a armadilha do tipo Sherman foi disposta no sub-bosque e a do tipo Tomahawk no chão. Nas estações pares, a armadilha do tipo Sherman foi disposta no chão e a do tipo Tomahawk no subbosque, totalizando 160 armadilhas por transecto. Adicionalmente foram instaladas duas linhas de armadilhas do tipo pitfall, dispostas perpendicularmente, em cada transecto. Cada linha de pitfall foi composta por 10 baldes de 60L, distantes 10m um do outro, e uma faixa de lona conectando os baldes, que serviu como cercaguia. As estações foram verificadas todas as manhãs e as armadilhas iscadas a cada dois dias ou conforme a necessidade (por exemplo se a isca foi removida por algum inseto). A isca foi composta por rodelas de banana e bolotas de amendoim torrado e moído. O período de amostragem foi de 12 dias consecutivos em cada transecto, sendo dois transectos amostrados simultaneamente na região do Jari. Para cada localidade, os espécimes foram coletados e preparados segundo procedimentos utilizados em coleções científicas mastozoológicas. O primeiro passo foi a pesagem do animal com Pesolas, seguida de injeção de colchicina e após o tempo ideal o indivíduo foi sacrificado mediante inalação de éter etílico. Medidas externas foram tomadas antes da preparação dos espécimes e incluem: comprimento total, comprimento da cauda, comprimento da pata traseira e comprimento da orelha. Os animais tiveram sua condição reprodutiva verificada através da morfologia externa e autópsia. Foi feita uma incisão de aproximadamente 4cm na região ventral do animal para a retirada do fêmur, passando então para os demais procedimentos. Tais procedimentos incluíram preparações de pele e crânio; pele, crânio e esqueleto parcial; esqueletos 14

29 completos; pele, crânio e carcaça em meio líquido (fixada em formol 10% e preservada em álcool 70%); corpo em meio líquido com o crânio removido (fixado em formol 10% e preservado em álcool 70%). A identificação dos espécimes do Jari foi feita inicialmente pelo biólogo Rafael do Nascimento Leite, que estudou a ecologia de comunidades de pequenos mamíferos do Jari, e confirmada pela Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva (curadora da Coleção de Mamíferos/INPA); os espécimes do rio Madeira foram identificados preliminarmente e continuam sendo estudados pela mesma pesquisadora. Todos os espécimes foram depositados na Coleção de Mamíferos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Apêndice 1). As coletas e transporte do material biológico das duas áreas foram autorizados pelo IBAMA, através dos processos /03-11, / e / Obtenção dos cromossomos mitóticos (tratamento in vivo ) Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da medula óssea dos espécimes de roedores segundo a técnica air drying de Ford & Harmerton (1956) com algumas modificações. Foi injetada, intramuscular, uma solução aqüosa de colchicina 0,0125%, na proporção de 1mL/100g de peso corpóreo do indivíduo. Após 40 minutos, o indivíduo foi sacrificado por inalação de éter etílico, e seguiu a retirada do fêmur. Com o auxílio de uma seringa, foi feita a lavagem sucessiva do canal ósseo com 10mL de solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075M, coletando-se a medula óssea em uma cubeta de vidro. Em seguida, os fragmentos de medula óssea foram dissociados com o auxílio de uma seringa de vidro de 10mL, até a homogeneização completa da solução. A suspensão celular obtida foi mantida em banho-maria a 37 C por 20 minutos. Após este tempo, o material foi ressuspendido cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferido para um tubo de centrífuga. Dez gotas de fixador Carnoy (metanol: ácido acético 3:1) foram adicionadas à suspensão celular, que foi centrifugada por 10 minutos a 900 rpm, sendo posteriormente descartado o sobrenadante. Novamente o material foi ressuspendido com o auxílio de uma pipeta Pasteur em 10mL de fixador Carnoy. A suspensão foi novamente centrifugada durante 10 minutos a 900 rpm, sendo este procedimento repetido por mais duas vezes. Após a última centrifugação e a eliminação do sobrenadante, 1,5mL de fixador foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. Essa suspensão celular foi então guardada em tubo eppendorf e mantida em freezer para posterior preparação de lâminas. 15

30 Para o preparo das lâminas, foram pingadas duas a três gotas da suspensão em uma lâmina de vidro limpa (aquecida em água destilada até 50 o C), à uma altura de 30-40cm e deixada secar à temperatura ambiente. Essas lâminas foram coradas com solução de Giemsa, diluído a 5% em tampão fosfato ph 6,8, por 10 minutos, e em seguida lavadas em água destilada e deixadas secar ao ar Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) Para o estudo da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de Sumner (1972), com pequenas modificações. Lâminas contendo duas ou três gotas da suspensão celular foram envelhecidas em estufa a 60 o C por uma semana. Após esse período, as lâminas foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 45 o C, lavadas em água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Posteriormente, foram incubadas a 60 o C, em solução salina de cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, ph 6,8 (2xSSC), por 15 minutos, e lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida cada lâmina foi tratada separadamente em solução de hidróxido de bário 5%, filtrada e recém preparada, por 20 a 30 segundos. A ação do hidróxido de bário foi interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (45 o C), sendo posteriormente lavada em água destilada. Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC, em banho-maria a 60 o C, por um período de 40 minutos, sendo posteriormente secas ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e ph 6,8 por 20 minutos, lavadas e novamente secas ao ar Detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo foi utilizada a técnica de precipitação de cristais de prata (Ag-RON), descrita por Howell & Black (1980), com pequenas modificações. Consistiu em pingar sobre a lâmina recém preparada 2 gotas de uma solução coloidal (1g de gelatina comercial sem sabor, em 50mL de água destilada acrescida de 0,5ml de ácido fórmico) e adicionar sobre a mesma quatro gotas de solução aqüosa de nitrato de prata (AgNO3) a 50%. Agitar levemente a lâmina, que foi coberta com uma lamínula. A lâmina foi colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 o C, por um período de 3 a 7 minutos, até atingir uma coloração marrom dourada, sendo então lavada em água destilada, permitindo que a lamínula seja retirada naturalmente pela própria água. As lâminas foram secas diretamente ao ar. Quando necessário, as lâminas foram coradas com 16

