BIBIANA SAGRILLO GINDRI. CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO CITOGENÉTICO EM LORICARIINAE (Siluriformes, Loricariidae) DA REGIÃO DO ALTO TAQUARI

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1 BIBIANA SAGRILLO GINDRI CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO CITOGENÉTICO EM LORICARIINAE (Siluriformes, Loricariidae) DA REGIÃO DO ALTO TAQUARI MARINGÁ PARANÁ BRASIL FEVEREIRO 2009

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3 BIBIANA SAGRILLO GINDRI CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO CITOGENÉTICO EM LORICARIINAE (Siluriformes, Loricariidae) DA REGIÃO DO ALTO TAQUARI Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de Mestre. MARINGÁ PARANÁ BRASIL FEVEREIRO 2009

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5 À minha mãe. Ao Pedro. Ao Marcos. Ao João Itsuo. Com carinho, dedico. iii

6 AGRADECIMENTOS A Deus, fonte inesgotável de força para enfrentar as dificuldades e, acima de tudo, de saúde para seguir em frente. Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento - PGM, pelo auxílio na realização deste curso. À Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul Unidade de Coxim, por disponibilizar o laboratório para o processamento dos peixes, material em estudo desta Dissertação. À minha orientadora, professora doutora Isabel Cristina, que me ensinou a ser crítica e a ter confiança em minhas decisões. Por você tenho um carinho todo especial. Obrigada Isabel! Se não fosse você, com certeza, não chegaria aqui. À professora doutora Ana Luisa de Brito Portela, que contribuiu com meu trabalho, sempre disposta a ajudar nas fotos e interessada no andamento das pesquisas. À professora doutora Luciana Borin, espelho para os novos pesquisadores, sempre feliz e de bem com a vida. À minha mãe, Terezinha Inez Sagrillo, que nunca mediu esforços para que meus sonhos se realizassem. Ao meu filho, João Itsuo Gindi Sonohata, que, mesmo pequenino, conseguiu compreender os motivos da minha ausência. Ao meu grande amor, Marcos Mitsuo, que sempre teve a capacidade de incentivar, dar forças, compreender meus choros e minha ausência. Ao senhor Itsuo Sonohata, dona Maria Madalena Baldin Sonohata, Maritsa Missae Sonohata e Roberto Itsuo Sonohata que, com muito carinho, cuidaram do meu filho e sempre torceram pela minha vitória. À tia Maria Gorete Sagrillo Machado, que abandonou tudo para que eu pudesse crescer. Aos colegas do Núcleo de Estudos de Citogenética de Peixes - Nuclescipe da Universidade Estadual do mato Grosso do Sul Unidade de Coxim, Elis Aparecida Morita Melo, Greicy Ellen de Brito Ferreira, Josimar Lara da Silva e Aline Motta, que sempre estiveram disponíveis no processamento dos peixes e, principalmente, nas divertidas coletas. iv

7 Ao técnico de laboratório, Márcio Tomaz, que sempre esteve disposto a colaborar com o trabalho. Ao Manoel Gaspar Manso Perez e à Ângela Manso Perez, que gentilmente disponibilizaram o local de coleta. À família Vinas Vieira, pela acolhida e ajuda nos momentos difíceis em Maringá. À Maria José Barros, exemplo de pessoa, garra e força, sempre cuidando de mim, dividindo alegrias e tristezas. Ao Leonardo Garcia Mommensohn, que incansavelmente e gentilmente foi prestativo em todas as minhas necessidades no laboratório. À Suzana Paiva, que me mostrou como as pessoas são diferentes e o quanto precisamos aprendê-las e amá-las como são. Obrigada por me mostrar o outro lado das coisas e aprender como é gratificante aprender a respeitar a forma de pensar de cada um. Ao Paulo Emilio Botura, que me fazia rir no laboratório, sempre me ensinando a ter paciência para fazer Banda C. Ao Renan Okawara, por ter me ensinado que a humildade é uma das maiores virtudes do ser humano. À Fernanda Errero Porto, pela paciência em me ensinar, por saber me ouvir e por chorar tantas vezes comigo. Obrigada Fer! Você é uma grande amiga! Existem pessoas que hoje são parte da minha vida e com as quais eu descobri, tanto profissionalmente como pessoalmente, que não existem palavras capazes de expressar o significado delas para mim. Aos céus eu faço uma prece de agradecimento a Deus por tantas pessoas valiosas que passaram pela minha vida. v

8 BIOGRAFIA Bibiana Sagrillo Gindri, filha de Carlos Gilberto Gindri e Terezinha Inez Sagrillo, nascida no dia 25 de abril de mil novecentos e oitenta e dois, na cidade de Campo Grande - MS. Concluiu o Ensino Fundamental, no ano de 1996, no Colégio Estadual Medianeira, em Santiago RS, e o Ensino Médio, em dezembro de 1999, na Escola Estadual de Ensino Médio Carlos Kluwe, em Bagé - RS. Ingressou, em 2001, no curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, concluindo o curso em Durante a graduação, participou, dentre outras atividades, de estágios, projetos de pesquisa e projetos de extensão. Em março de 2008, matriculou-se no curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento da Universidade Estadual de Maringá. vi

9 ÍNDICE RESUMO... VIII ABSTRACT... X 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA A bacia do Alto Taquari Família Loricariidae Subfamília Loricariinae MATERIAIS E MÉTODOS Material Métodos Análises citogenéticas Preparação de cromossomos mitóticos Estimulação de metáfases Técnica air drying Bandamentos cromossômicos Estudo da região organizadora do nucléolo Técnica de nitrato de prata (AgNOR) Cromomicina a 3 e mitramicina a (GC-específicos) Estudo da heterocromatina constitutiva Bandamento C Medidas cromossômicas RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS vii

10 RESUMO GINDRI, Bibiana Sagrillo M.Sc. Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de Contribuição ao estudo citogenético em Loricariinae (Siluriformes, Loricariidae) da região do Alto Taquari. Orientadora: Profª. Drª. Isabel Cristina Martins dos Santos. Conselheiros: Profª. Drª. Margarida Maria de Rossi Vieira e Profª. Drª. Ana Luisa de Brito Portela Castro. A família Loricariidae constitui uma das maiores famílias da ictiofauna mundial distribuídas na região neotropical. Na família Loricariidae, encontra-se a subfamília Loricariinae e, dentro dessa, os gêneros: Farlowella, Sturisoma, Loricaria e Pyxiloricaria. Estudos citogenéticos foram realizados em exemplares de Farlowella amazona, por meio da técnicas de coloração usual com Giemsa e de bandamentos NOR e C. A análise do cariótipo de Farlowella amazona revelou a presença de 2n=58 cromossomos, fórmula cariotípica 18m+20sm+12st+8a e NF=96, sem diferenças entre os sexos. A análise pela coloração usual por Giemsa revelou a presença de uma constrição secundária, polimórfica em tamanho, coincidente com a região organizadora do nucléolo (NOR). Esta região foi detectada pela técnica de coloração com nitrato de prata, em posição subterminal do braço longo do par número 26. Além deste par, o rdna esteve presente no braço curto de outro par de acrocêntrico, provavelmente o 27. O padrão de banda C mostrou presença de heterocromatina centromérica na maioria dos cromossomos e seis pares marcadores com bandas intersticiais e/ou proximal ao centrômero, presentes no braço longo dos pares 11, 12, 20, 23, 25 e 26. A análise de exemplares de Sturisoma robustum mostrou 2n= 66 cromossomos, fórmula cariotípica 18m+22sm+10st+16a, NF = 116 e também não houve diferenças quanto ao sexo. A coloração pela prata mostrou marcação no braço curto do par 21, evidenciando um sistema de NOR simples. O padrão de bandamento C revelou a presença de marcação na região pericentromérica de alguns pares cromossômicos e a região da NOR apresentou-se BC positiva. Loricaria sp. mostrou a presença de 2n=64 cromossomos, fórmula cariotípica 12m+ 8sm+2st+42a e NF=84. A técnica pelo nitrato de prata mostrou marcação intersticial evidente no braço longo do par 13, um dos maiores cromossomos acrocêntricos. O padrão de bandeamento C apresentou marcação evidente na região da NOR e pericentromérica em alguns cromossomos. A análise viii

