Melhoramento de Capsicum spp. visando à resistência ao PepYMV e à manchabacteriana

Transcrição

1 Melhoramento de Capsicum spp. visando à resistência ao PepYMV e à manchabacteriana na UENF

2 Capsicum spp. Moscone et al., 2007

3 Importância Econômica: - Versatilidade: (aplicações culinárias, industriais, medicinais e ornamentais). - Produção Mundial: 28 milhões de toneladas (FAO, 2008).

4 Fatores limitantes Doenças: Bactérias Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Ralstonia solanacearum Fungos Phytophthora capsici Colletotrichum sp. Vírus PVY PepYMV

5 2n= 24 cromossomos 2n= 26 cromossomos 2n=??? C. annuum var. annuum C. campylopodium C. caballeroi C. annuum var. glabriusculum C. cornutum C. ceratocalyx C. baccatum var. baccatum C. friburgense C. coccineum C. baccatum var. pendulum C. lanceolatum C. dimorphum C. baccatum var. umbilicatum C. mirabile C. geminifolium C. cardenasii C. pereirae C. chacoense C. recurvatum C. chinense C. rhomboideum C. eximium C. schottianum C. frutescens C. villosum C. galapagoense C. buforum * C. parvifolium C. praetermissum C. pubescens C. tovarii (Pozzobon et al., 2006; Moscone et al., 2007)

6 Análise da resistência genética à mancha-bacteriana em genótipos de Capsicum annuum L. Mestrando: Roberto Alexandre Costa PGPV (2000)

7 Mancha-bacteriana do pimentão Sintomas Condições ideais UR = % T = o C Disseminação: água da chuva ou irrigação Semente

8 Resistência genética à mancha-bacteriana em pimentão Três genes de resistência: Bs1 (PI ) Capsicum annuum L. Bs2 (PI ) Capsicum chacoense L. Bs3 (PI ) Capsicum annuum L. Cultivares resistentes

9 Avaliação da Resistência à MB (Rodrigues Neto et al., 1986) ENA h 28ºC - suspensão água destilada - [10 3 ] ufc/ml - [10 5 ] ufc/ml - espectrofotômetro 600 nm 36h 28ºC

10 Inoculação (Bongiolo Neto et al., 1986)

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14 Programas de melhoramento Sistema reprodutivo Variabilidade genética Escolha do método Modelos Biométricos Parâmetros genéticos h 2 2 a 2 d Herança da resistência

15 Análise de gerações para reação à mancha-bacteriana e outros caracteres agronômicos em Capsicum annuum L. Mestrado: Elaine Manelli Riva (2002)

16 Estimativas de parâmetros genéticos: h 2 r ~ 50,77% h 2 a ~ 82,54% η = 3 (resistência à mancha-bacteriana)

17 Tese: Uso dos métodos genealógico e single seed descent (SSD) para obtenção de linhas de pimentão resistentes à mancha bacteriana (Elaine Manelli Riva)

18 Objetivos Avançar gerações e selecionar genótipos superiores de pimentão utilizando-se os métodos de melhoramento Genealógico (Pedigree) e Single Seed Descent (SSD) a partir da população segregante derivada do cruzamento entre os acessos de Capsicum annuum L. UENF 1421 e UENF 1381.

19 P 1 (Costa, 2000) P 2 x F 1 UENF 1421 UENF 1381 F 2

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21 Esquema Experimental BL I F 2:3 3 test. 14 F 2:3 3 test. BL III 10 BL II F 2:3 3 test. 14 F 2:3 3 test. BL IV 10

22 Tabela 6 Resumo da análise de variância para a característica reação à mancha bacteriana, considerando-se a geração F 2:3 de acordo com o procedimento linhas e pais intercalares. Campos dos Goytacazes, 2004 FV GL RMB (%) RMB (cm 2 ) Entre linhas ,40** 0,05** Dentro de linhas ,14 0,01 Média 9,66 0,01 ** Significativo em nível de 1% de probabilidade pelo teste F.

23 Tabela 8 Resumo da análise de variância para as características peso total de frutos 1 (g), número total de frutos 2 e peso médio de frutos 3 (g), considerando-se a geração F 2:3 de acordo com o procedimento linhas e pais intercalares. Campos dos Goytacazes, 2004 FV GL PTF 1 NTF 2 PMF 3 Entre linhas ,07** 3905,51** 253,52** Dentro linhas ,00 432,53 15,03 Médias 503,29 45,25 12,65 ** Significativo em nível de 1% de probabilidade pelo teste F.