31 Giemsa 3% em tampão fosfato 0,06M e ph 6,8 por 30 segundos, lavadas e secas ao ar Banda G (GTG) Para o bandeamento G foi utilizada a técnica descrita por Seabright (1971), com pequenas modificações. Esta constituiu em hidrolisar as lâminas recém preparadas por 15 minutos em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,06M e ph 6,8) a 60 o C, lavar em água destilada e secar ao ar. Posteriormente as lâminas foram imersas em uma solução contendo 5mL de tripsina 1% e 95mL de tampão fosfato ph 6,8, a uma temperatura próxima do congelamento. A ação da tripsina foi interrompida por meio de uma lavagem rápida em uma solução de 49mL de tampão fosfato acrescida de 1mL de soro bovino fetal e em seguida em uma solução de tampão fosfato e por último uma lavagem em água destilada. Após a secagem em temperatura ambiente, as lâminas foram coradas com Giemsa 5%, por 7 minutos, lavadas com água e secas ao ar Análise cariotípica As preparações cromossômicas foram examinadas em microscópio óptico comum com objetiva de imersão. Foram contadas pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo, com o intuito de estabelecer o valor modal (2n) e o número fundamental (número de braços) de cada espécime. As melhores metáfases foram fotografadas em microscópio óptico Zeiss Axiostar Plus utilizando uma máquina fotográfica digital Sony Cyber-shot DSC W7. As fotografias foram editadas em software para edição de imagem. Para a montagem dos cariótipos, os cromossomos metafásicos mitóticos bandeados (banda G) foram emparelhados, medidos e colocados em ordem decrescente de tamanho. A morfologia dos cromossomos foi determinada de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos mitóticos foram classificados com base no índice de relação de braços (RB= comprimento do braço maior/comprimento do braço menor), podendo ser metacêntricos (m) (RB= 1,0-1,70), submetacêntricos (sm) (RB=1,71-3,00), subtelocêntricos (st) (RB=3,01-7,00) e acrocêntricos (a) (RB>7,00). Na determinação do número de braços (NF A ) foram considerados apenas os autossomos, sendo que os metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e os acrocêntricos apenas um braço. 17

32 3. Resultados Foram analisados citogeneticamente 24 indivíduos (14 e 10 ) do gênero Proechimys, sendo 17 da região do médio rio Madeira e sete do vale do Jari, totalizando 686 células estudadas para a determinação do número diplóide (Tabela 3). Os espécimes foram agrupados em três grupos distintos: 2n=28 (duas espécies), 2n=38 e 2n=40. Tabela 3: Número diplóide, freqüência relativa (%), total de células analisadas e locais de coleta, para machos e fêmeas de Proechimys. Local de Coleta Madeira Aripuanã-Tapajós Aripuanã-Madeira Variação do 2n total de Espécie/sexo células INPA INPA INPA INPA INPA INPA INPA INPA INPA INPA Total Madeira Madeira-Purus Jari Jari % 14,0 10,0 62,2 5,5 8,3 INPA % 20,0 18,0 56,0 6,0 INPA INPA INPA INPA INPA INPA Total % 15,5 11,5 52,7 9,9 7,1 2,8 0,5 INPA INPA INPA INPA INPA INPA INPA Total % 1,2 3,0 11,0 13,0 60,9 6,2 4,7 18

33 Analisando a distribuição geográfica das espécies que apresentam 2n=28 cromossomos (Tabela 4), ao norte do local de coleta dos indivíduos do médio rio Madeira encontra-se P. cuvieri (2n=28 e NF A =46, rio Uatumã) e ao sul P. longicaudatus (2n=28 e NF A =48-50, norte do Mato Grosso, Rondônia e Goiás alto rio Madeira). Considerando caracteres morfológicos do crânio e principalmente do baculum, acreditamos que os indivíduos com 2n=28 cromossomos, provenientes da região do rio Madeira, constituem uma nova espécie de Proechimys, provavelmente pertencente ao grupo longicaudatus (sensu Patton 1987). Já o indivíduo com 2n=28 cromossomos capturado no Vale do rio Jari foi alocado na espécie P. cuvieri, baseado no número diplóide e distribuição geográfica desta espécie. Contudo, este apresentou características cranianas consideradas delicadas para esta espécie, sugerindo que talvez ele pertença a um outro grupo. Esse material está sendo analisado morfológica e molecularmente por da Silva e colaboradores (da Silva, com. Pess.). Os indivíduos que apresentaram 2n=40 cromossomos, provenientes da região do rio Madeira, foram alocados na espécie P. gardneri baseado em caracteres morfológicos do crânio e do baculum. Os indivíduos do Vale do rio Jari que apresentaram 2n=38 cromossomos foram alocados no grupo guyannensis (sensu Patton 1987) baseado na morfologia do crânio e baculum, número diplóide e distribuição geográfica. 19