11 citogenética de Pyxiloricaria menesezi revelou 2n=68 cromossomos, fórmula cariotípica 8m+6sm+4st+50a, NF=86. A região organizadora do nucléolo (NOR) revelou marcação na região terminal do braço curto do par 9. O bandamento C mostrou marcações centroméricas e pericentroméricas na maioria dos cromossomos e no braço curto do par 9, portanto, NOR banda C positiva. A coloração por cromomicina foi aplicada para os gêneros Pyxiloricaria, Loricaria e Sturisoma e marcou a região coincidente com a região da NOR. Os resultados deste estudo foram discutidos e corroboraram a proposição de filogenia proposta para a subfamília, quando analisados o alto número de cromossomos do tipo meta/submetacêntricos observados em Farlowella amazona e a pouca ocorrência desses tipos cromossômicos observado em Pyxiloricaria menezesi e Loricaria sp. Palavras-chave: Citogenética de peixes, Loricariidae, evolução. ix

12 ABSTRACT GINDRI, Bibiana Sagrillo M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, february, Contribution to the cytogenetic study in Loricariinae (Siluriformes, Loricariidae) in the region of Alto Taquari. Supervisor: Profª. Drª. Isabel Cristina Martins dos Santos. Assistant professors: Profª. Drª. Margarida Maria de Rossi Vieira and Profª. Drª. Ana Luisa de Brito Portela Castro. The Loricariidae family constitutes one of the major ichtyophauna families distributed from neotropical region. Among the Loricariidae there are the Farlowella, Sturisoma, Loricaria e Pyxiloricaria genus. Cytogenetic studies were made in Farlowella amazona, by Giemsa techniques and banding NOR and C. The karyotype analysis revealed the presence of 2n = 58 chromosomes, karyotypic formula 16m+26sm+8st+8a e NF = 96, without differences between female and male sex. The analysis by Giemsa revealed the presence of a very evident secondary constriction, polymorphic in size, coincident with the nucleolus organizing region (NOR). This region was detected by silver nitrate technique in terminal region of the long arm of the pair 26. Besides this pair the rdna had been present in the short arm of another pair of acrocentric, probably the number 27. The standard of C band showed the presence of centromeric heterochromatin in the majority of the chromosomes and six marker pair with interstitial bands and/or proximal to the centromere in the long arm of the pairs 11, 12, 20, 23, 25, 26. The analysis of exemplaries of Sturisoma robustum, revealed the presence of 2n=66 chromosomes, with karyotypic formula of 18m+22sm+10st+16a, NF = 116 and also there weren t differences between male and female sex. The staining by silver showed marking in the short arm of the pair number 21, evidencing a system of simple NOR. The standard of C banding revealed the presence of few blocks of constitutive heterochromatin with marking at the pericentromeric region of some chromosome pairs and NOR positive C-banding. Loricaria sp. showed the presence of 2n=64 chromosomes, karyotypic formula 12m+8sm+2st+42a, NF = 84. The silver nitrate technique revealed an evident interstitial marking at the long arm of the pair number 6, one of the biggest acrocentric chromosome. The standard of C banding presented evident marking at the same region of NOR and pericentromeric of some chromosome. The cytogenetic analysis of the x

13 Pyxiloricaria menesezi revealed 2n=68 chromosome, karyotypic formula 8m+6sm+4st+50a, NF=86. The NOR revealed marking in the terminal region of the short arm of the par 9. The C-banding showed marking some centromeric and pericentromeric marking in a great of the chromosomes and at the short arm of the pair 9, being this, band C positive NOR. The coloring by CMA 3 in Pyxiloricaria, Loricaria and Sturisoma marked the coincident region with the NOR region. The results of this study were discussed and corroborate the position of phylogeny propose a for the subfamily, when analyzed the high chromosomes number of the meta / submetacentric type observed in Farlowella amazona and low occurrence of these chromosomal types observed in Pyxiloricaria menezei and Loricaria sp. Key words: Fishes cytogenetic, Loricariidae, Evolution. xi

14 1. INTRODUÇÃO O Pantanal é uma planície sedimentar com superfície de km 2 (Brasil, 2004). Está inserido na bacia do Alto Paraguai (BAP), que se localiza no oeste do Brasil. A BAP, em território nacional, possui uma superfície de km 2 (Brasil, 2004). A bacia do Alto Taquari BAT, com área aproximada de km 2, é uma das principais áreas da rede de drenagem da bacia do Alto Paraguai (BAP). A maior parte da superfície da BAT está localizada no estado de Mato Grosso do Sul (86,5%) e o restante no Mato Grosso (13,5%) (Galdino et al., 2006). Essa bacia exerce grande influência sobre os ecossistemas aquáticos da planície do rio Taquari no Pantanal. Os peixes constituem cerca de metade do grupo dos vertebrados, daí ocuparem uma posição básica na filogenia do grupo (Nelson, 1994). A última revisão sobre a ictiofauna neotropical de água doce (Reis et al., 2003) revelou-se ser bastante rica, incluindo 71 famílias e 4475 espécies reconhecidamente válidas. Este número poderia chegar a 8000 espécies de peixes de água doce neotropicais, o que corresponderia a 25% de todas as espécies de peixes e toda esta diversidade estaria presente em menos de 0,003% da água doce do planeta (Vari e Malabarba, 1998). A superordem Ostariophysi engloba peixes ósseos, que constituem em torno de 3/4 dos peixes de água doce do mundo todo, sendo, portanto, foco de muitos estudos devido a sua enorme diversidade ecológica e evolucionária (de Pinna, 1998; Britto, 2003). Dentro dessa superordem está a ordem Siluriforme que compreende um grupo de peixes extremamente grande, diverso e amplamente distribuído nas regiões tropicais de todo o mundo (Burges, 1989; Ferraris, 1998), por esse motivo são peixes com grande complexidade taxonômica. Na ordem Siluriforme está inclusa a família Loricariidae que, em função da morfologia altamente especializada, foram reconhecidos como um grupo monofilético na classificação recente dos Siluriformes (Schaefer, 1987; Armbruster, 2004). A família Loricariidae apresenta cerca de 690 espécies e estava até então dividida em seis subfamílias (Reis et al., 2003). Armbruster (2004) incluiu Ancistrinae dentro de Hypostominae, totalizando então 5 subfamílias dentro da família Loricariidae, sendo a nova subfamília Hypostominae a ser composta por 1

15 cinco tribos: Hypostomini, Pterygoplichithini, Corymbophanini, Ancistrini e Rhinelepini. Recentemente, Reis et al. (2006), com análises de Delturus e Hemipsilichthys, descreveu uma nova subfamília, Delturinae, passando então a família Loricariidade voltar a possuir seis subfamílias: Hypoptomatinae, Loricariinae, Hypostominae, Neoplescotominae, Lithogeninae e Delturinae. Nessas seis subfamílias, duas exibem baixo número de espécies e sua distribuição é restrita: Lithogeneinae (2 spp.) e Delturinae (7 ssp.); uma contendo um moderado número de espécies: Neoplecostominse (33 ssp.); e três são ricas em espécies bem distribuídas (mais que 60 spp.): Hypoptopomatinae, Loricariinae e Hypostominae (Chiachio et al. 2008). Covain e Fisch-Muller (2007) dividem esta subfamília em duas tribos: tribo Hartiini, onde podem ser encontrados os gêneros Farlowella e Sturissoma, e tribo Loricariini, que inclui os gêneros Pyxiloricaria e Loricaria. Farlowella e Sturisoma são peixes que possuem adaptações especiais para se alimentarem de detritos, apresentando importante papel na cadeia alimentar e no processo de remineralização em águas tropicais. Três são as peculiaridades que chamam a atenção nos gêneros em questão. Primeiro, constituem peixes que apresentam requisitos alimentares especiais, são de distribuição gregária e são extremamente sensíveis a alterações da disponibilidade de algas, servindo como bons bioindicadores. A presença destas espécies, bem como aspectos de seu comportamento alimentar, reprodutivo e social constitui indicadores do estado de conservação ambiental. Segundo, não existe dados citogenéticos no gênero Farlowella descritos na literatura até o momento e apenas uma das 15 espécies válidas de Sturisoma tem o seu cariótipo descrito. Terceiro, são peixes que possivelmente estão em vias de extinção devido à extrema sensibilidade ao meio ambiente e como se trata de espécies dóceis, que possuem o hábito de ficarem horas paradas, imóveis e aparência exótica são capturados excessivamente para aquariofilia. O gênero Loricaria apresenta cauda achatada com fortes quilhas laterais e, frequentemente, um entalhe na parte posterior da órbita, sendo constituída por 11 espécies restritas à América do Sul. Caracteriza-se por apresentar o abdômen revestido de placas pequenas ou ser parcialmente nu, pela presença de filamentos no lábio inferior e os dentes da maxila superior ter o dobro do tamanho dos dentes da mandíbula (Isbrucker, 1981). 2

