FUNDAÇÃO EDUCACIONAL MIGUEL MOFARREJ FACULDADES INTEGRADAS DE OURINHOS MEDICINA VETERINÁRIA CLONAGEM EM EQUINOS ULLY THEODORO ROSA

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1 FUNDAÇÃO EDUCACIONAL MIGUEL MOFARREJ FACULDADES INTEGRADAS DE OURINHOS MEDICINA VETERINÁRIA CLONAGEM EM EQUINOS ULLY THEODORO ROSA OURINHOS - SP 2015

2 ULLY THEODORO ROSA CLONAGEM EM EQUINOS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Medicina Veterinária das Faculdades Integradas de Ourinhos como pré requisito para obtenção do Título de Bacharel em Medicina Veterinária Orientadora: Profª. Drª. Fernanda Saules Ignácio OURINHOS-SP 2015

3 ROSA, Theodoro Ully Clonagem em equinos. / Ully Theodoro Rosa- Ourinhos, SP: FIO, f.; 30cm Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso de Medicina Veterinária) Faculdades Integradas de Ourinhos, Orientadora: Profª Drª Fernanda Saules Ignácio 1. Clonagem Equina 2. Bipartição Embrionária 3. Transferência Nuclear 4. Clones Equinos no Brasil I. Biotecnologia da Reprodução II. Clonagem em Equinos

4 ULLY THEODORO ROSA CLONAGEM EM EQUINOS Esta monografia foi julgada e aprovada para obtenção do Título de Bacharel no Curso de Medicina Veterinária das Faculdades Integradas de Ourinhos. Ourinhos, 15 de Dezembro de 2015 Prof. Dr. Cláudia Yumi Matsubara Rodrigues Ferreira Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária BANCA EXAMINADORA Profª. Drª Fernanda Saules Ignácio Profª. Drª. Cláudia Yumi Matsubara Rodrigues Ferreira Profª. Drª. Isabela Bazzo da Costa

5 Dedico este trabalho, aos meus professores, presentes em todo trajeto, que além de formação acadêmica são os grandes formadores de caráter!

6 AGRADECIMENTOS Inicialmente a Deus, aquele que me guia e me fortalece perante cada obstáculo que tenta me barrar, ao que me dá a dádiva da vida a cada amanhecer e às 24 horas de cada dia pra correr atrás dos meus objetivos; A minha exclusiva e querida mãe, que desde o início se prontificou a ajudar no que pudesse e estivesse ao alcance e fora dele; Meu pai, por proporcionar mês a mês cada fase dos meus estudos e por nunca duvidar da minha capacidade; Meu irmão Cayo pela existência, e por me incentivar sempre; Ao meu namorado Vitor Hugo, que não esqueceu de advertir constantemente os meus compromissos, e sei que em pensamento apostava em mim; As amigas, que participaram diretamente e indiretamente das minhas preocupações, Isadora e Daniele. Ao meu concedente de estágio, Beto Ramires, pelo incentivo diário, preocupação, apoio e compreensão. A minha orientadora, Fernanda, primeiro pelo sim na orientação, segundo pelo amparo na conclusão deste trabalho e por último, por considerar que poderíamos ter feito mais..

7 Acredite em milagres, mas não dependa deles. Immanuel Kant

8 RESUMO Obter descendentes de animais geneticamente acima da média, com valor genético definido, vem sendo alvo de grupos de pesquisa envolvidos na reprodução e produção animal e o investimento no estudo e desenvolvimento das diversas biotecnologias vêm sendo utilizadas como ferramenta para o desenvolvimento desse objetivo. A clonagem é deferida como uma biotecnologia de última geração, e busca-se a triagem de protocolos visando melhorias para o entendimento das funções nucleares, moleculares e citoplasmáticas para aperfeiçoar a técnica, onde o princípio consiste na produção de animais geneticamente idênticos. Existem duas técnicas distintas, a bipartição embrionária e a transferência nuclear (TN) (TN), e a utilização da clonagem com fins comerciais ainda é inconsistente devido a fatores limitantes como a dúvida quanto ao benefício da clonagem a longo prazo, dissolução dos inúmeros e controversos debates considerando os diversos aspectos relacionados a clonagem, como a ética, moral e a legalidade da produção de tais animais e seu propósitos, e também os custos, falhas embrionárias pré-natais, e pós-natais. No Brasil, recentemente a técnica foi introduzida comercialmente para a espécie equina e estas questões vem sido levada a tona nas discussões sobre o uso ou não da técnica. O objetivo deste trabalho é revisar as técnicas de clonagem e levantar importantes discussões sobre o tema. Palavras- chave: Clones. Equinos. Transferência nuclear.

9 ABSTRACT Get animal offspring genetically above average, with defined genetic value, has been the target of research groups involved in reproduction and animal production and investment in the study and development of various biotechnologies are being used as a tool for development that goal. Cloning is granted as a cutting-edge biotechnology, and seeks to screening protocols for improvements to the understanding of nuclear, cytoplasmic and molecular functions to perfect the technique, where the principle is the production of genetically identical animals. There are two distinct techniques, embryo splitting and nuclear transfer (TN), and the use of cloning for commercial purposes is still inconsistent due to limiting factors such as doubt about the benefit of long-term cloning, dissolution of the numerous and controversial debates considering the various aspects related to cloning, such as ethics, morality and legality of the production of such animals and their purposes, and also the costs, prenatal embryonic failure, and postnatal. In Brazil, the technique was recently introduced commercially for equine species and this issue has been brought to the fore in discussions about whether or not the technique. The objective of this paper is to review the cloning techniques and raise important discussions on the subject. Keywords: Cloning. Horses. Nuclear Transfer.

10 SUMÁRIO PARTE I RELATÓRIO DE ESTÁGIO PARTE II INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA História da Clonagem Técnicas de clonagem Bipartição de Embriões Transferência nuclear (TN) Qualidade dos oócitos não fecundados e enucleados Enucleação oócitaria Células doadoras de núcleos Reconstituição Ativação Reprogramação Nuclear Clonagem na espécie equina: Pesquisa e Mercado CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

11 LISTA DE IMAGENS IMAGEM 1- Éguas receptoras para transferência de embrião... 5 IMAGEM 2 - Palpação transretal em égua doadora IMAGEM 3 - Embriões em placa de petri IMAGEM 4 - Coleta de sêmen... 6 IMAGEM 5 - Avaliação seminal... 6 IMAGEM 6 - Odontologia equina

12 LISTA DE TABELAS TABELA 1- DESCRIÇÃO DE ATIVIDADES REALIZADAS NA PRIMEIRA ETAPA DO ESTÁGIO CURRICULAR... 2 TABELA 2 - DESCRIÇÃO DE ATIVIDADES REALIZADAS NA SEGUNDA ETAPA DO ESTÁGIO CURRICULAR... 4