34 3.1 Proechimys gr. longicaudatus 2n=28 Os indivíduos com 28 cromossomos da região do médio rio Madeira (8 e 2 ) apresentaram 14m+4sm+2st+6a + XX/XY e NF A =46. Os cromossomos sexuais são do tipo metacêntrico, sendo o cromossomo X maior que o Y. Três pares cromossômicos são significativamente maiores que os demais, sendo estes o primeiro par metacêntrico, primeiro par acrocêntrico e o par subtelocêntrico (Figuras 4a e 5a). A região organizadora de nucléolo (RON) localizou-se intersticialmente, no braço longo do segundo par submetacêntrico (par 9), sendo esta uma região de constricção secundária, visível em coloração convencional. Em cinco indivíduos provenientes do interflúvio Aripuanã-Tapajós foi observado heteromorfismo de tamanho da região organizadora de nucléolo em um dos homólogos (duplicação do sítio da RON), o que não foi observado nos indivíduos do interflúvio Aripuanã- Madeira, sugerindo tratar-se de dois citótipos: A (Figura 4b) e B (Figura 5b), respectivamente. A banda G permitiu o correto emparelhamento da maioria dos cromossomos homólogos (Figuras 4c e 5c). Para comparação entre os indivíduos foram escolhidos os quatro maiores pares cromossômicos e o par da RON. Esta comparação mostrou que o padrão de bandas é idêntico para todos os indivíduos. O padrão de heterocromatina constitutiva também separou os indivíduos em dois citótipos. O citótipo A (4 e 1 ) caracterizou-se por apresentar blocos heterocromáticos pericentroméricos em três pares metacêntricos (5, 6, 7), no par da RON (9), nos três pares acrocêntricos (11, 12 e 13) e nos cromossomos sexuais X e Y, não havendo marcação nos demais cromossomos. Em adição à marcação pericentromérica no cromossomo X, há também um pequena banda na região proximal deste cromossomo (Figura 4d). O citótipo B (4 e 1 ) caracterizou-se por apresentar blocos heterocromáticos fortemente marcados na região pericentromérica de todos os cromossomos, inclusive dos sexuais (Figura 5d). Em todos os casos, a RON foi negativa para a banda G e Banda C. 20

35 Figura 4: Características cariotípicas de Proechimys gr. longicaudatus (2n=28) Citótipo A: a) coloração convencional; b) RON (cromossomos estão com maior ampliação); c) Banda G; d) Banda C. 21

36 Figura 5: Características cariotípicas de Proechimys gr. longicaudatus (2n=28) Citótipo B: a) coloração convencional; b) RON; c) Banda G; d) Banda C. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. 22

37 3.2 Proechimys cuvieri 2n=28 O único indivíduo com 28 cromossomos ( ) da região do vale do Jari apresentou 14m+4sm+2st+6a + XX/XY e NF A =46. Os cromossomos sexuais são do tipo metacêntrico, sendo o cromossomo X maior que o Y. Três pares cromossômicos são significativamente maiores que os demais, sendo estes o primeiro par metacêntrico, primeiro par acrocêntrico e o par subtelocêntrico (Figura 6a). A região organizadora de nucléolo (RON) localizou-se intersticialmente, no braço longo do segundo par submetacêntrico (par 9), sendo esta uma região de constricção secundária, visível em coloração convencional (Figura 6b). A banda G permitiu o correto emparelhamento da maioria dos cromossomos homólogos (Figura 6c) e auxiliou também na determinação dos cromossomos sexuais. O padrão de heterocromatina constitutiva apresentou blocos heterocromáticos pericentroméricos em três pares metacêntricos (5, 6, 7), no par da RON (9), nos três pares acrocêntricos (11, 12 e 13) e no cromossomo sexual X, não havendo marcação nos demais cromossomos. Em adição à marcação pericentromérica no cromossomo X, um dos homólogos apresentou também uma pequena banda na região proximal (Figura 6d). Neste, a RON foi negativa para a banda G e Banda C. 23

38 Figura 6: Características cariotípicas de Proechimys cuvieri (2n=28): a) coloração convencional; b) RON; c) Banda G; d) Banda C. 24

39 3.3 Proechimys gr. guyannensis 2n=38 Os indivíduos com 38 cromossomos (4 e 2 ), provenientes do vale do Jari apresentaram 6m+4sm+6st+20a + XX/XY e NF A =52. O cromossomo X é do tipo subtelocêntrico e o Y é um pequeno acrocêntrico. Ainda, os três pares subtelocêntricos são significativamente maiores que os demais cromossomos do complemento (Figura 7a). A região organizadora de nucléolo localizou-se, intersticialmente, no braço longo do segundo par submetacêntrico (par 5), numa região de constrição secundária (Figura 7b). A banda G permitiu o emparelhamento preciso de todos os homólogos (Figura 7c). A heterocromatina constitutiva apresentou-se como marcações tênuas, presentes na região pericentromérica da maioria dos cromossomos, inclusive do X, sendo que os subtelocêntricos não tiveram nenhuma marcação. O cromossomo Y apresentou-se totalmente heterocromático (Figura 7d). Nesta espécie a RON também foi negativa para a banda C e G. 25