16 O gênero Pyxiloricaria é considerado um gênero monotípico: Pyxiloricaria menezesi. Esta espécie caracteriza-se por apresentar as bordas da cabeça retas, formando um ângulo de aproximadamente 80 graus, olho com entalhe orbital raso e muito pequeno e raio mais superior da caudal prolongado em longo filamento. O presente trabalho tem por objetivo analisar citogeneticamente as espécies Farlowella amazona, Sturisoma robustum, Loricaria sp. e Pyxiloricaria menezesi, estabelecendo os principais mecanismos de rearranjos cromossômicos envolvidos durante a diversificação dos diferentes grupos, bem como discutir as relações de proximidade evolutiva entre eles. 3

17 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. A bacia do Alto Taquari O rio Taquari, com seus 801 km de extensão total, possui suas nascentes nas terras altas entre a Serra da Saudade e a Serra de Maracaju, no estado de Mato Grosso (Brasil, 1974). Após percorrer aproximadamente 34 km no estado de Mato Grosso e 134 km como divisor deste estado com o de Mato Grosso do Sul, o rio Taquari entra em território sul mato-grossense (Galdino et al., 2006). Próximo à cidade de Coxim, o rio Taquari recebe as águas do seu principal tributário, o rio Coxim, e logo adentra o Pantanal, seguindo uma direção Leste- Oeste (Galdino et al., 2006). A bacia do Alto Taquari (BAT), com superfície aproximada de km, compreende a área do planalto drenado pelo rio Taquari e seus afluentes até a escarpa cuestiforme da bacia sedimentar do Paraná, próxima à cidade de Coxim. (SEMAC, 1992; Santos e Crepani, 1993). A maior parte da superfície da bacia do Alto Taquari está localizada no estado de Mato Grosso do Sul (86,5%) e o restante em Mato Grosso (Galdino et. al., 2006). Esta bacia é conhecida pela grande quantidade de peixes existentes em seus cursos d água. Este fato se deve ao fenômeno da subida de cardumes migratórios que usam parte da bacia como área de reprodução (Resende et al., 1995). Entretanto, dados recentes mostram acentuada queda da produção pesqueira nessa bacia, pois o aumento do aporte de material em suspensão nos corpos d água, fato amplamente documentado na bacia, é prejudicial à qualidade da água e às comunidades aquáticas em dois aspectos: por assorear o leito do rio, o que influi na mobilidade e dinâmica do fundo do seu leito, e, principalmente, por alterar as características físicas e químicas da água. A bacia hidrográfica do rio Taquari (BHT), pela sua extensão territorial (84 mil km), posição geográfica estratégica em relação à planície, características geológicas, pedológicas, edafo-climáticas e socioeconômicas, exerce grande influência na conservação do Pantanal (Brasil, 1997b). Isso a caracteriza como uma das mais importantes bacias hidrográficas da bacia do Alto Paraguai-BAP. 4

18 Devido à pesca esportiva e comercial, a ictiofauna possui grande importância socioeconômica para o estado do Mato Grosso do Sul (MS), principalmente dentro da BAP (Resende, 1988). No Pantanal, foram identificadas mais de 260 espécies de peixes (Britski et al., 1999). A maioria dessas espécies certamente ocorre na BAT, dada a sua dimensão e falta de barreiras que impeçam a livre dispersão. Além da divisão geopolítica, a BAT também pode ser dividida em subbacias. Galdino et al. (2006) dividiram a BAT em quatro sub-bacias: sub-bacia do rio Taquari, compreendendo a área de drenagem do rio Taquari a montante da confluência com o seu principal afluente, o rio Coxim; sub-bacia do rio Coxim, com seção de controle a montante do seu mais importante tributário, o rio Jauru; sub-bacias são as do rio Jauru e do Taquari-Mirim. Os principais cursos de água que cortam o município de Coxim Mato no Grosso do sul são os rios Taquari, Taquari-mirim e Jaurú, além dos córregos do Onça, Sítio, Fortaleza e Criminoso. O córrego do Onça se situa ao norte do estado de Mato Grosso do sul, no município de Coxim, no distrito de Silviolândia. Trata-se de um dos afluentes da margem esquerda do rio Taquari, percorrendo uma extensão de aproximadamente 35 km inteiramente no município, com sua nascente próxima ao distrito de Jaurú, do lado direito da Cadeia de Serras de Maracajú. O referido córrego, cuja largura não ultrapassa 11 metros desde sua nascente até a foz, em toda a sua extensão, apresenta uma área plana e recebe muitos sedimentos provenientes de trechos superiores formados por morros e colinas de onde provêem seus poucos e pequenos tributários. Apresenta águas ligeiramente turvas, mesmo na ausência de chuva, sendo que os sedimentos de fundo variam entre rochoso, pedregoso, cascalho e arenoso com maior predominância de areia. Não apresenta corredeiras intensas, alternando trechos com velocidade de pouca intensidade e remansos com deposição de sedimentos como matéria orgânica em decomposição em fundos lodosos, onde há menor teor de oxigênio dissolvido (Galdino et al.,2006) Peixes neotropicais: características gerais e citogenéticas A fauna neotropical de peixes de água-doce é consideravelmente rica, porém nenhum levantamento completo está ainda disponível para estudos 5

19 quantitativos. Os levantamentos ictiofaunísticos realizados na bacia do rio Paraná, assim como nas outras bacias hidrográficas brasileiras, ainda estão incompletos (Agostinho e Júlio Jr., 1999). Os peixes, comparados aos demais grupos de vertebrados, apresentam poucos dados sobre a sistemática, evolução, ecologia, fisiologia e genética (Centofante, 2003). Uma das principais razões para essa carência é o elevado número de espécies, que chega a cerca de (Nelson, 1994), o que equivale, aproximadamente, ao número de espécies dos demais vertebrados juntos. Além disso, o habitat desses peixes dificulta seu estudo quando levado em conta a captura, observação e determinação dos padrões biológicos (Bohlke et. al, 1978). Por outro lado, os peixes constituem um grupo bastante favorável ao estudo citogenético e evolutivo, uma vez que ocupam uma posição basal na filogenia dos vertebrados (Nelson, 1994). Estudos citogenéticos em peixes neotropicais iniciaram-se, na década de 60, por pesquisadores europeus e, no início da década de 70, por pesquisadores brasileiros, com publicações para duas populações de Astyanax. (Jim e Toledo, 1975), seguido por Pimelodidae (Toledo; Ferrari, 1976), Cichlidae e Loricariidae (Michele et al.,1977a, b) respectivamente (Artoni et al., 2000). Na América do Sul, de acordo com Bolhke et al. (1978), existe cerca de 2500 a 3000 espécies de peixes de água doce, podendo chegar a Esta, juntamente com a América Central, representam uma das mais diversificadas e ricas ictiofaunas do mundo, englobando aproximadamente 8000 espécies descritas, representando aproximadamente 25% de toda a diversidade de peixes. Na região neotropical de água doce, as duas ordens mais representativas em número de espécies conhecidas são os Characiformes e os Siluriformes (Artoni et al., 2001), sendo que, estudos desenvolvidos em citogenética de peixes brasileiros concentram-se basicamente nessas duas ordens. Estas análises têm levado à caracterização do número cromossômico e do cariótipo de muitas espécies, levantado uma considerável soma de informações relativas à presença e distribuição da heterocromatina constitutiva e das regiões organizadoras de nucléolo (Ag-NORs). Estes estudos constituem uma importante ferramenta na abordagem de questões evolutivas, sistemáticas, além de estudos de polimorfismo e poliploidia cromossômica (Araújo et al., 1998). A análise citotaxonômica tem trazido uma grande contribuição ao estudo da evolução, 6