24 Resultados Considerando-se a característica reação à mancha bacteriana, por meio da seleção entre e dentro, selecionaram-se as linhas F 2:3 105, 111, 125, 157, 226, 260, 282, 288, 313, 475 e 517, proporcionando ganhos genéticos em torno de 40,0%.

25 Single Seed Descent (SSD) UENF/PESAGRO/RIO Casa de vegetação 2 gerações/ano F 5

26 Tabela 4 Médias da característica RMB avaliada por meio da AACPD nos genitores UENF 1421 e UENF 1381, e em 79 linhas F 6 obtidas a partir deste cruzamento. Campos dos Goytacazes, 2005 Linhas Médias Linhas Médias Linhas Médias ,70 a 118 A 18,18 ab ,60 abc UENF ,00 a ,15 ab ,47 abc ,73 a ,10 ab ,32 abc ,38 a ,03 ab ,31 abc ,33 a ,92 ab ,20 abc ,10 a ,81 ab ,13 abc ,07 a ,67 abc ,13 abc ,57 a ,07 abc ,97 abc ,83 a ,94 abc ,66 abc ,38 ab ,93 abc ,65 abc ,83 ab ,92 abc ,62 abc ,47 ab ,83 abc ,60 abc 118 V 19,50 ab ,72 abc ,35 abc ,47 ab ,43 abc ,27 abc ,40 ab ,43 abc ,17 abc ,35 ab ,33 abc ,94 abc ,07 ab ,32 abc ,93 abc ,93 ab ,17 abc ,87 abc ,93 ab ,05 abc ,53 abc ,93 ab ,02 abc ,52 abc ,87 ab ,80 abc ,50 abc ,80 ab ,80 abc ,47 abc ,78 ab ,80 abc ,20 abc ,42 ab ,78 abc ,07 abc ,40 ab ,78 abc ,73 abc ,25 ab ,67 abc ,40 abc ,20 ab ,60 abc ,25 abc

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34 Genes bs5 e bs6 bs5 derivado de PI bs6 derivado de C44 (PI e PI163192)

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39 REAÇÃO À MANCHA-BACTERIANA E DESEMPENHO AGRONÔMICO DE LINHAS RECOMBINADAS DE Capsicum annuum L. Mestranda: Sarah Ola Moreira (2008)

40 REAÇÃO À MANCHA-BACTERIANA (RMB) DIC com 6 repetições UAP UENF Isolado ENA 4135 raça T1P3: [10 5 ufc/ml] Inoculação na superfície abaxial da folha Avaliação: Escala de Notas e AACPD

41 Resultados FV GL QM (AACPD) QM (NOTA) Tratamento ,9857** 10,1063** Resíduo ,4333 0,9239 Média 30,7857 3,1166 CV (%) 32, ,8417 **significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F

42 RESULTADOS NTF: 12 linhas com médias entre 64 e 101 frutos PMF: variou entre 5,09 e 82,29 g Linhas com maior NTF têm menor PMF PTF: não significativo CF: variou entre 3,32 e 11,20 cm DF: variou entre 1,39 e 6,91 cm Menor CF e DF: linha 4 CF/DF: prevaleceu o formato cônico AP e DC: grande correlação CAPS: presente em 14 linhas e segregando em 2 RMB: 5 linhas resistentes

43 CONCLUSÕES Ampla variabilidade quanto à produção e formato de fruto e de planta; 5 linhas são resistentes à mancha-bacteriana; Os parâmetros genéticos sugerem que as características estudadas foram pouco influenciadas pelo ambiente, são herdáveis e permitem a seleção;

44 Pimentas Pimenta-doce 8 1 Ornamental 13 11

45 Resumo das publicações Costa et al. (2002): Resistência genética e indicação de combinações Sudré (2003): Fontes resistência: UENF 1381, UENF 1496, UENF 1498, UENF 1558, UENF 1573, UENF 1578, UENF 1585 Riva (2002): UENF 1421 X UENF 1381 Riva et al. (2004): identificação de 3 genes recessivos Riva (2006): 18 linhas endogâmicas recombinadas resistentes Riva-Souza et al. (2007): eficiência dos métodos de seleção Moreira et al. (2008): teste de linhas recombinadas em diferentes ambientes Moreira et al. (2010): teste de linhas recombinadas