40 Figura 7: Características cariotípicas de Proechimys gr. guyannensis (2n=38): a) coloração convencional; b) NOR; c) Banda G; d) Banda C. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. 26

41 3.4 Proechimys gardneri 2n=40 Os indivíduos com 40 cromossomos, provenientes da margem esquerda do rio Madeira (2, 5 ), apresentaram 12m+4sm+22a + XX/XY e NF A =54. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos de tamanho médio e pequeno, respectivamente, em relação aos demais cromossomos do complemento. Os pares 1 e 2(m), 7(sm), 9, 10 e 11 (a) são de tamanho significativamente maior em relação aos demais cromossomos com a mesma morfologia (Figura 8a). A região organizadora de nucléolo localizou-se intersticialmente no braço longo do segundo par submetacêntrico (par 8) (Figura 8b). A banda G permitiu o correto emparelhamento da maioria dos cromossomos homólogos e auxiliou na determinação dos cromossomos sexuais (Figura 8c). O padrão de heterocromatina constitutiva apresentou-se em blocos conspícuos na região pericentromérica dos pares 3, 4, 5, 6, 9-19 (todos os acrocêntricos) e no cromossomo sexual X, sendo que o Y não mostrou nenhuma marcação (Figura 8d). Nesta espécie a RON também foi negativa para a banda C e G. 27

42 Figura 8: Características cariotípicas de Proechimys gardneri (2n=40): a) coloração convencional; b) NOR; c) Banda G; d) Banda C. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. 28

43 4. Discussão 4.1 Características cromossômicas de Proechimys Desde o início da década de 1970 estudos cariológicos vêm sendo realizados em espécies do gênero Proechimys (Patton, 1972). Em 1976 eram conhecidas 13 formas cariotípicas para, provavelmente, o mesmo número de espécies (Reig & Useche, 1976). Quase uma década depois, em 1984, esses números dobraram, com 28 formas cariotípicas para 25 espécies estudadas (Gardner & Emmons, 1984). Em uma revisão citogenética feita mais recentemente para o gênero, foi identificada a existência de 52 formas cariotípicas, com o número diplóide variando de 14 a 62 cromossomos (Weksler et al., 2001). Posteriormente, pelo menos outras cinco novas formas cariotípicas foram descritas (Bonvicino et al., 2005; Machado et al., 2005), totalizando assim 57 formas para o gênero Proechimys, embora correspondendo a um número menor de espécies (Tabela 4). Por outro lado, técnicas de bandeamento cromossômico só começaram a ser empregadas no final da década de 1970 (Barros, 1978) e ainda hoje os trabalhos que envolvem tais técnicas são escassos. Tabela 4: Formas cromossômicas determinadas para o gênero Proechimys compiladas da literatura e determinadas no presente trabalho (2n=número diplóide; NF=número de braços). Entre parênteses estão os nomes conforme a literatura original. *Grupos sensu Patton Grupo*/Espécies 2n NF Localidade Referência guyannensis P. roberti (oris) Curuá-Una e Primavera (Pará, Brasil) 10, 16 P. roberti Goiás, Tocantins, Maranhão (Brasil) 26 P. roberti Uruçuí-Una (Piuí, Brasil); Paranã, Peixe (Tocantins, Brasil); Cláudia, Gaucha do Norte, Vila Rica (Mato Grosso, Brasil) P. cherriei Cairara del Orinoco, Venezuela 23 Proechimys sp.a Barcelos e Santa Isabel (Amazonas, Brasil) Proechimys gr. guyannensis Vale do Jari (Pará, Brasil) este trabalho P. guyannensis Cayenne e Saül, Guiana Francesa 24 P. guyannensis Balta, Peru 20 Proechimys sp.b São João da Baliza (Roraima, Brasil)

44 Grupo*/Espécies 2n NF Localidade Referência goeldii P. goeldii Rio Xingu (Pará, Brasil) 21 P. steerei rio Juruá (Amazonas, Brasil) 21 P. steerei Pucallpa; Loreto; Balta (Peru) 10, 20, 23 P. cf. steerei Ucayali, Peru 2 P. amphichoricus Território Federal Amazonas, Venezuela 23 P. quadruplicatus Limoncocha (Napo, Equador) 10 P. quadruplicatus longicaudatus La Poza (Santiago, Peru); Lago Meduiním, Amazonas (Brasil) 4, 10, 21 P. longicaudatus margem direita, médio rio Madeira, Brasil este trabalho P. longicaudatus rio Jamari (Rondônia, Brasil), Juruena e Aripuanã (Mato Grosso, Brasil) 16, 17 P. longicaudatus Apiacás (Mato Grosso, Brasil), Parque Nacional das Emas (Goiás, Brasil) 17, 25 P. brevicauda rio Juruá, Acre, Brasil 21 P. brevicauda rio Tambopata, Madre de Dios, Peru 10 P. brevicauda (longicaudatus) Tingo María, Peru 10, 19, 20 P. brevicauda (longicaudatus) Balta, Peru 10, 19, 20 P. brevicauda (longicaudatus) rio Curanja, Ucayali, Peru 10, 19, 20 P. brevicauda Rio Cenepa, Amazonas, Peru 10 P. gularis Limoncocha (Napo, Equador) 10 Proechimys sp Ucayali, Peru 2 Proechimys sp Ucayali, Peru 2 Proechimys sp Loreto, Peru 2 Proechimys sp Loreto, Peru 2 Proechimys gr. longicaudatus rio Jamari (Rondônia, Brasil) 16 simonsi P. simonsii (hendeei) Balta, Peru; Putumayo, Colômbia 20, 23 P. simonsii Equador e região sul do Peru 10 P. cf. simonsii Ucayali, Loreto (Peru) 2 cuvieri P. cuvieri Usina Hidrelétrica de Balbina (rio Uatumã), Macaco (rio Jaú); Vale do Jari (Pará, Brasil) 18, 21, este trabalho P. cuvieri Altamira (Pará, Brasil) 21 P. cuvieri Cayenne, Guiana Francesa; Acre, Brasil 21, 24 trinitatis P. poliopus Táchira, Zulia, Merida (Venezuela) 23 P. poliopus Kasmera, Los Andes del Tucuco (Venezuela) 1 P. guairae Aragua, Venezuela 22 P. guairae El Limon Turimo, Palmero, Turém, Cueva de Agua e San Juan de Areo (Venezuela) 1 30