20 principalmente pelo fato de que os cromossomos constituem o próprio material genético e, portanto, alterações desses parâmetros são quase sempre significativas para o rumo evolutivo das espécies (Guerra, 1988). Os dados sobre a estrutura cariotípica dos peixes neotropicais de águas continentais foram revistos pela primeira vez por Almeida-Toledo (1978), que listou o número cromossômico haplóide e/ou diplóide de 252 espécies de água doce da América do Sul e Central. Oliveira et al. (1988) verificaram a presença de dados citogenéticos de 433 espécies. Uma revisão mais recente mostrou números diplóides e/ou haplóides para 921 espécies distribuídos em 252 gêneros e 44 famílias, com registro de grande diversidade cariotípica (Oliveira et al., 2000). Nos últimos anos, devido basicamente à utilização de novas técnicas de análises cromossômicas, a citogenética apresentou um razoável desenvolvimento que possibilitou uma contribuição mais efetiva não só para os estudos filogenéticos e taxonômicos, como, também, uma maior compreensão da estrutura cromossômica dos peixes (Andreatta,1991) Família Loricariidae A família Loricariidae, pertencente à ordem Siluriformes, apresenta cerca de 600 espécies, 70 gêneros, distribuídos em 7 subfamílias. (Isbrucker, 1980; Burguess, 1989; Armbruster, 2004), Os loricarídeos são popularmente conhecidos por "cascudos" devido à couraça que recobrem seus corpos, sendo estas pequenas placas ósseas adaptadas, em forma de escamas,0 que recobrem o corpo com várias fileiras (de três a quatro), e lhes conferem aparência visual e sensação tátil de uma lixa. Essa "armadura" geralmente recobre apenas a região dorsal deixando a região ventral lisa (Britski, 2007). Dentro da ordem Siluriforme, a superfamília Loricariodea é considerada um grupo monofilético, cujo relacionamento é bem determinado, (de Pinna, 1998; Britto, 2003) e estão incluídas as famílias: Loricariidae, Astroblepidae, Scoloplacidae, Callichthyidae, Trichomycteridae e Nematogenyidae (Schaefer, 1991). A família Loricariidae apresenta cerca de 690 espécies e estava, até então, dividida em seis subfamílias (Reis et al., 2003): Hypoptomatinae, Loricariinae Hypostominae, Ancistrinae, Neoplescotominae e Lithogeninae. Mais 7

21 recentemente, Armbruster (2004) incluiu os Ancistrinae dentro dos Hypostominae, totalizando, então, cinco subfamílias dentro da família Loricariidae. A nova subfamília Hypostominae passou a ser composta por cinco tribos: Hypostomini, Pterygoplichithini, Corymbophanini, Ancistrini e Rhinelepini. A família Loricariidae, embora componha uma das maiores famílias de peixes do mundo, com aproximadamente 683 espécies distribuídas na região neotropical (Reis et al., 2003) e com maior número de relatos citogenéticos, é pouco estudada devido ao grande número de espécies que possui. Dentro desta família, a subfamília Hypostominae é a mais estudada do ponto de vista citogenético, com aproximadamente 53 espécies, seguida pela subfamília Loricariinae, com aproximadamente 19 espécies (Alves et al., 2003). Do ponto de vista citogenético, a família Loricariidae se caracteriza por apresentar uma ampla variação no número diplóide, de 2n=36 cromossomos para Rineloricaria latirostris (Giuliano-Caetano, 1998), chegando a 2n=96 cromossomos para Upsilodus sp. (Kavalco et al., 2005). A presença de cromossomos sexuais do tipo XX/XY e ZZ/ZW, ocorrência de cromossomos B (supranumerários) e grande diversidade cariotípica devido a rearranjos cromossômicos (rearranjos Robertsonianos e inversões pericêntricas) fazem desta família um material extremamente rico do ponto de vista citogenético (Giuliano-Caetano, 1998). Para a região do Pantanal, estudos citogenéticos na família Loricariidae estão restritos ao gênero Otocinclus: Otocinclus vittatuso (rio Taquari, Coxim, MS), Liposarcus anisitsi (rio Miranda, Mato Grosso do Sul) e no rio Araguaia, Mato Grosso, onde foram analisados Hemiancistrus sp, Panaque cf. nigrilineatus, Hypostomus emarginatus, Hypostomus sp G, Hypostomus sp, e Sturisoma cf. nigrirostrum (Alves, 2005) Subfamília Loricariinae A principal característica dos loricariíneos é o achatamento do corpo. As placas ao longo da linha lateral formam duas quilhas paralelas na porção anterior do corpo que vão se aproximando progressivamente para trás, até se unirem formando uma quilha única sobre o pedúnculo caudal. 8

22 Isbrücker (1979) listou 27 gêneros para Loricariinae, descrevendo oito novos gêneros, com quatro tribos e oito subtribos, através de dados morfológicos, sem interfaces filogenéticas. Estas incluem: 1) Loricariini, com seis subtribos (Loricariina, Planiloricariina, Reganellina, Rineloricariina, Loricariichthyina e Hemiodontichthyina), 2) Harttiini, incluindo duas subtribos (Harttiina e Metaloricaria), 3) Farlowellini; e, finalmente, 4) Acestridiini. De acordo com a base de dados on line Fish Base, o gênero Loricaria passou por alterações quanto à classificação taxonômica de algumas espécies inseridas nesse gênero. O número de 112 nomes científicos no grupo foi reduzido para apenas 14 espécies validas. Assim, as espécies registradas como L. carinata, L. parva, L. prolixa, L. macrodon passaram a ser denominadas de Loricaria cataphracta, Loricaria cataphracta, Rineloricaria parva, Proloricaria prolixa e Brochiloricaria macrodon, respectivamente. Estudos citogenéticos têm sido relatados para os loricarideos com informações nas subfamílias Loricariinae (Scavone e Júlio Jr., 1994; Giuliano- Caetano, 1998; Artoni e Bertollo, 2001), Hypoptopomatinae (Andreata et al., 1992; Andreata et al., 1993; Andreata et al., 1994), Hypostominae (Artoni et al., 1998; Artoni et al., 1999; Artoni e Bertollo, 1996, 1999, 2001; Lara-Kamei e Júlio Jr., 2002), Ancistrinae ( Lara, 1998; Artoni e Bertollo, 2001) e Neoplecostominae (Alves, 2000; Kavalco, et al., 2005). Estes estudos têm mostrado uma ampla variabilidade cariotípica em Hypostominae e Loricariinae, diferente de Neoplecostominae e Hypoptomatinae, que apresentam, aparentemente, uma estrutura mais conservada (Alves, 2005). Na subfamília Loricariinae, apenas exemplares dos gêneros Harttia, Loricaria, Loricariichthys, Rineloricaria e Sturisoma foram analisados citogeneticamente e não existem dados citogenéticos nem moleculares para a maioria das espécies da subfamília (Artoni e Bertollo, 1996; Alves, 2005). Uma ampla variação no número diplóide tem sido observada com 2n= 36 cromossomos em Rineloricaria latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) a 2n=74 cromossomos para Sturisoma cf. nigrirostrum (Artoni, 2001). A variabilidade cariotípica observada na subfamília tem sido atribuída a rearranjos cromossômicos do tipo fusões-fissões cêntricas, bem como de inversões, os quais têm desempenhado importante papel na evolução (Alves, 2005). 9

23 Com relação às regiões organizadoras de nucléolo, na maioria das espécies da subfamília Loricariinae, estão localizadas na região terminal, exceto para duas espécies de Harttia que apresentam NOR intersticial. Portanto, NOR simples tem sido considerada como uma característica primitiva dentro do grupo (Artoni e Bertollo, 2001; Alves et al., 2003). Enquanto esta região tem se mantido mais conservada, estudos que evidenciam a heterocromatina constitutiva têm indicado diferentes caminhos evolutivos, com gêneros onde se observa poucos blocos heterocromáticos e outros com blocos mais conspícuos e distribuídos em vários pares de cromossomos. 10