13 LISTA DE ABREVIATURAS CCO - complexo cumulus ovócito DMAP - deimethylamino-purine DNA - ácido desoxirribonucleico DDT- dithiothreitol ICSI - injeção intracitoplasmática de espermatozoide OPU - aspiração ecoguiada de ovócito RNA - ácido ribonucleico TCM Tissue Culture Medium

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15 1 PARTE I 1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO Introdução O estágio curricular é de caráter obrigatório na conclusão do curso de Medicina Veterinária das Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO). Este foi realizado em duas etapas. A primeira foi realizada do período 01 de agosto a 31 de agosto do ano de 2015, CRIA Reprodução Equina, nas dependências da Fazenda Santo Antonio dos Palmares, Botucatu- SP, e segunda etapa na região de Avaré- SP, Paulo Roberto Novaes Ramires, Veterinário autônomo, e está sendo realizada pelo restante do período 01 de setembro a 30 de novembro de Identificação da Primeira Etapa do Estágio: Área de Estágio: Biotecnologia da Reprodução Animal Local: CRIA reprodução equina, Fazenda Santo Antônio dos Palmares, Botucatu - SP Orientador Acadêmico: Fernanda Saules Ignácio Supervisor de Estágio: Milena da Silva Machado Período: 01 de Agosto a 31 de Agosto de 2015 Plano de Atividades (ETAPA 1): - Palpação e ultrassonografia transretal de éguas receptoras com diversos intuitos em cada animal em específico, a fim de avaliar o estado reprodutivo, acompanhamento folicular, ovulação, presença de anormalidades, e diagnóstico gestacional; - Inseminação artificial com sêmen a fresco vindo de outras propriedades; - Transferência embriões (através de solicitação de proprietários a Veterinária responsável); - Alimentação diária específica do total de animais, dentre potros, éguas prenhes, éguas vazias;

16 2 -Plano sanitário incluindo vermifugação e vacinação; - Acompanhamento clínico dos animais. TABELA 1- DESCRIÇÃO DE ATIVIDADES REALIZADAS NA PRIMEIRA ETAPA DO ESTÁGIO CURRICULAR DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO PALPAÇÃO TRANSRETAL E ULTRASSONOGRAFIA DE ÉGUAS RECEPTORAS PARA DIAGNÓSTICO GESTACIONAL TOTAL DE ANIMAIS 10 PALPAÇÃO TRANSRETAL E ULTRASSONOGRAFIA EM DIAS ALTERNADOS DE ÉGUAS RECEPTORAS PARA ACOMPANHAMENTO DE CICLO ESTRAL 10 PALPAÇAO TRANSRETAL E ULTRASSONOGRAFIA EM DIAS ALTERNADOS DE ÉGUAS DOADORAS (CRESCIMENTO FOLICULAR E DETERMINAR MOMENTO DO PEDIDO DO SÊMEN E INSEMINAÇÃO) 2 INDUÇÃO DA OVULAÇÃO EM ÉGUAS DOADORAS E RECEPTORAS (GnRH e hcg) SOLICITAÇÃO DE SÊMEN (A FRESCO) VERMIFUGAÇÃO DO REBANHO (HIPOFEN) VACINAÇÃO DE ÉGUAS PRENHES (PNEUMOABORT) DIETA DIÁRIA DO REBANHO 2X AO DIA (AVEIA, RAÇÃO COMERCIAL) FENO DE ALFAFA PARA ÉGUAS PRENHES 1 FARDO/DIA ROTAÇÃO DE PASTAGEM 30

17 3 Identificação da Segunda Etapa do Estágio: Área de Estágio: Biotecnologia da Reprodução Animal, Clínica e Cirurgia de Grandes Animais, Anestesia, Laboratório Clínico. Local: Região de Avaré- SP, incluindo, Arandu, Águas de Santa Barbara, Holambra II, Paranapanema, Ribeirão Bonito, dentre outras. Orientador Acadêmico: Fernanda Saules Ignácio Supervisor de Estágio: Paulo Roberto Novaes Ramires Período: 01 de setembro a 30 de novembro de 2015 Plano de Atividades (ETAPA 2): - Palpação transretal e ultrassonografia bovina/equina, âmbito reprodutivo no acompanhamento do ciclo, dinâmica folicular, edemaciação uterina, retorno ao cio, diagnóstico gestacional após inovulação de embriões, ou após inseminação/monta natural. -Transferência de embrião e inovulação em receptoras sincronizadas - Coleta de sêmen de garanhões conforme solicitação, avaliação seminal, quanto a vigor, motilidade, e quantidade em partes por milhão, divisão de doses conforme a utilização a fresco/ congelado, despacho ao destino. - Realização de exames necessários ao transporte de animais (Anemia Infecciosa, Mormo) - Exames de tuberculose e brucelose -Cirurgias a campo -Odontologia equina - Seleção e compra de receptoras com destino a transferência de embriões.

18 4 TABELA 2 - DESCRIÇÃO DE DO ESTÁGIO CURRICULAR ATIVIDADES REALIZADAS NA SEGUNDA ETAPA DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO PALPAÇÃO TRANSRETAL E ULTRASSONOGRAFIA EM DIAS ALTERNADOS DE ÉGUAS DOADORAS PALPAÇÃO TRANSRETAL E ULTRASSONOGRAFIA EM DIAS ALTERNADOS DE ÉGUAS RECEPTORAS INDUTORES DA OVULAÇÃO (GnRH e hcg) COLETA DE SÊMEN DE GARANHÕES (DIAS ALTERNADOS CONFORME SOLICITAÇÃO) CONGELAMENTO DE SÊMEN EQUINO INSEMINAÇÃO DE ÉGUAS DOADORAS COM SÊMEN A FRESCO INSEMINAÇÃO DE ÉGUAS DOADORAS COM SÊMEN CONGELADO LAVAGEM UTERINA PARA OBTENÇÃO DE EMBRIÕES INOVULAÇÃO DE EMBIÕES EM ÉGUAS RECEPTORAS SINCRONIZADAS CONFIRMAÇÃO DE PRENHES PÓS INOVULAÇÃO CONFIRMAÇÃO DE PRENHES COM 60 DIAS FERRAGEAMENTO CORRETIVO EM EQUINOS FETOTOMIA EM ÉGUA CASTRAÇÃO EQUINA CÓLICA EQUINA ODONTOLOGIA EQUINA SUTURAS DEVIDO A TRAUMAS (EQUINO) EUTANASIA (EQUINO) ANDROLÓGICO EM TOUROS PARA VENDA EM LEILÃO PALPAÇÃO E ULTRASSONOGRAFIA EM VACAS PARA CONFIRMAÇÃO DE PRENHES VULVOPLASTIA BOVINA EXAME DE TUBERCULOSE E BRUCELOSE ANEMIA INFECCIOSA E MORMO TOTAL DE ANIMAIS

