Análise de dados longitudinais em experimentação animal. Longitudinal data analysis in animal experiments

DOI: 10.5433/1679-0359.2012v33n4p1565 Análise de dados longitudinais em experimentação animal Longitudinal data analysis in animal experiments Andressa Amorim Cestari 1* ; Silvano Cesar da Costa 2 ; Alessandro Pelegrine Minho 3 Resumo A análise de dados longitunais com medidas repetidas ao longo do tempo pode ser feita de diferentes maneiras: em experimentos usando o delineamento em parcelas subdivididas, tendo o animal como parcela e o tempo como subparcela; através da análise de modelos multivariados; e ainda através do ajuste de modelos mistos, que possibilita a utilização de diferentes estruturas para a matriz de covariâncias. O principal problema envolvido na análise de medidas repetidas ao longo do tempo está relacionado à ausência de aleatorização, pois pares de mensurações feitas no tempo estão correlacionadas, o que pode invalidar os testes envolvendo o fator tempo. Para discutir as diferentes formas de análise, foram utilizados dados provenientes de um experimento em que cordeiros Santa Inês foram infectados com 6.000 L3 de Haemochus contortus e tratados com tanino condensado. A fonte do tanino foi o extrato de acácia proveniente da Acacia mearnsii (produto comercial). Os dados foram analisados através do software livre R 2.11.1 (2010). Não foi encontrado efeito significativo (p > 0,05) da suplementação com extrato de acácia sobre o peso vivo dos animais. As metodologias utilizadas para a análise dos dados apresentaram resultados semelhantes, o que nem sempre ocorre. E, considerando a dependência das observações obtidas ao longo do tempo, recomenda-se o ajuste de modelos mistos, que podem envolver curvas de crescimento ou modelos polinomiais que incluam a matriz de covariâncias que melhor explique o comportamento dos dados. Palavras-chave: Medidas repetidas, ovinos, taninos Abstract Longitudinal data analysis with repeated measures over time can be done in different ways: in experiments using the split plot design, with the animal as plots and time as subplots; through the analysis of multivariate models; and also by adjusting mixed models, which enables the use of different structures for the covariance matrix. The main problem involved in the analysis of repeated measures over time is related to the lack of randomization, because pairs of measurements taken along the time are correlated, which can invalidate the tests involving the time factor. To discuss the different forms of analysis, data were used from an experiment in which Santa Ines lambs were infected with 6,000 L3 Haemochus contortus and treated with condensed tannin. The source of tannin was the acacia extract obtained from Acacia mearnsii (commercially available). The data were analyzed using the software R 2.11.1 (2010). No significant effect was found (p > 0.05) of supplementation with tannin, acting on the body weight of animals. The methods used for data analysis showed similar results, which does not always occur. And considering the dependence of observations taken over time, recommended the setting of mixed models, which may involve growth curves or polynomial models that include the covariance matrix that best explains the data. Key words: Repeated measures, sheep, tannin 1 Doutoranda Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Estadual de Londrina, UEL, Londrina, PR. E-mail: awandressa@yahoo.com.br 2 Prof. Dr. do Dept o de Estatística, UEL, Londrina, PR. E-mail: silvano@uel.br 3 Pesquisador Dr. Embrapa Pecuária Sul, CPPSUL, Bagé, RS. E-mail: alessandro.minho@cppsul.embrapa.br * Autor para correspondência Recebido para publicação 07/04/11 Aprovado em 13/06/12 1565