45 Grupo*/Espécies 2n NF Localidade Referência P. guairae Aragua, Carabobo, Falcon (Venezuela) 23 P. guairae Ocumare, Aragua (Venezuela) 11 P. mincae Minca, Magdalena (Colombia) 10 P. guairae spp Cojedes, Portuguesa (Venezuela) 23 P. trinitatis Cueva del Guacharo, Venezuela 1 P. trinitatis (P. urichi) Monagas, Venezuela 23 P. urichi (Proechimys sp.) Barinas, Venezuela 23 Proechimys sp. semispinosus Guaquitas, Tierra Buena Las Matas, La Nulita (Venezuela) 1 P. semispinosus Ilha Gorgona, Choco (Colômbia) 5, 12 P. semispinosus Santa Rosa, Equador 10 P. semispinosus Limón, Costa Rica; Canal Zone, Panamá; Valle, Colômbia; Esmeraldas e El Oro, Equador 10, 20 P. semispinosus Cariari, Costa Rica 20 P. oconnelli Meta, Colômbia 10 canicollis P. canicollis decumanus P. decumanus Bonda, Magdalena (Colômbia); rio Cachiri, Venezuela) Aguas Verdes, Tumbes (Peru); Guayas, El Oro (Equador) 1, Não determinado P. pattoni alto rio Juruá (Acre, Brasil); Ucayali, Madre de Dios, Puno, Balta, Loreto (Peru) P. gardneri margem esquerda, médio rio Madeira (Amazonas, Brasil) 7, 20, 19 este trabalho P. gardneri rio Juruá (Amazonas, Brasil); Abuna e General Frederico Roman (Bolívia) 7 P. echinothrix rio Juruá (Amazonas, Brasil) 7 P. kulinae rio Juruá (Amazonas, Brasil) 7 Proechimys sp Amazonas, Brasil 3 Proechimys sp rio Jamari (Rondônia, Brasil) 16 Proechimys sp Boyacá, Colômbia 7 Acampamento Cabo Frio (Manaus, Proechimys sp Amazonas, Brasil) 1 = Aguilera & Corti (1994); 2 = Aniskin (1994); 3 = Barros (1978); 4 = Bonvicino et al. (2005); 5 = Bueno & Gomez-Laverde (1993); 6 = Bueno et al. (1989); 7 = da Silva (1998); 8 = Emmons (1982); 9 = Emmons & Feer (1997); 10 = Gardner & Emmons (1984); 11 = George & Weir (1973); 12 = Gomez-Laverde et al. (1990); 13 = King (1993); 14 = Lara et al. (1996); 15 = Lara & Patton (2000); 16 = Leal-Mesquita (1991); 17 = Machado et al. (2005); 18 = Maia & Langguth (1993); 19 = Patton (1987); 20 = Patton & Gardner (1972); 21 = Patton et al. (2000); 22 = Reig (1989); 23 = Reig & Useche (1976); 24 = Reig et al. (1979); 25 = Rodrigues et al. (2002) ; 26 = Weksler et al. (2001) 31