46 Identificação de fontes de resistência ao Pepper yellow mosaic virus em Capsicum spp. e resposta ecofisiológica de acessos de Capsicum chinense infectados com o vírus Mestrado: Cíntia dos Santos Bento

47 Mosaico Amarelo do Pimentão Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) Estirpe agressiva do PVY Nova espécie dentro do gênero Potyvirus (Inoue-Negata et al., 2002)

48 Transmissão e ocorrência Transmissão afídeos Ocorre - forma natural em pimentão e tomate (Inoue- Nagata et al., 2002; Cunha et al., 2002) Regiões Centro-Oeste e Sudeste Perda de 60 a 80% em Venda Nova do Imigrante (Costa et al., 2003) Amapá, Pernambuco, Bahia, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais e São Paulo (Inoue-Nagata et al., 2003; Zambolim et al., 2004).

49 Sintomatologia Sintomas mosaico severo, deformação foliar, nanismo das plantas e redução da área foliar Difícil de distinguir a infecção deste com o PVY (Zerbini Jr et al., 2002)

50 Sintomas

51 Controle Resistência Controle genético Capsicum annuum Pvr4 Capsicum chinense - pvr1

52 Material e Métodos Gaiolas recobertas com tela anti-afídeo Delineamento inteiramente casualizado 127 acessos Sudré et al, 2005, Bento et al., 2007 e Lima et al., 2007 Dez repetições Duas testemunhas

53 Inoculação 3 a 4 folhas definitivas Isolado 3 - Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Viçosa (Truta et al, 2004) Inóculo maceração de 1g de folhas jovens de fumo (Nicotiana debneyi) Tampão de fosfato de potássio ph 7,2 Carborundum Transmissão mecânica - gaze contendo o inóculo As testemunhas solução tampão + Carborundum Avaliação 15 dias após a inoculação Método avaliação - notas

54 Escala de Notas Notas Sintomas 1 com ausência visual de sintomas 2 com sintomas leves 3 sintomas com intensidade mediana 4 sintomas intensos 5 mosaico foliar e com sintomas severos tais como: mosaico generalizado, mosaico bolhoso, distorção foliar e redução da área foliar.

55 Escala de Notas

56 Confirmação da Resistência Teste Sorológico (Enzyme-Linked Imunosorbent Assay, ELISA) Laboratório de Virologia Vegetal UFV 0,5g de folhas jovens de Capsicum spp. trituradas Nicotiana debneyi controle positivo 2,5ml de tampão de extração (diluição 1:5) 20ºC negativos

57 Incubada a temperatura ambiente no escuro Intensidade de coloração a 405nm Absorbância - inferior a duas vezes a média do controle negativo Negativos para vírus

58 Resultados UENF 1770 UENF 1800 UENF 1553 UENF 1727 UENF 1742 UENF 1615

59 Acessos resistentes Nº UENF Espécie Procedên cia 1624 C.baccatum var.pendulum Média Elisa indireto Avaliação final Campos, RJ 1,0 e - R 1703 C. chinense Viçosa, MG 1,0 e - R 1730 C. chinense Peru 1,0 e - R 1732 C. baccatum var.pendulum Campos, RJ 1,0 e - R 1751 C. chinense Parintins, PA 1,0 e - R 1755 C. chinense Peru 1,0 e - R 1764 C. chinense Belém, PA 1,0 e - R 1770 C. chinense Belém, PA 1,0 e - R 1803 C. chinense Campos, RJ 1,0 e - R C. annuum var. annuum cv. Ikeda - 2,0 d + S

60 A(405) (-) 1730 (-) N.debneyi (-) N. debneyi isol. 3 (+) N. debneyi isol. 11 (+) (-) 1770 (-) N.debneyi (-) N. debneyi isol. 11 (+) N. debneyi isol. 3 (+) Acessos Figura 1 Absorbâncias (405nm) obtidas para alguns dos acessos de Capsicum spp. analisados para resistência ao PepYMV.

61 Conclusões Nove acessos resistentes Dois acessos C. baccatum var. pendulum Sete acessos C. chinense A resistência: expressa em temperaturas altas e baixas

62 HERANÇA DE CARACTERES AGRONÔMICOS E DA RESISTÊNCIA AO Pepper Yellow Mosaic Virus em Capsicum baccatum var. pendulum Tese: Leandro Simões Azeredo Gonçalves (2010)

63 Capsicum baccatum: - Capsicum baccatum var. pendulum - Capsicum baccatum var. baccatum Tipos de frutos: - Dedo-de-moça - Cambuci - Cumari

64 Objetivos 1) Determinar a herança de características agronômicas e de resistência ao Pepper yellow mosaic virus em Capsicum baccatum var. pendulum, e 2) Avaliar mecanismos bioquímicos de resistência ao Pepper yellow mosaic virus.