1566 Introdução Experimentos com planejamentos longitudinais são bastante comuns na prática, sendo utilizados por pequisadores de diversas áreas. O termo medidas repetidas, segundo Crowder e Hand (1990), é usado para designar medidas feitas na mesma variável ou mesma unidade experimental em mais de uma ocasião. Segundo Davidian (2005), as questões de interesse científico geralmente envolvem não somente perguntas usuais sobre como a média das respostas obtidas diferem entre os tratamentos, mas também como a mudança na resposta média ao longo do tempo difere, incluindo relações entre a resposta e o tempo. Sendo assim, é necessário representar esta situação em modelos estatísticos que validem o modo com que os dados foram coletados. Complementando os modelos, métodos especializados para a análise são necessários. Na experimentação animal, os trabalhos que envolvem medidas repetidas têm sido utilizados especialmente na nutrição animal, podendo ser tratados como experimentos em esquema fatorial, com tratamento e época como dois fatores (ALEXANDRE et al., 2005). Uma outra forma de analisar dados coletados em medidas repetidas ao longo do tempo seria a utilização do delineamento em parcelas subdivididas. No entanto, de acordo com Xavier (2000) este tipo de análise pode não ser válido devido à ausência de aleatorização, pois pares de mensurações no tempo são correlacionados, o que pode invalidar os testes envolvendo o fator tempo. Ainda, a análise de dados de medidas repetidas vem utilizando a metodologia de modelos mistos que possibilita a utilização de diferentes estruturas para a matriz de covariâncias, uma vez que se torna possível modelar a verdadeira estrutura de correlação do fator tempo, permitindo uma análise mais eficiente (XAVIER, 2000; MALHEIROS, 1999). A análise pode ser feita tanto através de um modelo univariado, que impõe uma restrição rigorosa para a matriz de covariâncias, como por Cestari, A. A.; Costa, S. C. da; Minho, A. P. meio de um modelo multivariado, que adota uma matriz de covariâncias sem restrições, ou seja, a matriz é sem estrutura (XAVIER, 2000). Para a exemplificação prática e discussão da metodologia de análise estatística neste trabalho, foram obtidos dados provenientes de um experimento que teve como objetivo avaliar a eficácia do tanino condensado, presente no extrato de acácia, no controle de Haemoncus contortus em ovinos. Segundo Minho et al. (2010), com o aumento dos relatos de resistência de helmintos aos antihelmínticos químicos convencionais, alguns metabólitos secundários de plantas têm sido testados e avaliados para a verificação do seu potencial no controle de nematóides gastrointestinais em ruminantes, entre eles o tanino. Alguns estudos recentes já identificaram efeitos antihelmínticos de diferentes substâncias bioativas (GITHIORI; ATHANASIADOU; THAMSBORG, 2006), particularmente em taninos concentrados (MINHO et al., 2008a; 2008b). Niezen et al. (1995) encontraram redução na contagem do número de ovos por grama de fezes (OPG) em ovinos alimentados com plantas ricas em taninos. O mesmo foi relatado por Niezen et al. (1998) em ovinos mantidos em pastagens com níveis médios de taninos condensados. Os animais mostraram-se mais resilientes ao parasitismo quando comparados àqueles manejados em pastagem com ausência de taninos condensados. A partir dos dados coletados, o presente trabalho teve como objetivo discutir a análise de dados longitudinais em experimentação animal, evidenciando o ganho para o pesquisador na qualidade dos resultados obtidos. Material e Métodos O experimento foi conduzido na Estação Experimental Raul Juliatto do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), em Ibiporã. Foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA)

Análise de dados longitudinais em experimentação animal da Universidade de São Paulo (USP), Brasil, número 001/2007. Foram utilizados dezoito cordeiros Santa Inês com quatro meses de idade, alocados em três grupos. Inicialmente, todos os animais receberam drogas antihelmínticas, por dois dias consecutivos, a fim de garantir o estado de livres de infecção por nematóides gastrintestinais. O experimento avaliou o efeito do tanino sobre o ganho de peso, o número de ovos por grama de fezes (OPG), a carga parasitária, o número de larvas L3 e L1 por grama de fezes e o hematócrito dos ovinos. O teste de viabilidade dos ovos foi conduzido de acordo com as recomendações da World Association for the Advanced of Veterinary Parasitology (WAAVP), como descrito por Coles et al. (1992). Entretanto, para a discussão da metodologia de análise estatística, serão utilizados somente os dados de ganho de peso. A fonte do tanino foi o extrato de acácia (AE) proveniente da Acacia mearnsii (disponível comercialmente) e os valores do tanino condensado (TC) foram determinados de acordo com o método do HCl-Butanol (PORTER; HRSTICH; CHAN, 1985). O extrato de acácia continha 15% do TC. O total de TC oferecido aos animais atingiu cerca de 7,2 g por animal/dia, considerando valores estimados para um animal com 30 kg de peso vivo (PV). Nenhuma sobra da ração concentrada foi encontrada após 24 horas durante o período experimental. Uma combinação de fosfato de levamizol (20 mg.kg -1 ) e albendazol (20 mg.kg -1 ) foi administrada para confirmar a ausência de infecção prévia. Uma semana após o tratamento com o antihelmíntico, doze animais foram experimentalmente infectados com 6.000 L3 de H. contortus e seis foram mantidos como o grupo controle não infectado ou controle negativo. Grupo 1 (G1) era o controle positivo, infectado, porém não tratado; grupo 2 (G2), o grupo infectado e submetido ao tratamento com tanino condensado; e o grupo 3 (G3), o controle negativo, grupo não infectado. Os três grupos foram mantidos em instalações fechadas, onde recebiam feno e ração concentrada (dieta com 13% de proteína bruta), além de água e sal mineral ad libitum. Trinta dias após a infecção, o G2 foi suplementado com o extrato de acácia (1,6 g/kg PV/ dia), adicionado ao concentrado, durante 10 dias. A mesma quantidade (1,6 g/kg PV/dia) de melaço em pó (MP) foi adicionada ao extrato de acácia para melhorar a palatabilidade da dieta. Os animais do G1 foram suplementados apenas com MP na mesma dose do G2. O experimento teve duração total de 48 dias, porém neste trabalho foram considerados os dados até o 41 o dia, quando foi encerrado o tratamento com tanino. Os animais foram pesados nos dias 0, 14, 28, 35 e 41; ou seja, três vezes antes do início do tratamento e duas vezes após o início do tratamento. Os dias das pesagens serão designados como D0, D14, D28, D35 e D41. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com medidas repetidas ao longo do tempo. Os dados foram analisados através do software livre R 2.11.1 (2010). Resultados e Discussão Na Tabela 1 são apresentadas as médias (± desvio padrão) dos valores obtidos para o peso vivo dos animais, por grupo, nos dias 0; 14; 28; 35 e 41. Em uma análise inicial exploratória dos dados foi possível observar que o peso corporal dos ovinos sofreu aumento ao longo do tempo (Figura 1). Também se pode observar que o peso inicial dos animais no experimento é bastante variável entre os grupos. O comportamento quanto ao peso se manteve, entretanto, o perfil médio do G2, com menor peso médio no início do experimento (D0), foi aquele que apresentou maior peso médio ao final do experimento (D41) (Figura 2). 1567