19 5 IMAGEM 1- Éguas receptoras para transferência de embrião FONTE: arquivo pessoal IMAGEM 2- Palpação transretal em égua doadora Fonte: arquivo pessoal IMAGEM 3 - Embriões em placa de petri Fonte: arquivo pessoal

20 6 IMAGEM 4 - Coleta de sêmen Fonte: arquivo pessoal IMAGEM 5 - Avaliação seminal Fonte: arquivo pessoal IMAGEM 6 - Odontologia equina Fonte: arquivo pessoal

21 7 Considerações Finais sobre o estágio: O período determinado ao estágio foi satisfatório para a aprendizagem em um setor mais especifico, de interesse, aperfeiçoando metodologias vistas durante a graduação, não bem compreendidas ou ditas como vagas, agregando ao teórico vivencias práticas no setor biotecnológico reprodutivo no geral e maioria dos equinos.

22 8 PARTE II 2. INTRODUÇÃO Clones são definidos como indivíduos compostos pelas mesmas características genéticas, assim, clones são formados naturalmente nas diversas formas de reprodução assexuada, como as realizadas por bactérias ou protozoários. Nas espécies de reprodução sexuada, a bipartição espontânea de embriões durante as fases iniciais do desenvolvimento formam gêmeos univitelinos, ou seja, clones. O interesse científico na manutenção de material genético e formação de clones em laboratório aumentou com o desenvolvimento das biotecnologias e, no ano de 1989, o primeiro clone por transferência de blastômeros embrionários para oócitos enucleados foi realizado no Canadá (WILLADSEN, 1989). Deste momento em diante, inúmeros indivíduos de várias espécies foram clonados, sendo o primeiro clone de um animal adulto por transferência nuclear (TN) relatada em 1997 com o nascimento da ovelha Dolly, da raça Finn Dorset (WILMUT et al., 1997). No Brasil, a clonagem de animais de diferentes espécies foi realizada tanto com fins de pesquisa (NEVES et. al., 2010) como comerciais (Touro Bandido). Mais recentemente, o nascimento em 2012 do primeiro cavalo clonado no Brasil pela técnica de transferência nuclear (TN) de um animal falecido há 15 anos (NASCIMENTO, 2012) fez com que o interesse comercial pela técnica, assim como a discussão sobre sua real importância, aumentasse nos últimos anos. O presente trabalho tem como objetivo revisar as técnicas e levantar discussões importantes sobre a clonagem na espécie equina. 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1 História da Clonagem Em 1903, o botânico Herbert John Webber criou o termo clone durante uma pesquisa de plantas no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, e definiu como uma população de moléculas, células ou organismos originados de uma única célula, sendo igual à célula original e entre elas. A palavra clone se deriva etimologicamente do grego Klon, que significa broto, exemplificando o que ocorre naturalmente nos vegetais, plantas, árvores, leveduras e fungos, esponjas, alguns

23 9 protozoários, e nas bactérias. A palavra designa a origem de indivíduos que por reprodução assexuada dão origem a outros com o mesmo patrimônio genético da célula doadora, gerando indivíduos geneticamente idênticos (ZATZ, 2004). Existem duas técnicas de clonagem, a bipartição e a transferência nuclear (TN). Durante a divisão embrionária em um processo natural ou laboratorial, a bipartição gera seres idênticos entre eles, porém totalmente diferentes dos já existentes. Por meio da divisão de células embrionárias nos estágios iniciais de multiplicação são formados os gêmeos univitelinos em um número limitado em dois ou pouco mais. Já a transferência nuclear (TN) é uma técnica laboratorial que consiste na utilização de material genético do animal de interesse retirado de uma célula doadora e transferido para um oócito não fertilizado e sem núcleo, gerando um embrião contendo uma cópia idêntica do material genético nuclear do animal doador (WOLF e GABALDI, 2002). A geração biotecnológica da clonagem alavancou as pesquisas e elucidação da técnica, buscando conhecimento sobre os processos biológicos e moleculares, a especulação sobre o processo de recapitulação celular, falhas e dificuldades, e desta forma, os clones mamíferos contam ainda com tentativas e porcentagem baixa comparada a taxa in vitro, por exemplo (ANTES, 2014). O histórico de aplicação da clonagem na espécie equina vem se limitando por um motivo em evidência, a escassez de relatos na literatura sobre a aplicação de técnicas de reprodução assistidas associadas e a técnica em si, seja pelo interesse ainda gradual na espécie, custo, aplicabilidade, instalações, complexidade, resultados e valor agregado aos animais de interesse (LAGUTINA et al. 2005). E apenas 7 anos após o nascimento do primeiro mamífero clonado é que no ano de 2002 a clonagem passou a ser reportada na espécie equina (WOODS et al., 2003; GALLI et al., 2003). Na Universidade de Idaho, nos Estados Unidos, registrou-se o primeiro relato de sucesso na clonagem em equídeos, no mês de maio do ano de Neste trabalho foram utilizadas células fetais de mula como doadoras de núcleo e mais de 300 ovócitos foram reconstituídos e geraram 3 clones (WOODS, 2003). O primeiro ao nascer foi chamado de Idaho Gem, com significado de a jóia de Idaho, sendo o primeiro clone equídeo de animal estéril. O burro ou a mula são originados do cruzamento de uma égua com jumento e, por ser gerado a partir do cruzamento de