46 Patton & Gardner (1972) referiram-se aos espécimes de Balta, Perú, como P. guyannensis, enquanto Patton (1987) os denominou Proechimys sp, incluindo-os provisoriamente no grupo cuvieri. Em 1998, da Silva incluiu os espécimes de Balta na nova espécie P. pattoni. Considerando as diferenças morfológicas e a inexistência de evidências moleculares associando esta espécie a um dos grupos de Proechimys definidos por Patton (1987), optou-se pela não determinação do grupo no qual P. pattoni estaria associado. Devido ao caos taxonômico ainda existente para Proechimys, a simples comparação dos dados cromossômicos obtidos com os disponíveis na literatura torna-se uma atividade difícil. Uma mesma espécie, pela falta de estudos adequados, pode ainda ser chamada por dois nomes distintos. Existe grande sobreposição de número diplóide entre diferentes espécies, como é o caso de P. pattoni e P. gardneri da região do rio Juruá, em que ambas apresentam 2n=40 cromossomos e NF A =56 (da Silva, 1998), ou ainda, uma mesma espécie pode apresentar mais de uma forma cariotípica, tal como P. cuvieri, com 2n=28 cromossomos, mas com populações apresentando NF A =46 (Amazonas e Acre, Brasil) e outras com NF A =50 (Amazonas, Brasil; Guiana Francesa) (Reig et al., 1979; Maia & Langguth, 1993; Patton et al., 2000). No caso em que espécies distintas apresentam o mesmo cariótipo, os bandeamentos cromossômicos tornam-se ferramentas indispensáveis na caracterização cromossômica das mesmas. É importante ressaltar que em alguns casos o NF não é uma boa ferramenta de comparação entre as espécies de roedores, pois este pode variar de acordo com o grau de condensação dos cromossomos nas metáfases estudadas, especialmente em cromossomos pequenos (Bueno et al., 1989). A grande diversidade cariotípica do gênero Proechimys é freqüentemente relatada (Patton & Gardner, 1972; Reig & Useche, 1976; Gardner & Emmons, 1984; Weksler et al., 2001; Bonvicino et al., 2005). Essa diversidade, aliada à dificuldade para a delimitação das espécies desse gênero, sugere que esse é um grupo de vertebrados em evolução ativa, propício para estudar o processo evolutivo e suas manifestações iniciais (Reig & Useche, 1976). Na maioria dos casos, essa grande diversidade cariotípica não pode ser explicada exclusivamente por eventos robertsonianos de fusão-fissão cêntrica, já que estudos com populações da Venezuela mostraram que além desses, rearranjos não-robertsonianos como inversões pericêntricas, deleções, entre outros foram necessários para originar tais 32

47 cariótipos (Reig & Useche, 1976). É sabido que, em geral, cariótipos com baixo número diplóide possuem, em sua maioria, cromossomos de dois braços, enquanto cariótipos com número diplóide elevado possuem maior número de cromossomos com um braço, o que deixa evidente que rearranjos robertsonianos estão atuando na evolução cariotípica deste grupo. Reig & Useche (1976) hipotetizaram que, em roedores, cariótipos com elevado número diplóide e cariótipos com baixo número diplóide representam duas tendências de evolução cromossômica, a partir de cariótipos com número diplóide intermediário entre 40 e 50 cromossomos. No presente trabalho foram verificados três números diplóides (28, 38, 40). Neste contexto, poderíamos sugerir que Proechimys gardneri (2n=40 cromossomos) seria uma espécie mais basal, enquanto as demais, P. cuvieri (2n=28), P. gr. longicaudatus (2n=28) e Proechimys gr. guyannensis (2n=38) mais derivadas. Entretanto, não existe na literatura uma filogenia para o gênero Proechimys onde as relações entre as espécies desse roedor sejam bem estabelecidas, inviabilizando, no momento, qualquer análise mais profunda sobre evolução cromossômica entre espécies de Proechimys. Em 1998, da Silva apresentou uma filogenia molecular tendo por base o gene mitocondrial citocromo b. Embora essas análises tenham apoiado a extrema diferenciação dos 13 táxons de Proechimys representados, o suporte para os nós mais profundos (e antigos) da árvore foi praticamente inexistente. Estudos moleculares em andamento (Schetino, da Silva & Porto, dados não publicados) procuram abordar essa questão Proechimys gr. longicaudatus e P. cuvieri 2n=28 Até o momento, 2n=28 cromossomos foi relatado para seis espécies de Proechimys: P. longicaudatus, P. quadruplicatus. P. brevicauda, P. cuvieri, P. sp.1 e P. sp.3, com os valores do número fundamental variando entre as espécies e mesmo dentro de uma mesma espécie (Tabela 4). Cromossomicamente P. cuvieri da região do vale do Jari se assemelha a P. cuvieri da região do rio Uatumã, diferenciando na nomenclatura do maior par cromossômico (Maia & Langguh, 1993) e na morfologia dos cromossomos sexuais, pois em P. cuvieri da região do rio Uatumã os cromossomos X e Y são acrocêntricos e em P. cuvieri da região do Jari são metacêntricos, sendo o X maior que o Y, em ambos casos. Entretanto, não se pode afirmar qual morfologia dos 33

48 cromossomos sexuais é mais basal, uma vez que não existem dados filogenéticos robustos para esse gênero. Contudo, é possível afirmar que essa diferenciação cromossômica envolveu rearranjos do tipo inversão pericêntrica. Mesmo essas duas populações apresentado complementos autossômicos iguais (mesmo NF A ), a diferença verificada nos cromossomos sexuais e no padrão de banda C permite afirmar que elas representam unidades evolutivas distintas e a forma cariotípica encontrada na região do Jari é inédita para o gênero. Segundo Patton (1987), o grupo no qual essa espécie está inserida (grupo cuvieri) é monotípico. Entretanto, já são conhecidas pelo menos três formas cariotípicas para P. cuvieri, todas com 2n=28 cromossomos, mas variando o NF A (46, 48 e 50) e os dados do presente trabalho mostram mais um citótipo. Deste modo, faz-se necessário uma revisão taxonômica do grupo para verificar se esta variabilidade cromossômica representa ou não espécies distintas e neste caso, o grupo cuvieri deixaria de ser monotípico. Já para P. gr. longicaudatus, também é a primeira vez que é registrada uma população com 28 cromossomos e NF=46. Outros três citótipos com o mesmo número diplóide foram verificados na região do alto rio Madeira e Goiás, mas com NF A variando de Nestes, é verificado apenas um par de cromossomos acrocêntricos, sendo que na população do Parque Nacional das Emas (GO), este par é de tamanho pequeno em relação aos demais do complemento e nas populações do norte do Mato Grosso e Rondônia (alto Madeira) são de tamanho grande. Já em P. gr. longicaudatus do médio rio Madeira (presente trabalho) foram verificados três pares de cromossomos acrocêntricos. Outra importante diferença entre as populações de P. longicaudatus do alto e médio rio Madeira são os cromossomos sexuais. As populações do alto Madeira apresentam o cromossomo X como sendo um submetacêntrico de tamanho médio e o Y um pequeno acrocêntrico. Na população de Goiás ambos são acrocêntricos, sendo o X maior que o Y. Já nas populações do médio rio Madeira os cromossomos X e Y são metacêntricos, sendo o X maior que o Y. Novamente não podemos afirmar qual desses caracteres é ancestral, entretanto fica claro que são eventos de inversão pericêntrica que originaram essa diversidade de cromossomos sexuais e ainda, tais eventos ocorreram independentemente nos cromossomos X e Y. Considerando a distribuição geográfica proposta para o grupo P. longicaudatus (Patton, 1987), a amostragem deste trabalho juntamente com os dados de Machado et al. (2005) indicam uma ampliação da mesma, estendendo o 34