24 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Material Os exemplares de Pyxiloricaria menezesi, Loricaria sp. e Sturisoma robustum foram coletados no córrego do Onça, afluente do rio Taquari, localizado no município de Coxim, MS. Os exemplares da espécie Farlowella amazona foram coletados no córrego do Ribeirão, do rio Taquari. As espécies analisadas, de acordo com Britski, 2007, apresentam a seguinte posição taxonômica: Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Farlowella Espécie:Farlowella amazona Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Pyxiloricaria Espécie: Pyxiloricaria menezes Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Loricaria sp Espécie: Loricaria sp. Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Sturisoma Espécie: Sturisoma robustum 11

25 3.2. Métodos Análises citogenéticas Preparação de cromossomos mitóticos As preparações do material para análise dos cromossomos mitóticos foram feitas utilizando-se a porção cefálica do rim, de acordo com a técnica air drying, modificada para peixe por Bertollo et al. (1978) Estimulação de metáfases Para obtenção de maior número de mitoses, foi utilizada a técnica de estimulação celular através da injeção de uma solução de fermento biológico, descrita inicialmente por Cole e Leavens (1971) para anfíbios e répteis, utilizada por Lee e Elder (1980) para pequenos mamíferos e, posteriormente, por Oliveira et al. (1988) para peixes. O procedimento utilizado foi o seguinte: 1. Preparou-se uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte proporção: 0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 7ml de água destilada. 2. Incubou-se a solução em banho-maria (40 C) por cerca de 20 minutos. 3. Injetou-se a solução dorso-lateralmente no peixe na proporção de 1ml por 100g de peso do animal. 4. Deixou-se o animal em aquário bem aerado por 48 ou 72horas Técnica air drying Esta técnica desenvolvida por Bertollo et al. (1978) consiste em: 1. Injetar intraperitonialmente solução aquosa de colchicina (0,0025%) na proporção de 1 ml/100g do peso do animal. 2. Deixar o peixe em aquário bem aerado por 30 a 60 minutos, sacrificando-o e retirando os órgãos desejados. 3. Lavar rapidamente os fragmentos dos órgãos em solução hipotônica de KCl (0,075), em uma cuba de vidro. 4. Transferir o material rapidamente para outra cuba de vidro, contendo 8 a 10 ml de solução hipotônica (KCl a 0,075M). 12

26 5. Dissociar muito bem o material com o auxílio de pinças de dissecação e, em seguida, com uma seringa hipodérmica desprovida de agulha, suspender o material, por meio de movimentos suaves de aspiração e expiração. 6. Logo após, colocar a solução celular obtida em estufa à temperatura de C, por um período de 30 minutos. 7. Ressuspender o material com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferi-lo para um tubo de centrífuga, descartando os pedaços de tecidos não desfeitos. 8. Centrifugar durante 10 minutos a 900 rpm. 9. Descartar o sobrenadante com pipeta Pasteur e adicionar, vagarosamente, 5 a 6 ml de fixador (3 partes de álcool metílico: 1 parte de ácido acético) recém preparado. 10. Resuspender o material cuidadosamente com pipeta Pasteur. 11. Repetir os itens 8 a 10 por mais 2 vezes. Após a última centrifugação, eliminar o sobrenadante e adicionar 1 ml de fixador, resuspender o material, guardando-o em refrigerador por um período aproximado de um mês, acondicionando-os em pequenos frascos tipo Ependorff. Caso seja guardado em freezer, a suspensão terá uma durabilidade bem maior, desde que o fixador seja renovado a cada 60 dias em média, ou então pode ser trabalhado conforme segue: 12. Pingar 3 a 4 gotas da suspensão celular em regiões de uma lâmina previamente limpa guardada em álcool etílico. Deixar secar diretamente ao ar. 13. Corar com Giemsa diluído a 5% em tampão fosfato ph 6,8, durante 5 minutos. 14. Lavar em água corrente e secar ao ar Bandamentos cromossômicos Estudo da região organizadora do nucléolo Técnica de nitrato de prata (AgNOR) Esta técnica desenvolvida por Howell e Black (1980) consiste em: 1. De posse da lâmina já contendo o material para análise, hidrolisar por 3 minutos em HCl 1N a 60 C, em estufa. 2. Lavar em água corrente e secar ao ar. 13

27 3. Pingar uma gota de solução aquosa de gelatina em dois pontos distintos da lâmina, sobre estas gotas adicionar uma gota de água deionizada. 4. Adicionar sobre as gotas anteriores, duas gotas de solução de nitrato de prata (AgNO3), e cobrir a lâmina com lamínula. 5. Incubar em estufa a 60 C por um período de 3-5 minutos, ou até que a solução adquira uma coloração caramelada. 6. Lavar em água corrente, secar ao ar e analisar em microscópio Cromomicina a 3 e mitramicina a (GC-específicos) Foi empregado o método descrito por Schweizer (1980) e modificado por Schmid (1980) e Galetti Jr. e Rasch (1993): 1. Sobre a lâmina, preparada segundo a técnica descrita para cromossomos mitóticos, colocar 150µl de solução de distamicina A recém preparada, utilizandose uma micropipeta. 2. Cobrir com uma lamínula e deixar agindo por 15 minutos em temperatura ambiente. 3. Lavar a lâmina com tampão McIlvaine (ou água corrente) de modo que a lamínula deslize e saia da lâmina e deixar secar por poucos minutos. 4. Colocar sobre a lâmina 150 µl da solução de cromomicina A 3 ou mitramicina A, com o auxílio de uma micropipeta, sobre a lâmina. Cobri-la novamente com uma lamínula e deixar corando por 60 minutos, no escuro, a temperatura ambiente. 5. Repetir o item Montá-la com uma lamínula, utilizando duas gotas de solução de sacarose saturada e previamente filtrada. 7. Estocar a lâmina à temperatura ambiente ou na geladeira, no escuro, por no mínimo 30 dias antes de analisá-la (para prolongar o tempo de emissão de fluorescência desses corantes). 8. Analisar em fotomicroscópio de fluorescência, com filtro de nm (zona de excitação do azul). 14

28 Estudo da heterocromatina constitutiva Bandamento C Esta técnica desenvolvida por Summer (1972) consiste em: 1. Tratar a lâmina já contendo as gotas do material para análise, com HCl em temperatura ambiente em estufa, por 15 minutos. 2. Lavar a lâmina em água corrente e secar ao ar. 3. Incubar em solução salina de 2xSSC, a 60 C em banho-maria por 15 minutos. 4. Lavar em água corrente e secar ao ar. 5. Incubar a lâmina por 30 segundos em solução de hidróxido de bário (BaOH),em banho-maria a 42 C, com o BaOH, sendo recém preparado e filtrado. 6. Lavar a lâmina rapidamente em solução de HCl e depois em água deionizável e deixar secar ao ar. 7. Incubar a lâmina em solução salina de 2xSSC a 60 C por 1 hora. 8. Lavar em água corrente e secar ao ar. 9. Corar com Giemsa 5% durante 5-10 minutos. 10. Lavar em água corrente, secar ao ar e analisar a lâmina em microscópio Medidas cromossômicas Os cromossomos tiveram sua morfologia estabelecida de acordo com a relação de braços (RB), segundo as proporções propostas por Levan et al. (1964) e classificados em: metacêntricos (RB de 1,00 a 1,70), submetacêntricos (RB de 1,71 a 3,00), subtelocêntrico (RB de 3,01 a 7,00) e acrocêntricos (RB maior que 7,00). O método utilizado para realizar as medidas cromossômicas foi o seguinte: 1. Copiar todas as metáfases a serem analisadas na mesma escala. 2. Fazer uma fotocópia ampliada de cada metáfase, também na mesma escala. 3. Numerar os cromossomos na fotocópia. 4. Delimitar o centrômero e traçar uma linha mediana no interior de cada cromátide. 15