24 10 espécies diferentes, caracterizam-se por serem híbridos e estéreis. O clone foi feito a partir do irmão de um burro considerado campeão de corridas, denominado Taz. Foram utilizados fibroblastos coletados de um feto de 45 dias, preferiram células jovens para a técnica ao invés de um animal adulto como doador de células (CONNOR, 2003). Ainda em 2003, após algumas semanas, foi anunciado na Itália pela equipe do Dr. Cesare Galli o nascimento de uma potra chamada Prometea da raça Haflinger e que foi o primeiro registro de equino clonado na história. O trabalho contou com a utilização de células de biópsia de pele de uma égua e os oócitos a partir de abatedouros maturados in vitro. Foram cultivados 328 embriões dos quais 14 evoluíram até a fase de blastocisto e 2 deles transferidos para o útero da própria égua progenitora das células doadoras de núcleo. Por meio de ultrassonografia transretal e após 21 dias de gestação foi realizado diagnóstico de gestação e o nascimento ocorreu após 336 dias de gestação, dando origem a um animal saudável, pesando 36kg, assim se confirmou que não há influencia materna na gestação, considerando o reconhecimento imunológico fetal pela mãe, onde o aborto ia ser resultado do reconhecimento inadequado de antígenos fetais (WOODS et al., 2003). Prometea já tem descendentes, em 2008 o potro Pégaso nasceu em Carmona, na Itália (LANG, 2015). Foi anunciado por pesquisadores franceses e italianos da parceria das empresas Cryozootech da França e LTR-CIZ da Itália, o nascimento de um cavalo árabe, denominado Pieraz-Cryozootech-Stallion, o primeiro clone de um animal campeão mundial em provas de resistência, geneticamente idêntico a Pieraz. O clone nasceu em 25 de fevereiro de 2005 pesando 42 Kg e foi criado com o intuito de permitir a produção de potros filhos de um animal com material genético idêntico ao de um animal campeão e que foi castrado (BBCBRASIL, 2005). Já em 2005, ainda na Itália, ocorreu o nascimento de outros dois potros clones, um deles veio a óbito 48 horas após o nascimento em decorrência a um processo séptico, contudo, o outro potro apresentou-se dentro dos parâmetros normais de vitalidade. No laboratório da Universidade do Texas, a partir de 11 embriões transferidos, 2 clones viáveis foram gerados. No ano posterior, 9 clones nasceram no mesmo laboratório sendo 7 viáveis (HINRICHS, 2006). No dia 10 de setembro de 2012, nasce no Brasil o primeiro clone equino, da raça Mangalarga, animal consagrado como campeão mundial na produção de filhos,

25 11 sendo registrados na Associação Brasileira dos Criadores de Cavalo Mangalarga, inscrito no livro Guinness Book O livro dos recordes, foi avaliado em 1 milhão de dólares, e o material genético de Turbante JO foi armazenado pelo período de 15 anos, visto que faleceu aos 26 anos, e renasceu aos 43 anos. O clone foi realizado pela empresa In Vitro Brasil na cidade de Mogi Mirim (NASCIMENTO, 2012). A neta de Turbante JO, denominada Cascata JO, também veio a ser clonada e nasceu nas exatas 10 horas posteriores a seu avô, em setembro de A doadora de núcleo, Cascata JO, também considerada uma lenda da raça mangalarga, morreu há três anos com 16 anos de idade no ano de 2009 e agora está na mesma geração que Turbante (OLIVEIRA e PIVATO, 2013). 3.2 Técnicas de clonagem A clonagem pode ser realizada por duas técnicas distintas, inicialmente pela bipartição de embriões e posteriormente a técnica de transferência nuclear (TN) foi desenvolvida Bipartição de Embriões Sendo postulada a mais de 50 anos (NICHOLAS; HALL, 1942), iniciando em meados as décadas de 80 com fins comerciais (OZIL et al., 1982). O pesquisador Stenn Willadsen, que trabalhou na Unidade de Reprodução Animal do Instituto de Pesquisa Agrícola em Cambridge, na Inglaterra, desenvolveu em ovinos experimentos de desagregação de embriões e posteriormente desenvolveu outras técnicas a partir dos resultados (WILLADSEN, 1981). Os primeiros trabalhos utilizando a bipartição de embriões em equinos para a produção de gêmeos monozigóticos foram feitos em 1989, por McKINNON et al. e SKIDMORE et al.. Atualmente a bipartição está praticamente abandonada, porém, se associa a outras técnicas. Conhecimentos novos sobre a embriologia equina, a definição precisa do momento da ovulação, equipamentos e meios de cultivo voltam a promover a utilização da bipartição na espécie equina. A bipartição se associa a técnicas de congelação e sexagem embrionária, estruturar bancos de hemi-

26 12 embriões congelados e sexados. A geração de animais monozigóticos são amplamente utilizados nos experimentos associados a resposta imune, genoma funcional, nutrição, farmacologia e ambiência (SILVEIRA et al., 2005). A geração de animais monozigóticos é amplamente utilizada nos experimentos que estudam a resposta imune, genoma funcional, nutrição, farmacologia e ambiência. Diferentes protocolos tem sido utilizados para a bipartição embrionária em bovinos, equinos, ovinos, caprinos e demais espécies (FERNANDES; OBA, 2006). A natural ocorrência de gêmeos monozigóticos e dizigóticos em éguas são impedidas pela inabilidade de manter a gestação, e durante a segunda metade da gestação há morte de um feto e se inicia um processo de aborto (FERNANDES; OBA, 2006). Na bipartição de embriões ou divisão nuclear cirúrgica, um micromanipulador é utilizado para dividir mecanicamente um embrião em partes iguais quando este se encontra nos estágios iniciais de divisão. Neste processo um número restrito de indivíduos são gerados (2-4), os quais são idênticos genomicamente e totalmente diferentes de qualquer outro animal já existente (LIMA, 2010). Nos equinos, a bipartição, vem como auxílio ao aumento da taxa de prenhez por coleta, considerando a limitação do número de embriões e também a não definição de protocolos eficientes de superovulação para a espécie (BENTO; SILVA; ALVIM, 2005). A técnica compreende na seleção morfológica de embriões, fixação e sob microscópio a bipartição utilizando micromanipuladores. Preferencialmente a bipartição deve ser realizada em partes iguais, gerando dois embriões que vão ser imediatamente transferidos a receptoras ou vão para o cultivo in vitro por determinadas horas antes da transferência. A técnica conta com a disponibilidade de condições laboratoriais (HOBI, 2003). Quando se busca uma ampla homogeneidade de características vistas como desejáveis em uma população, a técnica se mostra de baixa eficiência. Poucos notam o custo-benefício da técnica, mesmo sabendo que os embriões bipartidos necessitam de apenas 25% da massa total do embrião para se manter (CARNEIRO, 2012). Neto (2007) notou que na técnica, como não há reprogramação do núcleo de embriões ou desagregação de blastômeros, os embriões continuam a se