65 MATERIAL E MÉTODOS

66 Dialelo Número Acessos UENF X1* 1X2 1X3 1X4 1X5 2 UENF X2* 2X3 2X4 2X5 3 UENF X3* 3X4 3X5 4 UENF X4* 4X5 5 UENF X5*

67 Condições experimentais

68 Avaliação da presença do gene Pvr4: O marcador do tipo CAPS (co-dominante), desenvolvido por Caranta et al. (1999). As sequências dos iniciadores foram CSO-F (5 - CGAAGAGAGAAGGTC-3 ), CSO-R (5 - TCAGGGTAGGTTATT-3 ) Para a clivagem dos fragmentos amplificados foi utilizada a enzima de restrição AlwNI

69 Proteínas relacionadas à patogênese (PRs) avaliadas: LTP; Quitinase; Peroxidase; e β-1,3-glucanase.

70 Conclusões: Efeitos aditivos e de dominância foram detectados no controle da expressão gênica da Resistência. 3 - As combinações híbridas UENF 1629 x UENF 1732, UENF 1616 x UENF 1732 e UENF 1624 x UENF 1639 são promissoras para dar início a um programa de melhoramento de C. baccatum, pois reúnem características agronômicas favoráveis e de resistência ao PepYMV.

71 4- O marcador molecular do tipo CAPS mostrou-se eficiente em distinguir as plantas resistentes ao PepYMV. 5- Os acessos UENF 1624 e UENF 1732 (C. baccatum var. pendulum) revelaram a presença do gene Pvr4. 6- Os acessos de C. chinense (UENF 1730 e UENF 1755), embora sejam resistentes não possuem o gene Pvr4. 7- Proteínas-PR

72 Peroxidase is involved in Pepper yellow mosaic virus resistance in Capsicum baccatum var. pendulum L.S.A. Gonçalves 1, R. Rodrigues 1, M.S.S. Diz 2, A.T. do Amaral Júnior 1, A.O. Carvalho 2 and V.M. Gomes 2 Genetics and Molecular Research, 2012 The present study aimed to analyze the induction of PRs, focusing on β-1,3-glucanase, chitinase, LTPs, and peroxidase in C. baccatum var. pendulum plants, accession UENF 1624, which is resistant to PepYMV

73 A M M B Uninoculated Inoculated Figure 4. (A) Polyacrylamide gel electrophoresis in 15% and (B) Peroxidase activity gel electrophoresis of control (uninoculated) and inoculated samples, at different times (0, 24, 48, 72 and 96 hours) after inoculation with Pepper yellow mosaic virus in plants of C. baccatum var. pendulum (UENF 1624); M molecular weight marker in KDa. Gonçalves et al. 2012, Genetics and Molecular Research

74 Control (Uninoculated) Inoculated Peroxidase activity (ua./t.µg protein ml -1 ) h 24 h 48 h 72 h 96 h Figure 5. Peroxidase activity in leaves of C. baccatum var. pendulum (UENF 1624) non-inoculated and inoculated with Pepper yellow mosaic virus, from 0 to 96 hours.

75 Inheritance of resistance to Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) in Capsicum baccatum var. pendulum C. dos S. Bento 1, R. Rodrigues 1, L.S.A. Gonçalves 1, H.S. Oliveira 1, M.H. dos Santos 1, M.C. Pontes 1 and C.P. Sudré 1 (Genetics and Molecular Research, 2012) This study aimed to evaluate the genetic basis of resistance of C. baccatum var. pendulum to the potyvirus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV).

76 MATERIAL AND METHODS Plant material UENF 1616, susceptible to PepYMV UENF 1732, resistant to PepYMV F 1 F 2 Backcrosses (BC 1:1 and BC 1:2 ).