49 limite leste até o interflúvio Aripuanã-Tapajós e o limite sudeste atingindo o estado de Goiás (Figura 9). Figura 9: Mapa de distribuição das formas cariotípicas do grupo longicaudatus. A área escura mostra a distribuição geográfica proposta para o grupo (Patton, 1987) e a área hachurada a ampliação da distribuição proposta. 1= P. gularis 2n=30, NF A =48, Napo, Equador (Gardner & Emmons, 1984); 2= P. brevicauda 2n=30, NF A =48, rio Cenepa, Peru (Gardner & Emmons, 1984); 3= Proechimys sp.3 2n=28, NF A =51-52, Loreto, Peru (Aniskin, 1994); 4= Proechimys sp.4 2n=34, NF A =56, Loreto, Peru (Aniskin, 1994); 5= P. brevicauda 2n=28, NF A =50, Tingo María, Peru (Gardner & Emmons, 1984; Patton, 1987; Patton & Gardner, 1972); 6= P. brevicauda 2n=28, NF A =50, rio Curanja, Ucayali, Peru (Gardner & Emmons, 1984; Patton, 1987; Patton & Gardner, 1972); 7= Proechimys sp.1 2n=28, NF A =51-52, Ucayali, Peru (Aniskin, 1994); 8= Proechimys sp.2 2n=30, NF A =50, Ucayali, Peru (Aniskin, 1994); 9= P. brevicauda 2n=28, NF A =48, rio Juruá, Acre, Brasil (Patton et al., 2000); 10= P. brevicauda 2n=28, NF A =50, Balta, Peru (Gardner & Emmons, 1984; Patton, 1987; Patton & Gardner, 1972); 11= P. brevicauda 2n=28, NF A =48, rio Tambopata, Madre de Dios, Peru (Gardner & Emmons, 1984); 12= P. longicaudatus 2n=28, NF A =48, rio Jamari, Mato Grosso, Brasil (Leal-Mesquita, 1991; Machado et al., 2005); 13= P. gr. longicaudatus 2n=30, NF A =52, rio Jamari, Mato Grosso, Brasil (Leal-Mesquita, 1991); 14= P. gr. longicaudatus 2n=28, NF A =46, margem direita do rio Madeira, Amazonas, Brasil (este trabalho); 15 e 16= P. longicaudatus 2n=28, NF A =48, Aripuanã (15) e Juruena (16), Mato Grosso, Brasil (Machado et al, 2005); 17 e 18= P. longicaudatus 2n=28, NF A =50, Apiacás, Mato Grosso (17) e Parque Nacional das Emas, Goiás (18), Brasil (Machado et al., 2005; Rodrigues et al., 2002). 35

50 4.1.2 Proechimys gr. guyannensis 2n=38 Para o gênero Proechimys, esta é a segunda ocorrência do número diplóide igual a 38 cromossomos. O primeiro registro desse cariótipo foi feito por Bonvicino et al. (2005) para animais provenientes da região de Barcelos e Santa Isabel (margem esquerda, alto rio Negro, AM). O cariótipo verificado no presente trabalho para Proechimys gr. guyannensis é idêntico ao descrito por Bonvincino et al. (op.cit.) para o número diplóide 38, inclusive o padrão de banda G. Todavia, esses autores classificaram o cromossomo X como sendo um acrocêntrico de tamanho médio. Em Proechimys gr. guyannensis (presente trabalho) este cromossomo apresentou-se como submetacêntrico de tamanho médio. Uma comparação da Figura 6 (este estudo) e Figura 2 de Bonvincino et al. (2005) sugere tratar-se de um único cariótipo, mas com uma diferença de classificação cromossômica entre os estudos. Bonvicino et al. (2005) também associaram os animais com número diplóide de 38 cromossomos do alto rio Negro ao grupo guyannensis (sensu Patton, 1987). Apesar de provável, ainda não é possível afirmar tratar-se de uma mesma espécie, pois existe uma grande distância geográfica separando tais populações. Como visto anteriormente, algumas espécies do gênero possuem o cariótipo idêntico, ao menos em nível de número diplóide e número fundamental, embora no caso em questão o padrão de bandeamento similar sugira tratar-se de um único táxon. Estudos moleculares e morfológicos em andamento irão provavelmente elucidar essa questão (da Silva e colaboradores, dados não publicados). É interessante notar que as localidades de ocorrência do 2n=38 cromossomos no gênero Proechimys estão numa região delimitada a oeste pelo rio Negro e ao sul pelo rio Amazonas (figura 10). 36