27 13 desenvolver com um menor número total de células no estágio nuclear do embrião original, podendo haver comprometimento da viabilidade dos embriões. A restrição da técnica se baseia no tempo e habilidade profissional dedicados ao processo da divisão embrionária o que pode alterar significativamente a taxa de prenhez quando comparados embriões bipartidos a embriões inteiros e frescos, 40% e 60%, respectivamente. Devido ao interesse comercial, não é recomendada a bipartição sem antes determinar o sexo do clone na transferência de embriões, o que reduz ainda mais as taxas de prenhez, uma vez que há aumento na perda de blastômeros quando o embrião é sexado e dividido (RUBIN et al., 2009) Transferência nuclear (TN) Considerada uma poderosa ferramenta biotecnológica, a transferência nuclear (TN) e o seu desenvolvimento, permitiu a produção ilimitada de animais geneticamente idênticos (ANTES, 2014). Para a produção de um indivíduo que possui o mesmo material genético de outro já existente, conta-se com a união de qualquer célula somática com um oócito enucleado e não fecundado, capaz de formar um zigoto por eletrofusão (processo semelhante à fertilização), dispensando a utilização de gametas e células reprodutivas (RISPOLI, 2014). Cada etapa influência diretamente no resultado final do processo (PEREIRA, 2009). A motivação da técnica objetivou testar a hipótese de que todas células do organismo contém a mesma quantidade de informação genética (MOURA, 2007). O potencial consiste na técnica de transferência nuclear (TN) apresentar duas propriedades importantes: produzir animais a partir de uma única célula e promover a reversão global dos mecanismos epigenéticos (LI, et al. 2003). Os primeiros trabalhos em mamíferos iniciaram no ano de 1981, em camundongos, onde foram utilizadas células de embriões como doadoras de núcleo dando origem a três animais, através dos pesquisadores Illmensee e Hoppe (ILLMENSEE; HOPPE, 1981). Só em 1986 que o pesquisador Dinamarquês, teve sucesso em mamíferos domésticos considerados de importância comercial, e contou com o nascimento de 3 cordeiros a partir de núcleos de embriões na fase de 8 a 16

28 14 células, e ovócitos de ovelhas maturados in vivo, outros pesquisadores através da técnica de Willadsen constataram o nascimento de clones bovinos, suínos e leporinos (WILLADSEN, 1986). Já em 1997, com o anuncio do nascimento da ovelha Dolly com o nome em homenagem a uma cantora country norte-americana, Dolly Parton, seu criador Ian Wilmut disse que é difícil imaginar glândulas mamárias tão impressionantes como as de Parton, e a idéia da nomeação surgiu daí, por utilizar células de glândula mamária para a criação da ovelha. Então, a partir de células diferenciadas adultas da glândula mamária de um animal de 6 anos de idade, foi provado que o processo de diferenciação não é um processo irreversível e abriu portas para a clonagem de outras espécies (WILMUT, 1997). Dolly adquiriu uma doença pulmonar grave, e foi sacrificada, no dia 14 de fevereiro de 2003, anunciado pelo Instituto Rosolin, na Escócia, e antes apresentou artrite, caracterizando o envelhecimento precoce de suas células, aferindo problemas e gerando debates sobre a clonagem. Bonnie, uma fêmea, nasceu em 1998, e foi gerada por Dolly, e em 1999 mais três produtos nasceram (FILHO, 2003). A partir daí o êxito da clonagem foi considerado em bovinos, equinos, muares, ovinos, caprinos, coelhos, camundongos, felinos, dentre outras, e onde até o ano de 2011 houve sucesso em 16 espécies (TRECENTI; ZAPPA, 2013). A transferência nuclear (TN) se provou viável nos equinos apesar ainda dos seus baixos índices de eficácia (menores que 1%) no nascimento de um potro vivo à partir dos embriões reconstituídos (HINRICHS, 2005) e a geração de um clone conta com a capacidade desprogramadora do citoplasma receptor que altera por completo as células adultas e faz a reprogramação a um estado diferenciado capaz de gerar todos os tecidos de um novo ser, sustentando a vida embrionária e fetal, desta forma, quanto menos diferenciadas forem as células, maior a capacidade de desprogramação (SILVA, 2013). A conservação do genoma na diferenciação celular é baseada em princípios de equivalência nuclear, e também da plasticidade celular, permitindo o estágio celular indiferenciado com a reprogramação (SARAIVA, 2010). Contamos com diversos tipos de células doadoras de núcleo e estas provém de embriões, fetos, neonatos, animais jovens e também animais que já vieram a óbito, assim, as células selecionadas devem ter a capacidade intrínseca de serem reprogramadas (fase de pluripotência) pelo citoplasto facilmente, aumentando a eficiência da clonagem (GUIMARÃES, 2012). Os ovócitos em estágio de metáfase II

29 15 da meiose são os mais apropriados a garantir clones viáveis quando utilizados como receptor (SILVA, 2013). Na espécie equina, considerando características clínicas, a taxa de perda embrionária de gestações clones é de 89%, sendo precoces, nos primeiros 80 dias de gestação, atribuída a erros de reprogramação entre a célula receptora e a célula doadora, também observado nas demais espécies, com taxas de perdas menores, comparado à espécie equina (VANDERWALL, 2004). Mesmo com toda a precaução do médico veterinário ao conceber uma gestação de animais clones as gestações não têm sido levadas a termo, e as perdas vêm ocorrendo desde embrionárias, fetais e até mesmo pós-natais. Anomalias como disfunções respiratórias, defeitos cardíacos e circulatórios, deficiências imunológicas, congestão e fibrose hepática, problemas renais, ascite, problemas articulares, disfunções sistêmicas, e demais outros como o excesso de peso ao nascer, são associados com os problemas perinatais de animais clones (BARBOSA, 2014). Na espécie equina potros nascidos não requerem assistência obstétrica, devido a não apresentarem os problemas relatados nas demais espécies (CARNEIRO, 2012). Indivíduos clones são cópias genéticas nucleares, não tem garantia perante o mesmo fenótipo, comportamento e desempenho de sua cópia, visto que diversos fatores como ambiente, manejo, nutrição e treinamento são capazes de influenciar na formação dessas características. O registro de animais clones não é permitido a algumas associações de raças, inerente ao DNA mitocondrial heterogêneo, sendo contornado quando a doadora de ovócito se encontra na mesma linhagem da mãe do animal a ser clonado (CHOI et. al., 2002). A técnica segue algumas etapas, envolvendo a célula doadora de núcleo e o oócito receptor (citoplasto), há a escolha do animal de interesse, a obtenção e seleção da célula doadora, que passa pelo processo de cultura celular, para obter uma linhagem de células e posterior remoção do núcleo, simultaneamente requer a doadora de oócitos, obtenção e maturação do oócito in vivo ou in vitro, selecionados quanto a extrusão do 1º corpúsculo polar (indicando a maturação metáfase II) e então a enucleação, através de micropipetas por aspiração, que consiste na remoção de todo genoma ali presente (remoção da cromatina), e a junção ocorre através da implantação nuclear também por micromanipulação seguida de fusão de membranas celulares após pulsos elétricos, por fim ativação química dos conjuntos,