29 5. Medir o comprimento de cada linha mediana com um paquímetro e calcular o tamanho do braço maior e do braço menor, calcular o comprimento total e a relação de braços de cada cromossomo. 6. Calcular o número de cromossomos metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntrico e acrocêntrico de cada metáfase. 7. Repetir os itens de 3 a 6 até que o valor de cada tipo cromossômico (m, sm, st, a) apresente um valor modal nítido. 8. Recortar os cromossomos das fotografias e numerá-los da mesma forma que nas fotocópias. 9. Montar preliminarmente os cariótipos de acordo com as categorias cromossômicas encontradas. 10. Quando padronizados todos os cariótipos, calcular os valores médios do braço maior (BM), braço menor (Bm), comprimento total (CT), comprimento relativo (CR), e relação de braços (RB), de cada par cromossômico. 16

30 Figura 1 - Foto ilustrativa do córrego do Onça onde foram coletados os exemplares de Pyxiloricaria menezesi, Sturisoma robustum e Loricaria sp. Figura 2 - Foto ilustrativa do córrego do Ribeirão de onde foram coletados os exemplares de Farlowella amazona. 17

31 Figura 3 - Mapa esquemático do córrego da Onça de onde foram coletados os exemplares de Sturisoma robustum, Loricaria sp. e Pyxiloricaria menezesi. Figura 4 - Mapa esquemático do córrego do Ribeirão de onde foram coletados os exemplares de Farlowella amazona. 18

32 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO No presente trabalho, foram citogeneticamente analisados exemplares de quatro espécies pertencentes a quatro gêneros da subfamília Loricariinae: Farlowella amazona, Sturisoma robustum, Pyxiloricaria menezese, e Loricaria sp. O Quadro 1 mostra dados citogenéticos de número diplóide, fórmula cariotípica, número fundamental e bandamentos NOR, C e CMA 3 para as espécies analisadas, bem como de outras espécies da subfamília Loricariinae, indicando uma variação de número diplóide com 2n=36 cromossomos em Rineloricaria latirostris a 2n=74 cromossomos em Sturisoma nigrirostrum. Esta ampla variação cariotípica é característica da família Loricariidae, uma das mais complexas da ictiofauna neotropical (Artoni e Bertollo, 1996; Alves et al., 2003). A análise cariotípica de oito exemplares de F. amazona, quatro exemplares fêmeas e quatro machos, revelou a presença de número diplóide de 2n=58 cromossomos, fórmula cariotípica com 18m+20sm+12st+8a, número fundamental (NF) igual a 96 (Figura 5) e ausência de mecanismo de cromossomos sexual. A região subterminal do braço longo do par número 26 (acrocêntrico grande) apresentou uma constrição secundária bem evidente, com heteromorfismo de tamanho entre os homólogos (Figura 5). A análise das regiões organizadoras nucleolares (NORs) de F. amazona pela técnica de nitrato de prata revelou a presença de marcação em dois pares de cromossomos, evidenciando, portanto, um sistema de NOR múltipla (Figura 6a e 6c). O par 26, organizador nucleolar principal, com marcação coincidente com a constrição secundária, e um cromossomo acrocêntrico, provavelmente o par 27, com a AgNOR na região terminal do braço curto. Um polimorfismo de NOR parece estar presente no par 26, no qual se observa AgNOR subterminal em um dos homólogos e terminal no outro. Para a maioria das espécies de Loricariinae, as NORs estão localizadas em posição terminal em um único par de cromossomos. Portanto, a condição de NOR múltipla e em região intersticial, observada em F. amazona, caracteriza uma condição derivada na subfamília. Entre as espécies de Loricariinae, NOR múltipla tem sido encontrada em F. amazona e em uma população de Rineloricaria pentamaculata do córrego Tatupeba pertencente à bacia do rio Paraná (Quadro 19

33 1). NORs intersticiais foram observadas no gênero Harttia (H. kronei, H. carvalhoi e Harttia sp). A análise de onze exemplares de Sturisoma robustum (cinco fêmeas, seis machos) revelou a presença de 2n=66 cromossomos, sendo a fórmula cariotípica 18m+22sm+10st+16a, NF=116 (Figura 7a). A coloração pela prata mostrou marcação de um único par organizador nucleolar, com marcação em todo o braço curto do par de número 21 (Figura 8a). Sturisoma cf. nigrirostrum do rio Araguaia, Mato Grosso, Brasil, é a espécie com maior número diplóide dentro da família (2n= 74 cromossomos (Artoni e Bertollo, 2001) e difere em relação número diplóide de S. robustum. Esta diferença pode ser observada principalmente no número de subtelo-acrocêntrico (36 e 26, respectivamente, conforme Quadro 1), o que nos permite inferir que rearranjos do tipo fissões cêntricas estiveram presentes durante o processo de diversificação das espécies do grupo. Farlowella amazona e H. kronei apresentam o mesmo número diplóide (2n=58) com muitos cromossomos meta e submetacêntricos. Contudo, diferem em relação à constituição cariotípica, especialmente no que se refere ao número de cromossomos st/a (Quadro 1). Para H. loricariformis foram observados dois números diplóides diferentes (Quadro 1), sendo 2n=52 cromossomos para a população do rio Grande (Alves, 2000) e 2n=56 para população do rio Paraíba do Sul (Kavalco et al., 2004). Outros representantes de Loricariinae analisados citogeneticamente apresentam um número grande de cromossomos subteloacrocênticos, Loricaria, Pyxiloricaria, Proloricaria e Rineloricaria (Quadro 1), o oposto de Farlowella e Harttia, que dentro da subfamília são os que apresentam os menores números de subtelo-acrocêntricos (20 e 16, respectivamente). Contudo, as espécies do gênero Sturisoma analisadas citogeneticamente (Sturisoma cf nigrirostrum e S. robustum) apresentam número de cromossomos acrocêntricos intermediários entre Farlowella e Harttia e os demais Loricariinae. Portanto, o gênero Farlowella parece estar mais relacionado cariotipicamente aos gêneros Harttia e Sturissoma dentro da subfamília, indicando estarem mais próximos evolutivamente, constituindo a tribo Hartiini, como proposto por Covain e Fisch-Muller (2007) em estudos morfológicos (Quadro 2). Montoya-Burgos et al. (1998), por meio de dados moleculares, demonstraram que Harttia é grupo irmão para dois clados, sendo o primeiro consistindo de Farlowella e Sturisoma, dois representantes de Harttiini, e o 20

34 segundo incluindo os representantes dos Loricariini. Os dados citogenéticos de número diplóide e de cromossomos subtelo-acrocêntricos corroboram esta proposição, além de inferir que o gênero Loricaria pode estar mais próximo dos representantes de Harttiini do que os demais integrantes da tribo Loricariini. O padrão de banda C (Figura 6b e 6d) em Farlowella amazona mostrou presença de heterocromatina centromérica na maioria dos cromossomos e seis pares marcadores com bandas intersticiais e/ou proximal ao centrômero presentes no braço longo dos pares 11, 12, 20, 23, 26 e proximal ao centrômero e telomérica no braço longo do par 27. O gênero Harttia apresenta um baixo conteúdo de heterocromatina constitutiva, sem regiões de bandas C conspícuas, exceto para o braço longo do quarto par de metacêntrico em H. carvalhoi e na região telomérica do braço longo dos pares 1 e 25 de H. loricariformis. Estes dados comparados com o do presente estudo evidenciam que uma variabilidade estrutural dos cromossomos nestes dois gêneros foi acompanhada pela diversidade do padrão de heterocromatina nestes gêneros. Em relação aos demais gêneros do grupo, estes resultados são consistentes com a proposição de Artoni e Bertollo (2001) e apontam uma grande diversidade em quantidade de heterocromatina entre os Loricaridae. O padrão de bandamento C em Sturisoma robustum revelou a presença de poucos blocos de heterocromatina constitutiva (Figura 8b), com marcação na região pericentromérica de alguns pares cromossômicos e a região da NOR apresentou Banda C positiva. O gênero Loricaria tem sido revisado quanto à classificação taxonômica de algumas espécies inseridas nesse gênero. O número de 112 nomes científicos no grupo foi reduzido para apenas 14 espécies válidas (Fish base, 2008). Assim, as espécies registradas como L. carinata, L. parva, L. prolixa, L. macrodon passaram a ser denominadas de Loricaria cataphracta, Rineloricaria parva, Proloricaria prolixa e Brochiloricaria macrodon, respectivamente. Desta forma, poucas espécies foram estudadas citogeneticamente, com apenas L. cataphracta (Roncati et al. 1999), espécie tipo, única espécie tipo válida analisada do ponto de vista citogenético, com número diplóide definido (2n=64). Além desta, outras 2 espécies não denominadas de Loricarias sp. (Della-Rosa et al., 1980 e Oliveira et al., 1998) tiveram número cromossômico, fórmula cariotípica, marcação AgNOR e padrão de banda C determinados (Quadro 1). Loricaria sp. rio Jari e do rio 21