(G2), controle positivo, infectado e não tratado (G1) e grupo não infectado (G3). Tempo Cestari, (Dias) A. A.; Costa, G1 S. C. da; Minho, G2 A. P. G3 0 26,43 ± 5,75 25,82 ± 7,29 26,02 ± 9,09 Tabela 1. Médias ± desvio padrão do peso vivo, por grupo, de ovinos experimentalmente infectados com 6.000 L3 de H. contortus. Grupo tratado com extrato 14 de acácia 28,83 (G2), controle ± 5,87 positivo, 29,00 ± infectado 7,82 27,28 e não ± tratado 9,11 (G1) e grupo não infectado (G3). 28 29,55 ± 6,16 30,05 ± 7,83 28,13 ± 9,31 Tempo (Dias) 35 G1 30,65 ± 5,28 30,48 G2± 8,55 29,22 ± 9,65 G3 0 26,43 ± 5,75 25,82 ± 7,29 26,02 ± 9,09 41 31,05 ± 5,41 31,95 ± 7,59 30,33 ± 9,54 14 28,83 ± 5,87 29,00 ± 7,82 27,28 ± 9,11 28 Fonte: Elaboração 29,55 ± 6,16 dos autores. 30,05 ± 7,83 28,13 ± 9,31 35 30,65 ± 5,28 30,48 ± 8,55 29,22 ± 9,65 41 O comportamento quanto 31,05 ao ± 5,41 peso se manteve, 31,95 entretanto, ± 7,59o perfil médio 30,33 do G2, ± 9,54 com menor peso Fonte: médio Elaboração no início dos autores. do experimento (D0), foi aquele que apresentou maior peso médio ao final do experimento (D41) (Figura 2). Figura 1. Perfis individuais do peso vivo dos cordeiros, durante o período experimental. Figura 1: Perfis individuais do peso vivo dos cordeiros, durante o período experimental. 1568