30 16 seguida da cultura embrionária por 6-7 dias, até chegarem ao estágio de inovulação a uma barriga de aluguel, apta a conceber e gestar o novo ser ate o seu nascimento ou armazenamento em nitrogênio líquido, para posterior uso (SANTOS, 2008). Depois de sequenciadas publicações inerentes ao sucesso da técnica, foi observado a diferença no percentual entre os sexos, masculino e feminino, na mortalidade neonatal, onde temos 12% nos machos, e 7% para as fêmeas (VIEIRA, 2012). Existem diversas aplicabilidades para a clonagem equina nos ramos de produção animal, na preservação de animais considerados superiores dentro de um determinado rebanho ou população, apreciando o melhoramento genético, ainda mais quando esses animais por algum motivo perderam a fertilidade, foram castrados, possuem idade avançada, animais que se tem a intenção de manter por mais tempo na reprodução ou ate já morreram. Visto que em animais mortos de interesse, que possuem como únicas células viáveis o sêmen congelado, foi verificado a obtenção de estruturas clivadas a partir de células isoladas, abrindo portas e a possibilidade de recriar esses animais (SILVA, 2013) Qualidade dos oócitos não fecundados e enucleados Contempla um fator importante para garantir o sucesso da técnica, dependendo da qualidade e a fonte dos citoplastos, ou seja, os oócitos enucelados, vários estudos foram desenvolvidos para avaliar o melhor estágio nuclear da célula receptora, e o estágio de metáfase II apresentam melhores resultados na produção de embriões clonados viáveis (PEREIRA, 2009). Avaliada a qualidade morfológica, os ovócitos devem apresentar o primeiro corpúsculo polar, indicando o estágio de metáfase II, e serve de referência para a remoção da cromatina indicando sua localização (LAGUTINA et al. 2005). O oócito enucleado possui a capacidade de alterar a programação de células adultas, com o objetivo de se tornarem capazes de originar todos tecidos de um novo ser, e sustentar a vida embrionária e fetal ao atingir um estado indiferenciado (SILVA, 2013). A maturação até o estágio de metáfase II pode ser alcançada in vivo, ou in vitro, utilizando células maturadas in vitro a rapidez aumenta e diminui o custo,

31 17 quando utilizados um elevado número de ovócitos colhidos de ovários de animais destinados ao abate, ou colhidos in vivo por meio de aspiração folicular. A maturação in vivo conta com fatores negativos como a idade da doadora, e o protocolo de superestimulação ovariana influenciando na qualidade dos ovócitos (ANTES, 2014). Diversos estudos acompanhados do avanço de biotecnologias, apontam pesquisas com intuito de progênies de éguas selecionadas, considerando a superovulação ainda não estabilizado para a espécie, as alternativas vem na exploração de técnicas de in vitro na produção de embriões, e já se conta com potros nascidos através da técnica de fertilização in vitro com maturação in vivo, sendo a maturação um ponto a se considerar nos equinos (FERNANDES, 2004). Sendo uma limitação na espécie equina, pois os oócitos quando coletados in vivo, é dispendioso e apresentam resultados insatisfatórios, através da aspiração ecoguiada de ovócito (OPU) o número é baixo, e temos oócitos oriundos de folículos imaturos, e apenas um folículo maduro pode ser coletado por vez, e os protocolos de maturação in vitro ainda não são totalmente padronizados para a espécie. Quando os oócitos provem de ovários de animais de abatedouros utiliza-se a curetagem de parede folicular, ou fatiamento do ovário, e intensas lavagens com o propósito de remoção do complexo cumulus ovócito (CCO), característico da espécie equina, a íntima relação das células CCO com as da teca folicular (FERNANDES, 2008). A maturação in vitro na espécie equina esta sendo estabelecida por autores como Hinrichs (2005), Choi (2003), e está sendo avaliado sobre a técnica o tempo de cultura, fatores sobre a incubação, como tempo e temperatura, o nível presente de hormônios, e ainda contam com número baixo de ovócitos que atingem a fase de metáfase II ( DELL AQUILA et al., 1997). Na atualidade ovócitos equinos, numa condição que realmente induza sua maturação nuclear e citoplasmática sendo incubados em meio de TCM 199, com combinação de soros, hormônios, macromoléculas e células somáticas, atingindo taxas entre 30 a 75%, consideradas sub-ótimas comparado as demais espécies animais através dessa técnica (FERNANDES, 2004). A maturação in vivo nos equinos depende da dose de LH em um aumento progressivo, e a concentração máxima se dá um dia após a ovulação, diferente de outras espécies. A maturação in vitro é de 60% em ovócitos que chegam à metáfase II, sendo consideradas baixas, quando comparadas aos bovinos que atinge ate 97%,

32 18 mas quando utilizados meios de cultivo alternativos e fatores de crescimento esse resultado se eleva (DELL AQUILA et al., 1997). A partir do que se sabe, os ovócitos equinos tem a capacidade de maturação nuclear espontânea ao serem retirados do folículo, assim, se busca um meio de cutivo capaz de suportar essa maturação, que é alcançada, porém não tem a capacidade de promover a maturação citoplasmática (FERNANDES, 2004). Os ovócitos equinos apresentam uma taxa elevada de degeneração após a maturação in vitro, reduzindo o número de viáveis, e é percebido após a remoção as células do cumulus para o uso na clonagem e também na injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI), ressalta maiores taxas de degeneração em oócitos de abatedouros por alterações post-mortem, comparados aos de aspiração folicular transvaginal, corrigindo esse problema com a adição de inibidores meióticos, como o roscovitine, que inibe a quebra da vesícula germinativa por 32 horas, sem comprometimento para o uso (GALLI, et al. 2007) Enucleação oócitaria Consiste na enucleação através da remoção da cromatina presente no interior de oócitos em metáfase II, e mantém a ploidia correta para a transferência nuclear (TN)(MELLO, 2003). É considerada a etapa mais agressiva e invasiva sofrida pelos citoplastos, onde danos são causados, tem seu volume diminuído e é alterada a qualidade dos embriões (MOURA, 2007). Pode ser feita por dois métodos, químico, ou fisicamente, na segunda a placa metafásica juntamente com o corpúsculo polar são descartados, utilizando micromanipuladores e micropipetas, ou através da bissecção de ovócitos. No primeiro método a perda citoplasmática varia de 5 a 50%, e no segundo de 50%. Estando relacionado com a queda na taxa de blastocistos clonados quando atinge um grande volume intracitoplasmático perdido na enucleação. Através da bissecção de ovócitos, chamada de enucleação manual, a vantagem vista é a redução de custos e simplificação do protocolo, sem a necessidade de uso de micromanipuladores. Consiste na digestão da zona pelúcida dos ovócitos maturados e enucleação manual com microlâminas (MELLO, 2003).