77 Seedlings cultivated in a growth chamber, with controlled temperature, photoperiod and humidity (25 C, 12 h and 80%, respectively) Size population: Twenty plants - parents and F 1 hybrid 200 F 2 plants 50 plants in each backcross generation (BC 1:1 and BC 1:2 ). Negative control: Two healthy plants of each parental 20 plants of the cultivar Criollo de Morelos (R) 20 plants of the cultivar Ikeda (S) Inoculation and evaluation (Bento et al., 2009)

78 Table 1. Estimates of the genetic parameters obtained from the values of AUDPC for the assessment of resistance to PepYMV, evaluated in plants of generations P 1, P 2, F 1, F 2, BC 1 : 1 and BC 1 : 2 from the cross between UENF 1616 and UENF 1732 of C. baccatum var. Pendulum. Genetic Parameters Resistence PepYMV Phenotypic variation ( 2 p) Environmental variance ( 2 e) 8.75 Genotypic variance ( 2 g) 4.83 Additive variance ( 2 a) 2.96 Variance of dominance ( 2 d) 1.87 Broad-sense heritability (h 2 a) Narrow-sense heritability (h 2 r) Average degree of dominance (ADD) 1.12 Minimum number of genes ( ) 7.00 Generation coefficient of genotypic determination ( 2 ) -

79 IDENTIFICAÇÃO DE FONTES DE RESISTÊNCIA À ANTRACNOSE EM ACESSOS DE Capsicum spp. SORAIA DE ASSUNÇÃO MONTEIRO DA SILVA Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas Objetivo geral identificar fontes de resistência à antracnose no banco de germoplasma de Capsicum da UENF. Objetivos específicos: i) investigar a reação de 37 acessos de Capsicum spp. da coleção de germoplasma da UENF em relação ao Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) em diferentes órgãos da planta (folha jovem, fruto imaturo e fruto maduro); ii) avaliar a reação dos acessos em diferentes condições ambientais: fruto na planta em casa de vegetação, e fruto destacado mantido em condições de laboratório; iii) comparar os resultados e identificar a forma mais eficiente de avaliação na discriminação entre genótipos resistentes e suscetíveis

80 37 acessos de Capsicum spp. da coleção de germoplasma de do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal do CCTA/UENF Já descritos por Sudré et al. (2005) e Bento et al. (2007) e também avaliados para o vírus do mosaico amarelo por Bento et al., (2009)

81 Locais dos experimentos e condições experimentais O trabalho foi conduzido em três etapas: Avaliação da resistência em folhas (primeira etapa) Em frutos na planta (segunda etapa) Em frutos destacados (terceira etapa) Produção de mudas - Câmara de crescimento Controle de temperatura (27 2 C) Fotoperíodo (16h luz/8h ) Umidade (80%)

82 Preparo do Inóculo Meio BDA, com ph 7,0, até a formação de colônias (7 a 10 dias), incubados no escuro a 25 C (Araújo et al., 2007) A suspensão de esporos Concentração de 1,0 x 10 6 conídios/ml, Liberando conídios com auxílio de um pincel e a suspensão A concentração ajustada através de contagem em Câmara de Neubauer (Carvalho et al., 1997)

83 Inoculação das folhas Três folhas por planta: inoculadas e analisadas a cada 24 horas durante sete dias após inoculação (Mahasuk et al., 2009) Em seguida foram lavadas com água destilada (x 3) 4 gotas com 5 µl foram aplicadas a superfície do limbo foliar (Mahasuk et al., 2009)

84 Inoculação dos frutos na planta Na fase de florescimento: Os botões florais foram identificados com etiquetas na antese; Três frutos por planta foram inoculados; Frutos verde e vermelhos maduros; Pericarpo; No meio do fruto, (Mahasuk et al., 2009).

85 Inoculação dos frutos - laboratório Frutos colhidos dias após a antese Identificados e levados ao laboratório Desinfestados: NaOCl (1%) Lavados 3X em água deionizada esterilizada Inoculados: 1,0 x 10 6 conídios/ml Temperatura: 28ºC Perda excessiva de água: algodão embebido em água deionizada esterilizada

86 Avaliação Início: 24 h após inoculação Observações a cada 24 h Final da avaliação: 7 dias após a inoculação (DAI) Resistência: Período de Incubação Notas Escala Sintomas nas folhas e nos frutos pela escala proposta por Mahasuk et al., 2009 Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD) Fonte: Mahasuk et al., 2009

87 RESULTADOS Folhas: Sem sintomas decorrentes das inoculações feitas nas folhas das plantas A inoculação em frutos: imaturos e maduros: Casa de vegetação Laboratório Sintomas de antracnose em frutos de pimenta