Análise de dados longitudinais em experimentação animal Figura 2. Peso vivo médio de cordeiros experimentalmente infectados com 6.000 L3 de H. contortus nos cinco Figura tempos avaliados. 2. Peso vivo Grupo médio tratado de com cordeiros extrato experimentalmente de acácia (G2), controle infectados positivo, com infectado 6.000 e não L3 tratado de H. (G1) contortus e grupo nos cinco não infectado tempos (G3). avaliados. Grupo tratado com extrato de acácia (G2), controle positivo, infectado e não tratado (G1) e grupo não infectado (G3). Inicialmente, a análise da variável peso foi feita considerando um delineamento em parcelas subdivididas, tendo o animal como parcela e o tempo como subparcela. Inicialmente, A análise a de análise variância da mostrou variável não peso haver foi diferença Foi significativa realizado o entre desdobramento os grupos não da tratados interação e o feita considerando um delineamento em parcelas Grupos*Dias, estudando-se o efeito de grupos grupo que recebeu suplementação com o tanino condensado (p-valor=0,9538). No entanto, foi encontrada subdivididas, tendo o animal como parcela e o dentro de dias e não houve diferença significativa, diferença tempo como no peso subparcela. dos animais entre os Dias avaliados ou (p-valor=0,00001) seja, não existe diferença e na interação no peso entre corporal os Grupos entre e Dias (p-valor=0,010027) (Tabela 2). os grupos de animais G1, G2 e G3 nos diferentes A análise de variância mostrou não haver dias avaliados. Já no estudo dos dias dentro de diferença significativa entre os grupos não tratados cada grupo foi observada diferença significativa e o grupo que Tabela recebeu 2. Análise suplementação de variância com no o delineamento tanino de parcelas subdivididas. (p<0,01). Portanto, existe diferença no peso obtido condensado (p-valor=0,9538). GL No entanto, SQ foi QM Fc Pr(>Fc) entre pelo menos dois dias dentro dos grupos G1, encontrada diferença no peso dos animais entre os Grupos 2 28,45267 14,226333 G2 e G3 (Tabela 0,047441 3). 0,953809 Dias avaliados (p-valor=0,00001) e na interação entre os Grupos Resíduo e Dias (A) (p-valor=0,010027) 15 4.498,10333 (Tabela 299,873556 A partir deste resultado, foi realizado o ajuste 2). Dias 4 263,36289 65,840722 dos modelos 140,252426 de regressão para < 0,00001 os grupos *** estudados. Grupos*Dias 8 10,59844 A variável Dias apresentou efeito linear 1,324806 2,822071 0,010027 *** ao longo do experimento dentro do G1 (Tabela 4). Resíduo (B) 60 28,16667 0,469444 Total 89 4.828,68400 Foi realizado o desdobramento da interação Grupos*Dias, estudando-se o efeito de grupos dentro 1569 de dias e não houve diferença significativa, ou seja, não existe diferença no peso corporal entre os grupos de animais G1, G2 e G3 nos diferentes dias avaliados. Já no estudo dos dias dentro de cada grupo foi observada

Cestari, A. A.; Costa, S. C. da; Minho, A. P. Tabela 2. Análise de variância no delineamento de parcelas subdivididas. GL SQ QM Fc Pr(>Fc) Grupos 2 28,45267 14,226333 0,047441 0,953809 Resíduo (A) 15 4.498,10333 299,873556 Dias 4 263,36289 65,840722 140,252426 < 0,00001 *** Grupos*Dias 8 10,59844 1,324806 2,822071 0,010027 *** Resíduo (B) 60 28,16667 0,469444 Total 89 4.828,68400 Tabela 3. Desdobramento da interação: estudo dos Dias dentro de cada Grupo. GL SQ QM F calc Pr(>Fc) Grupos 2 28,45267 14,226333 0,047441 0,953809 Resíduo (A) 15 4.498,10333 299,873556 Dias : Grupo 1 4 80,29800 20,074500 42,762289 < 0,00001 Dias : Grupo 2 4 126,48533 31,621333 67,359117 < 0,00001 Dias : Grupo 3 4 67,17800 16,794500 35,775300 < 0,00001 Resíduo (B) 60 28,16667 0,469444 Total 107 5.892,22963 Tabela 4. Análise de Regressão dos Dias dentro do Grupo 1. Efeitos GL SQ QM F calc p-valor Efeito Linear 1 77,25277 77,25277 164,56 < 0,00001 Desvios de Regressão 3 3,04523 1,01508 2,16 0,10182 Resíduos 60 28,16667 0,46944 Tabela 5. Estimativas do modelo de regressão linear dentro do Grupo 1. Parâmetros Estimativa Erro padrão t calc p-valor ˆβ 26,7514530 0,23499 113,84071 < 0,00001 0 1 ˆβ 0,1081305 0,00843 12,82818 < 0,00001 R 2 = 0,9621 1570

Análise de dados longitudinais em experimentação animal Modelo linear definido para o Grupo 1: ŷ = 26,75 + 0,1981 d Tabela 6. Análise de regressão dos Dias dentro do Grupo 2. Efeitos GL SQ QM F calc p-valor Efeito Linear 1 119,32466 119,32466 254,18 < 0,00001 Efeito Quadrático 1 1,85247 1,85247 3,95 0,05155 Efeito Cúbico 1 5,02242 5,02242 10,7 0,00178 Desvios de Regressão 1 0,28578 0,28578 0,61 0,43832 Resíduos 60 28,16667 0,46944 Houve efeito significativo linear e cúbico (p<0,05), portanto, foi ajustado o modelo polinomial de maior grau (Tabela 7). Tabela 7. Estimativas do modelo de regressão cúbica dentro do G2. Parâmetros Estimativas Erro padrão t calc p-valor ˆβ 0 25,80810508 0,27950 92,33664 < 0,00001 1 ˆβ 0,40501523 0,07158 5,65856 < 0,00001 ˆβ 2-0,01562030 0,00438-3,56340 0,00073 ˆβ 3 0,00022835 0,00007 3,27088 0,00178 R 2 = 0,9977 Modelo cúbico definido para o G2: ŷ = 25,81 + 0,4050 d 0,0156 d 2 + 0,00023 d 3 Tabela 8. Análise de regressão dos dias dentro do Grupo 3. Efeitos GL SQ QM F calc p-valor Efeito Linear 1 64,43033 64,43033 137,25 < 0,00001 Desvios de Regressão 3 2,74767 0,91589 1,95 0,13103 Resíduos 60 28,16667 0,46944 1571