35 Solimões mostraram número diplóide diferente das demais (2n= 52 e 2n= 62, respectivamente). A análise de oito exemplares da espécie Loricaria sp. (cinco fêmeas, três machos), revelou a presença de 2n=64 cromossomos, fórmula cariotípica 10m+ 12sm+8st+2st+42a, NF= 84 e sem diferenças quanto ao sexo (Figura 9a). A NOR revelou uma marcação intersticial no braço longo do par 11, bem evidente, indicando assim um mecanismo de NOR simples (Figura 10a). O padrão de bandamento C revelou a presença de pouca heterocromatina constitutiva com marcação na região intersticial de um dos maiores cromossomos acrocêntricos (Figura 10b), coincidente com a região da NOR e pericentromérica de alguns cromossomos. Loricaria sp. do rio Paraná, PR, e do córrego do Onça, MS, apresentaram mesmo número diplóide, mas com fórmulas cariotípicas diferentes, mostrando um grande número de cromossomos acrocêntricos (Quadro 1). Números de cromossomos subtelo-acrocêntricos altos também podem ser observados entre as espécies dos gêneros Pyxiloricaria, Proloricaria, Rineloricaria. Dadas estas características, estes parecem constituir grupos derivados dentro da subfamília. A análise de todas as espécies de Loricariidae cariotipadas até o presente revela uma predominância de cromossomos do tipo acrocêntricos e número diplóide alto, comum na referida família, principalmente nas espécies do gênero Hypostomus, o gênero de maior variação em número diplóide (Alves, 2005). Outro aspecto na família é o número diplóide inversamente proporcional ao número de cromossomos metacêntricos (Artoni e Bertollo, 2001). A condição cariotípica de número diplóide alto é considerada derivada nos representantes da ordem Siluriformes, sendo então o gênero Hypostomus o mais derivado em termos cariotípicos na família Loricariidae, seguido de Loricariinae (Oliveira e Gosztonyi, 2000). Para a família, observou-se, ainda, a presença de cromossomos supranumerários em Microlepdogaster leucofrenatus (Andreata et al., 1993), polimorfismos cromossômicos numéricos em Rineloricaria latirostris (Giuliano- Caetano, 1998) e presença de sistemas de determinação de sexo em Microlepdogaster leucofrenatus (Andreata et al., 1993), Hypostomus sp. (Artoni et al., 1998) e Harttia carvalhoi (Centofanti et al., 2006). 22

36 A análise de Pyxiloricaria menezesi (oito fêmeas e quatro machos) revelou a presença de 2n=68 cromossomos, fórmula cariotípica com 8m+6sm+4st+50a, NF=86 e não houve diferenças quanto ao sexo (Figura 11a). Em relação à subfamília, esta espécie mostrou alto número diplóide e de cromossomos subtelo-acrocêntricos, portanto, mais próxima dos gêneros Loricaria, Proloricaria e Rineloricaria. Schaefer (1987) e de Pinna (1998) têm considerado a subfamília Loricariinae um grupo monofilético bem definido e grupo-irmão das subfamílias Ancistrinae e Hypostominae. Pyxiloricaria é um gênero monotípico (P. menezesi) e, na família, esta espécie é mais semelhante aos Hypostominae, em especial ao gênero Hypostomus, por apresentar alto número de cromossomos subtelo-acrocêntricos, bem como de número diplóide. Entre os espécimes de Hypostomus analisados o número diplóide tem variado entre 52 a 80 cromossomos e com variação de 26 a 62 de cromossomos do tipo subtelo-acrocêntricos (Artoni e Bertollo, 2001). Em Pyxiloricaria, o bandamento C mostrou marcações centroméricas e pericentroméricas na maioria dos cromossomos e no braço curto do par de número 9, sendo este também marcado pela prata (NOR banda C positiva) (Figura 12a e 12b, respectivamente). Estes dados mostram uma quantidade de heterocromatina semelhante ao observado em Farlowella analisada no presente trabalho, bem como na maioria das espécies da subfamília. A região organizadora do nucléolo (NOR) em Pyxiloricaria menezesi mostrou marcação na região terminal do braço curto do par número nove (Figura 12a), coincidente com a contrição observada na análise de Giemsa deste par (Figura 11a). Portanto, um sistema de NOR simples localizado na região terminal do braço curto, como observado para a maioria das espécies da família. Segundo Artoni (2001), esta é uma característica plesiomórfica entre os Loricarideos. Pyxiloricaria e Loricaria apresentaram NOR simples, mas em Pyxiloricaria esta se apresentou terminal e para Loricaria esta foi intersticial. Deve ser ressaltada a semelhança entre os cariótipos de ambas as espécies, inclusive apresentando mesmo NF, demonstrando assim serem próximas evolutivamente. A maioria das espécies de Loricariinae analisados citogeneticamente até o momento apresentou NOR simples na região terminal, mas NORs múltiplas já foram encontradas para Rineloricaria pentamaculata (Errero-Porto, 2007) e NORs simples e intersticiais foram encontradas em Harttia carvalhoi (Centofante et al., 23

37 2006). No presente estudo foram encontradas NORs interesticiais e múltiplas no gênero Farlowella (Quadro 1). O gênero Farlowella, juntamente com o gênero Harttia, são caracterizados por pouco número de cromossomos acrocêntricos (o menor em Loricariinae), quatro pares somente e grande número de cromossomos meta e submetacêntricos. Estes dados nos permite concluir a respeito de uma condição mais conservada para o cariótipo de Farlowella, o que os aproxima da condição basal dos Loricaridae. A bem da divergência de vários gêneros, a condição basal do cariótipo de Farowella indica que o aumento do 2n e eventos de fissão cêntricas, como proposto por Bertollo e Artoni (2001), devem ter desempenhado um importante papel evolutivo entre os Loricariinae a exemplo do que ocorreu com outros grupos de Loricaridae. Uma possível estrutura cariotípica basal de Loricariidae tem sido sugerida por Artoni e Bertollo (2001), analisando exemplares de Hypostomini, Ancistrinae, Loricariinae e Hypoptopomatinae e por (Alves et al. (2003), pela análise de exemplares de Neoplecostominae, propõem que o cariótipo seria composto por 2n=54 cromossomos, com NORs simples em posição subterminal e intersticial, respectivamente, como sendo condição plesiomórfica para a família. Portanto, a subfamília Loricariinae tem mostrado grande diversidade de fórmula cariotípica caracterizando grupos de espécies de acordo com número de cromossomos meta-submetacêntricos: a) aqueles com o maior destes cromossomos (Farlowella e Harttia), b) outros nos quais estes tipos cromossômicos são menores (Pyxiloricaria, Loricaria, Proloricaria, Rineloricaria e Brochiloricaria), e c) aqueles com semelhança entre os cromossomos metasubmetacêntricos e subtelo-acrocêntricos (Loricariichthys e Sturuisoma). Estes dados, associados às diferenças de número diplóide, indicam tendências evolutivas diferentes dentro desta subfamília e comprovam os dados do dendograma proposto por Covain e Fish-Muller (2007), onde o primeiro grupo são os mais basais, pertencentes à tribo Hartiini, e os dois últimos pertencentes à tribo Loricariini, os quais são subdivididos em subgrupos morfológicos (Loricarichthys, Rineloricaria, Loricaria e Pseudohemiodon). No dendograma, os Loricariichthys são os mais basais dentro da tribo e, portanto, intermediários entre Hartiini e Loricariini, indicando uma congruência entre os dados morfológicos e citogenéticos (Quadro 2). 24