51 Figura 10: Mapa dos locais de ocorrência de Proechimys 2n=38. A área escura mostra a distribuição geográfica delimitada pelo rio Negro (a oeste) e Amazonas (ao sul). 1= Proechimys sp.a., alto rio Negro, Amazonas (Bonvicino et al., 2005); 2= Proechimys gr. guyannensis, vale do Jari, Pará (este trabalho) Proechimys gardneri 2n=40 Animais do rio Madeira com número diplóide de 40 cromossomos foram provisoriamente identificados como P. gardneri tendo por base caracteres morfológicos e citogenéticos, embora aparentemente esses animais sejam maiores, mais robustos e com pêlos aristiformes mais rígidos que os indivíduos provenientes do rio Juruá. Análises moleculares em andamento permitirão uma melhor apreciação da associação e grau de diferenciação entre os animais provenientes de ambas bacias hidrográficas (da Silva e colaboradores, com. pessoal), contribuindo assim para uma determinação taxonômica mais acurada. Até o momento, são conhecidas quatro espécies com número diplóide igual a 40 cromossomos: P. cherriei, P. guyannensis (ambas com NF A =54), P. pattoni e P. gardneri (com NF A =56) (Tabela 4). Apesar do cariótipo de Proechimys gardneri do 37

52 rio Madeira estudado no presente trabalho ter os mesmos número diplóide e fundamental que P. guyannensis e P. cherriei, da Guiana Francesa e Venezuela, respectivamente (Reig et al., 1979; Reig & Useche, 1976), morfologicamente os cromossomos dessa espécie são mais semelhantes aos cromossomos de P. gardneri e P. pattoni, ambas da região do rio Juruá. Proechimys gardneri da região do médio rio Madeira possui dois pares de cromossomos metacêntricos maiores que os demais de mesma morfologia, dois pares submetacêntricos, sendo um ligeiramente maior que o outro e três pares acrocêntricos significativamente maiores que os demais de mesma morfologia (Figura 8). Essas características são observadas em P. pattoni e P. gardneri da região do rio Juruá (da Silva, 1998), sendo a diferença entre essas e Proechimys gardneri do rio Madeira aqui estudada apenas um par de cromossomos, que nesta espécie é o menor par acrocêntrico e nas outras duas o menor par metacêntrico. Deste modo, confirmada a determinação dos animais do rio Madeira, é registrada no presente trabalho uma nova forma cariotípica para P. gardneri. P. guyannensis e P. cherriei, as duas espécies com NF A =54, possuem cinco pares cromossômicos submetacêntricos, sendo dois deles de tamanho significativamente maior que os demais, e um par de acrocêntricos também significativamente maior que os demais de mesma morfologia. Os cromossomos sexuais de P. gardneri do médio rio Madeira, por sua vez, são semelhantes aos cromossomos sexuais das espécies P. pattoni e P. gardneri, que apresentam NF A =56, sendo X e Y acrocêntricos e X maior que o Y. Já, o cromossomo X das espécies com NF A =54 é subtelocêntrico. Considerando a distribuição geográfica proposta para P. gardneri por da Silva (1998), os dados do presente trabalho reforçam que o limite leste de distribuição para esta espécie pode ser o rio Madeira, sugerindo, portanto uma ampliação da distribuição dessa espécie nessa direção, tendo possivelmente o rio Solimões e um pequeno trecho do rio Amazonas (até a foz do rio Madeira) como limite norte (Figura 11). 38

53 Figura 11: Mapa de distribuição das formas cariotípicas de P. gardneri. A área escura mostra a distribuição proposta para a espécie (da Silva, 1998) e área hachurada o aumento da distribuição proposta neste trabalho. 1= Altamira, rio Juruá, Brasil (da Silva, 1998); 2= Província Abuna, Bolívia (da Silva, 1998); 3= Provincia General Federico Roman, Bolívia (da Silva, 1998); 4= alto rio Urucú, Amazonas, Brasil (da Silva, 1998); 5= margem esquerda do médio rio Madeira, Amazonas, Brasil (este trabalho). O papel dos grandes rios como barreiras geográficas e delimitadores de distribuição de espécies na Amazônia há muito vem sendo discutido (Wallace, 1852; Haffer 1969, 1997; Ayres, 1986; Capparella, 1987, 1988 e 1991; Cracraft &. Prum, 1988; Ayres & Clutton-Brock, 1992; Cohn-Haft, 2000). No que se refere a distribuição geográfica das espécies de Proechimys, é plausível considerar o papel que os grandes rios da região tiveram como barreira geográfica e conseqüentemente como limitadores de distribuição das espécies. Entretanto, inúmeros exemplos podem ser citados onde um dado táxon ocorre nas duas margens de grandes rios, como é o caso de P. cuvieri, que ocorre em ambas margens do rio Amazonas, P. gardneri, que ocorre nas duas margens dos rios Juruá e Purus, ou ainda P. steerei e P. simonsi encontrado em ambas as margens dos rio Juruá (Matocq et al., 2000). 39