33 19 É necessário o uso de um corante de DNA para a confirmação da enucleação, o mais utilizado é o hoechst 33342, devido a alta quantificação de lipídios intracelulares especialmente na espécie equina, a microscopia é dificultada, assim na luz ultravioleta remete a visualização da cromatina, porém compromete o desenvolvimento embrionário (DINNYÉS, et al, 2002). O processo de enucleação em si pode promover a remoção de proteínas, precursores moleculares essenciais ao desenvolvimento inicial do embrião e RNAm, causando injúrias ao citoplasto. Na espécie equina, o primeiro corpúsculo polar está deslocado adjacente a posição esperada, relacionado a metáfase, não sendo seguro a remoção da cromatina sem o uso da coloração (VAJTA, et al. 2005). Como alternativa de enucleação, com redução mínima do volume citoplasmático, conteúdo proteico e molecular do oócito, temos a enucleação química, sendo mais eficiente e menos invasiva, e dentre as substancias químicas utilizadas temos o etoposídeo, a colchicina e a demecolcina (HINRICHS, et al. 2006). Citoplastos preparados de forma química apresentam um mal desenvolvimento embrionário e baixas taxas de clivagem comparados a métodos de enucleação física (CAMPBELL et al.,2005) Células doadoras de núcleos Grande parte da biotecnologia da clonagem através da transferência nuclear (TN) se deve a seleção e cultivo da célula doadora de núcleo. Contamos com diferentes tipos celulares em diferentes níveis de diferenciação para a clonagem como doadoras de núcleo. Servem de exemplo algumas células como, blastômeros, embrionárias, fetais, somáticas de animais adultos como, da glândula mamaria, de oviduto, do cumulus, musculares, uterinas e os fibroblastos (ZHOU, 2007). Logo após a coleta de células doadoras de núcleo do animal doador elas podem ser utilizadas, ou após um período de cultivo, antes ou depois de criopreservação, levando em conta as alterações que reduzem a eficiência da técnica, como o cultivo prolongado (GAMBINI et al. 2012). Diferenças significativas na capacidade das diferentes linhagens celulares refletem na produção do desenvolvimento embrionário, onde núcleos de células menos diferenciadas são capazes de suportar melhor o completo desenvolvimento,

34 20 em vista de células totalmente diferenciadas. Utilizando células tronco embrionárias na clonagem a eficiência é maior, comparado a células adultas, pela ideia de que há menor quantidade de mutações e habilidade proliferativa nas células fetais do que nas somáticas adultas. Encontrada a facilidade de obtenção de fibroblastos de pele para cultivo celular primário, considerando a alta capacidade mitótica, resistência a criopreservação, a rotina de utilização desse tecido é grande, porém prejudica a reprogramação realizada pelo ovócito, pelo seu avançado grau de diferenciação (SMITH; MURPHY, 2004). Determinada a célula doadora, ocorre o cultivo em um meio contendo uma concentração reduzida de soro (Serum Starvation Culture) ou em uma cultura com intuito de diminuir a mitose por contato, sincronizando o ciclo celular (CAMPBELL et al., 2005). A divisão celular de cada célula de um organismo sofre um ciclo, composto por quatro fases: G1 durante o crescimento devido a sínteses proteicas, S quando duplica seu DNA, G2 outra fase de crescimento, M representando a divisão celular. A letra G de gap, com significado de intervalo, S de síntese, M de mitose (BRESSAN, 2008). As exceções são vistas nas células embrionárias, com ausência da fase G1, assim cada fase M segue a fase S, e termos como interfase e mitose caracterizam o ciclo celular embrionário. E existem células G0, com uma distribuição de microorganelas funcional para a reprogramação após a transferência nuclear (TN). A célula G0 é propícia por ser diploide, e pela estrutura da cromatina (WILMUT, et al, 1997). O princípio da transferência nuclear (TN) requer a coordenação de ciclo celular do citoplasto receptor em conjunto com a célula doadora de núcleo, com a mantença normal perante a ocorrência da reconstituição embrionária. As fases G0 e G1 são as mais compatíveis com a ploidia da divisão celular da célula doadora de núcleo (LI et al., 2003).

35 Reconstituição Após a remoção do núcleo do oócito receptor deve ser feita a introdução da célula doadora de núcleo no seu interior, uma célula única, pelo mesmo orifício da enucleação, no espaço perivitelino, abaixo da zona pelúcida do ovócito, seguida de fusão de ambos (ANTES, 2014). Pode ser feita quer pelo método de fusão elétrica das células inseridas sob a zona pelúcida, por injeção de núcleos diretamente para o citoplasma de oócitos, ou pela injeção assistida de Piezo (TROUNSON, 2001). Ocorre uma microcirurgia e fusão celular, atualmente utilizada pelos laboratórios, e inclui desvantagens conhecidas, como a baixa eficiência, equipamento de alto custo, qualificação e habilidade de pessoas e trabalho dispensioso envolvido (YAMAZAKI, 2005). Escassa é a disponibilidade de material sobre a transferência nuclear (TN) em equinos, e há uma variação na taxa de eletrofusão, 20 e 67% entre ovócitos e células doadoras de núcleo, podendo ser aumentada quando combinada a eletrofusão com vírus Sendai. A injeção direta da célula doadora no interior do citoplasma receptor apresentou de 13% a 30% após ativação de reprogramação. A utilização de Piezo drill aumentou as taxas de reconstituição comparado a eletrofusão 82% versus 20 a 48%(FERNANDES, 2008) Ativação A ativação inicia-se com a remodelagem dos núcleos transferidos aos ovócitos enucleados, assim, o desenvolvimento dos embriões reconstituídos, etapa crucial para garantir o sucesso da transferência nuclear (TN). Na reprodução sexuada no momento da fecundação, a ativação é feita pelo espermatozoide, retomando a meiose e desenvolvimento embrionário através de íons de cálcio intracelulares (NIEMANN, 2008). O intuito da eletrofusão, que é a técnica mais empregada nas diferentes espécies para a fusão, consiste em um pulso de corrente alternada que alinha ambas as membranas a serem fundidas, célula doadora de núcleo com célula receptora, paralelamente aos eletrodos e seguida de um pulso de corrente direta que vai induzir a abertura temporária de poros na membrana plasmática do oócito,