38 Alves (2005) resume que, possivelmente, podem ocorrer três tendências evolutivas para o cariótipo basal de Loricariidae: uma levaria à manutenção das condições basais, ou seja, 2n=54 cromossomos e Ag-NORs intersticiais (em Neoplecostominae e Hypoptomatinae). Outra tendência levaria ao aumento do número diplóide, seguido por um grande acréscimo de cromossomos acrocêntricos, levando à evolução cariotípica por fissões cêntricas (Hypostominae e Loricariinae), e finalmente, uma terceira tendência, que consideraria a diminuição no número diplóide, com predominância de cromossomos meta e submetacêntricos, sugerindo eventos de fusões cêntricas (também em Hypostominae e Loricariinae). Com base nisso, durante sua evolução cariotípica dos gêneros das subfamilia Loricariinae, os principais rearranjos foram os de fusão e fissão. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que Pyxiloricaria, assim como Loricaria parecem constituir grupos derivados, pois apresentam número diplóide alto e grande número de cromossomos acrocêntricos. A análise pela técnica do fluorocromo cromomicina CMA 3 foi realizada para as três espécies analisadas: Sturisoma robustum, Loricaria sp. e Pyxiloricaria menezes. Mostrou marcação coincidente com a região da NOR, indicando ser esta região rica em bases CG (Figura 8c, 10c, 12c respectivamente), enquanto os demais blocos de banda C não mostraram marcação fluorescente, o que indica uma constituição de bases diferentes entre a heterocromatina da região organizadora do nucléolo e os de outras localidades. Em peixes NOR, CMA 3 e banda C positiva tem sido comum, com a maioria mostrando esta diferença na composição de bases da banda C. Contudo isto não tem sido uma regra geral (Artoni et al., 1996). Estudos cariotípicos nos gênero Farlowella e Pyxiloricaria ainda não haviam sido realizados até o presente trabalho e ainda são escassos os estudos nos gêneros Loricaria e Sturisoma. No Pantanal, bioma de importância indiscutível, onde os peixes desempenham papel fundamental no equilíbrio ecológico do bioma, só há o relato de um trabalho na subfamília Loricariinae, enfocando estudos citogenéticos, referente ao gênero Sturisoma da população do rio Araguaia, estado de Mato Grosso. 25

39 Quadro 1 - Sumário, modificada de Alves (2005) da Subfamília Loricariinae. 2N = número, diplóide; m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; st = subtelocêntrico; a = acrocêntrico, NF = número fundamental, NOR = Região organizadora do nucléolo, (NF # = M/SM= dois braços; ST/A = um braço) 26 ESPÉCIES LOCALIDADE 2N FÓRMULA CARIOTÍPICA NF # NOR BANDA C REFERÊNCIAS Brochiloricaria macrodon* m+2sm+38ª,t 78 Michele, et al. (1977) Farlowella amazona Córrego do Ribeirão, MS, Brasil 58 16m, 26sm, 8st, 8ª 90 2 C-CMA3 Presente trabalho Harttia carvalhoi Rio Paraíba do Sul, SP, Brasil 52 18m,18sm,8st, 8a 88 1 C Centofante et al m, 18sm, 8st, 8a 90 H. kronei Rio Betari, SP, Brasil 58 40m/sm, 18st/a Alves et al. (2003) H. loricariformis Rio Grande, SP, Brasil 52 32m/sm, 20st/a 84 - Alves et al. (2003) H. loricariformis Rio Paraitinga, SP, Brasil 56 16m, 22sm, 10 st, 8a 94 - Kavalco et al. (2005) Harttia sp. Rio Itabapoana, MG, Brasil 56 14sm, 42ª 70 Carneiro et al. (1998) Loricaria cataphracta** Rio Paraná, Argentina Roncati et al. (1999) Loricaria sp. Rio Par aná, PR, Brasil 64 10m, 6sm, 4st, 44ª 80 1 C Scavone e Júlio Jr. (1995) Loricaria sp. Rio Solimões, AM, Brasil Della-Rosa et al. (1980) Loricaria sp. Rio Jari, PA, Brasil C Oliveira et al. (1998) Loricaria sp. Córrego da Onça, MS, Brasil 64 12m, 8sm, 2st, 42ª 84 1 C-CMA3 Presente trabalho Loricariichthys sp. Rio Paraná, Argentina 54 6m, 26sm, 4st, 18ª 86 1 C Fenocchio (1993) Loricariichthys sp. Rio Itabapoana, MG, Brasil 54 28m, 26ª 82 1 Carneiro et al. (1998) L. platymetopom Rio Paraná, PR, Braszil 54 6m, 20sm, 4st, 24a 80 1 C Scavone e Júlio Jr. (1995) 7m, 20sm, 4st, 23a 81 1 C L. platymetopom Rio Paraná, Posadas, Argentina Roncati et al. (1999) L. maculata Rio Paraná, Posadas, Argentina Roncati et al. (1999)

40 Quadro 1, Cont... Pyxiloricaria menezesi Córrego da Onça, MS, Brasil 68 8m, 6sm, 4st, 50ª 82 1 C-CMA3 Presente trabalho Proloricaria prolixa*** Rio Paraná, PR, Brasil 62 20m, 4sm, 38ª 86 1 C Scavone e Júlio Jr. (1995) Rineloricaria. Cadeae Rio Guaíba, RS, Brasil 66 2m, 64 st /a 68 1 Alves et al. (2003) R. kronei Rio Itapocu, SC, Brasil 64 6m/sm, 58st/a 70 1 Alves et al. (2003) 27 R. latirostris Rio Mogi-Guaçu, SP, Brasil m/sm,12st/a - 1 C, CMA3, DAPI Giuliano-Caetano (1998) 20m/sm, 20st/a R. latirostris Rio Três Bocas, PR, Brasil m,sm, 36st/a - 1 C, CMA3, DAPI Giuliano-Caetano (1998) R. latirostris Rio Passa-Cinco, SP, Brasil m/sm, 28st,a - 1 C, CMA3, DAPI Giuliano-Caetano (1998) 13m/sm, 34st,a Rineloricaria parva**** Gyldenholm e Schell (1971) R. pentamaculata Rio Keller, PR, Brasil 56 8m/sm, 48st/a 64 1 C, Giuliano-Caetano (1998); R. pentamaculata Rio Keller, PR Brasil, Rio Tatupeba, PR, Brasil Rio Tauá, PR, Brasil m/sm+48st/a 8m/sm+48st/a 8m/sm+48st/a 9m/sm+47st/a C, CMA3 C, CMA3 C, CMA3 C, CMA3 Errero-Porto (2007) Rineloricaria n. sp. Rio Betari, SP, Brasil 70 2sm, 68ª 1 - Alves et al. (2003) Rineloricaria n. sp. Rio vermelho 50 10m,6sm,2st,32a Alves (2005) Sturisoma cf. nigrirostrum Rio Araguaia, MG, Brasil 74 20m, 18sm, 36st/ a - - Artoni e Bertollo (2001) Sturisoma robustum Córrego da Onça, MS, Brasil 66 18m, 22sm,10st,16a C-CMA3 Presente trabalho * Citação Loricaria macrodon ** Citação Loricaria carinata *** Citação Loricaria prolixa **** Citação Loricaria parva

41 Quadro 2 - Dendograma, construído por Covain e Fisch-Muller (2007), por meio da matriz de distância morfológica para o grupo Loricariinae 28

42 Figura 5 - Cariótipo de Farlowella amazona submetido à coloração com Giemsa. Figura 6 - A) Metáfase somática, indicando as regiões organizadoras do nucléolo, com impregnação pelo nitrato de prata - AgNOR; B) Metáfase completa indicando os blocos de heterocromatina constitutiva pela técnica de banda C; C) Cromossomos marcados pelo nitrato de prata, indicando a região organizadora do nucléolo; D) Pares de cromossomos mostrando os blocos heterocromáticos. 29

43 Figura 7 - Cariótipo de Sturisoma robustum submetido à coloração com Giemsa. Figura 8 - Metáfase somática de Sturisoma robustum, em a) Regiões organizadoras do nucléolo, com impregnação pelo nitrato de prata - AgNOR; b) Banda C e c) Coloração de CMA 3. 30