36 22 permitindo a troca de íons e macromoléculas e ainda promove a liberação de cálcio intracelular dando inicio ao processo de ativação (ANTES, 2014). Os meios mais utilizados incluem a solução de manitol (0,3 M de manitol e 0,1 Mm de MgSO4 e 0,05 Mm de Cacl2), ou Zimmerman, os quais possuem baixa condutividade requerida para o processo, evitando a produção e dispersão do calor. A partir do equipamento utilizado, a tipagem celular, e a espécie animal, se determina sobre a eletrofusão o tempo requerido, quantidade de pulsos elétricos aplicados, e a intensidade (CHOI, et al., 2003). Em equinos para a ativação já se utilizou um combinação de ionóforo de cálcio e inibidores da síntese protéica, ou no caso da utilização de ionomicina ativando o cálcio intracitoplasmático 40 segundos após o inicio do tratamento (WOODS, et al. 2003). A ativação pode ser feita a partir da exposição rápida a substâncias químicas, como ionomicina, que aumenta o influxo de cálcio do meio extracelular e mobiliza cálcio intracelular dos estoques, o 6-Deimethylamino-purine (DMAP), um inibidor de fosforilação de proteínas, o etanol que potencializa a liberação de cálcio, o cálcio ionóforo, estrôncio, produz repetitivos aumentos da concentração de cálcio livre intracelular e cicloheximide, componentes capazes de regular o influxo de cálcio, sozinhos ou em conjunto (YAMAZAKI, 2005). Houve a comparação de três protocolos de ativação em ovócitos equinos por Carneiro et al. (2012), onde no primeiro grupo utilizou ionóforo de cálcio combinado com 6 DMAP (6- Deimethylamino-purine), no segundo grupo o thimerosal com dithiothreitol (DTT) e no ultimo estrôncio com DTT. As taxas de clivagem dos três não obtiveram diferenças significativas (38, 33 e 20%, respectivamente), porém considerando a progressão ao estagio de mórula o primeiro grupo se destacou, o segundo grupo indicou alta taxa de fragmentação, e o terceiro grupo não progrediu além de quatro células. O entendimento sobre mecanismos de ativação é um componente essencial nos protocolos de transferência nuclear (TN) (TN), mas em equinos a ativação em ovócitos atingiu 29% de ativação e 9% de clivagem. As taxas de ativação e clivagem nos ovócitos enucleados equinos são inferiores comparadas aos ovócitos bovinos, após a fusão. Através de uma analogia com ICSI, técnica parecida com a injeção intracitoplasmática de gametas, sendo outra técnica para a reconstituição embrionária, mostrou-se competente na ativação de ovócitos reconstituídos equinos, com taxas maiores que 70% que os ativados de

37 23 outra maneira, sendo explicado por um fator espermático presente no espermatozoide, quando a ativação é feita pela injeção diretamente no citoplasma, sem interação com proteínas G e tirosina quinases (CHOI, 2002). HINRICHS et al. (2006) propôs a metodologia comparando a utilização de extrato de espermatozoide, ionomicina, uma combinação de ionomicina com 6 DMAP e uma combinação de extrato de espermatozoide com ionomicina, todos seguidos de cultivo com 6 DMAP por 4 horas, resultando em produção de blastocisto na combinação de extrato de espermatozoide com ionomicina (12,5%). O roscovitine, um análogo purino, vem apresentando potencial na espécie equina, sendo efetivo na supressão da meiose. Dentre as etapas envolvidas no processo de transferência nuclear (TN), a ativação permanece sendo a que mais necessita de aperfeiçoamento, e reflete na pesquisa de alterações apresentadas na fecundação através da interação do espermatozoide, com intenção de serem reproduzidas em sistemas artificiais. Quando o processo de ativação ocorre por métodos não fisiológicos, leva a não ocorrência de recrutamento de RNAm, formação de pronúcleo, síntese de DNA e clivagem, caracterizando falhas mesmo após a implantação (YAMAZAKI, 2005) Reprogramação Nuclear O desenvolvimento completo de um novo ser requer a reprogramação quando uma célula diferenciada é transferida a um citoplasma de um ovócito enucleado. Essa reprogramação e seus mecanismos ainda não são totalmente conhecidos, e modificações enzimáticas de histonas centrais, como acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitilação são exemplos de modificações na estrututra da cromatina, e interagem com fatores epigenéticos e podem ter efeitos na regulação da expressão gênica (PEREIRA, 2009). As perdas durante a gestação e pós natal pode ser explicada pela reprogramação incompleta, visto que o núcleo doador deve passar por uma série de modificações complexas num curto intervalo de tempo, sendo diferentes da gametogênese de um embrião produzido in vitro (KEEFER, 2008). Resultando na repressão ou superexpressão dos genes que sofreram uma reprogramação epigenética incompleta (BRAGA; FRANCO, 2013).

38 24 Até o ano de 2012, dos 21 animais clones equinos nascidos, um potro necessitou de assistência ao nascimento, ao nascer de 10 meses, e resultou em óbito. Porém 50% dos potros nascem com problemas como contratura de tendões, aumento da espessura do cordão umbilical, síndrome do mal ajustamento neonatal e venham a necessitar de cuidados após o nascimento. Estão inclusos também os óbitos por septicemias, pneumonias, artrites sépticas, e ruptura de bexiga. Indicando a necessidade de obtenção de um maior número de clones equinos para determinar conclusões definitivas sobre a técnica (HINRICHS, 2007). 3.3 Clonagem na espécie equina: Pesquisa e Mercado O interesse em clones equinos aumenta significativamente conforme o passar dos anos e envolve pares de fatores, desde o aumento da população e difusão dos usos da espécie, ate as aplicações encontradas para essa nova biotecnologia que apresenta inúmeras vantagens, mesmo que sua eficácia ainda esteja no alvo de exploração e aperfeiçoamento o potencial abrange satisfatoriamente a abertura de campo para o desenvolvimento da técnica. Com o sucesso da clonagem em diversas categorias de mamíferos, notou-se a aplicabilidade em saúde humana, melhorias em índices produtivos e reprodutivos de rebanhos com esse propósito, também na mantença de espécies acusadas de extinção, e com finalidades de pesquisa básica (VIEIRA, 2012). Em empresas qualificadas em biotecnologias, a clonagem tomou dimensão na espécie equina no Brasil no ano de 2012, com o nascimento do animal Turbante JO, da raça mangalarga, que teve seu material genético armazenado pelo período de 15 anos antes da decisão de recriar o consagrado campeão mundial na produção de filhos da raça e idolatrado pelo seu proprietário, que alega que o animal só tinha um defeito: não ser eterno (NASCIMENTO, 2012). Assim, com a necessidade de acompanhar a evolução de biotecnologias e seus benefícios no ramo de produção animal, aumentando eficiência reprodutiva e acelerando o ganho genético dos animais de produção, os produtores buscam manter animais considerados superiores através da clonagem e prever seu bom desenvolvimento comparado a cópia original, que já possui demonstrações de bom desempenho no quesito que lhe é atribuído, em conjunto com pesquisadores que