Cestari, A. A.; Costa, S. C. da; Minho, A. P. O efeito linear foi significativo (p<0,05), portanto foi estimado o modelo linear. Tabela 9. Estimativas do modelo de regressão linear dentro do Grupo 3. Parâmetros Estimativas Erro padrão t calc p-valor ˆβ 25,86617024 0,23499 110,07339 < 0,00001 0 1 ˆβ 0,09874985 0,00843 11,71529 < 0,00001 R 2 = 0,9591 Modelo linear definido para o G3: ŷ = 25,87 + 0,0987 d O principal problema envolvido na análise de dados longitudinais adotando o delineamento em parcelas subdivididas está ligado à dependência das medidas obtidas ao longo do tempo. Por exemplo, o peso obtido no D41 está relacionado ao peso obtido no D35, como é possível perceber com o estudo das correlações entre os tempos (dias) avaliados que, neste trabalho, mostrou valores superiores a 0,9 (Tabela 10); o que indica forte correlação. Tabela 10. Correlação observada entre tempos (dias) em que foram obtidos os pesos dos animais. Tempos (Dias) Tempos (Dias) 0 14 28 35 41 0 1,0000 0,9890 0,9854 0,9879 0,9804 14 0,9890 1,0000 0,9967 0,9934 0,9869 28 0,9854 0,9967 1,0000 0,9942 0,9933 35 0,9879 0,9934 0,9942 1,0000 0,9930 41 0,9804 0,9869 0,9933 0,9930 1,0000 Segundo Barbosa (2009), é comum admitir-se correlação não nula entre observações feitas em ocasiões distintas e heterogeneidade de variâncias nas diversas ocasiões. A autora afirma ainda que, o uso do delineamento em parcelas subdivididas no tempo, que corresponde a uma análise univariada dos perfis, nem sempre é recomendado, porque pressupõe que a estrutura da matriz de covariância seja do tipo uniforme (variâncias iguais nas diversas ocasiões e covariâncias iguais entre duas ocasiões quaisquer). Quando considerado o modelo multivariado: Y ij = μ + τ i + β j + ε ij em que o vetor aleatório Y ij = [Y ij1, Y ij2,..., Y ijp ] T, refere-se às observações multivariadas, que são p os tempos, em R associado ao i-ésimo nível do tratamento (τ i ) e o j-ésimo efeito de blocos (β j ); µ é o vetor de constantes do modelo linear, dado por: T µ i = [ µ 1, µ 2, L, µ p ]. A matriz das correlações parciais dos resíduos é dada como mostrado na Tabela 11. 1572

Análise de dados longitudinais em experimentação animal Tabela 11. Correlação entre tempos (dias) em que foram obtidos os pesos dos animais, quando considerado o modelo multivariado. Tempos (Dias) Tempos (Dias) 0 14 28 35 41 0 1,0000 0,9910 0,9868 0,9894 0,9805 14 0,9910 1,0000 0,9967 0,9934 0,9880 28 0,9868 0,9967 1,0000 0,9941 0,9940 35 0,9894 0,9934 0,9941 1,0000 0,9937 41 0,9805 0,9880 0,9940 0,9937 1,0000 Assim, como alternativa para a análise de medidas repetidas no tempo, tem-se a análise multivariada. Quando se utiliza esse tipo de análise, as hipóteses de interesse testadas são: a) igualdade do efeito de tratamentos, que corresponde à hipótese de perfis coincidentes; b) igualdade do efeito de tempos, que corresponde à hipótese de perfis constantes; c) não interação entre tempos*tratamentos, que corresponde à hipótese de perfis paralelos. Os testes multivariados de: Lambda de Wilks, Traço de Pillai, Traço de Hotteling-Lawley e Roy são apresentados nas Tabelas 10 e 11. Em geral, a ordem de preferência em termos de poder é Traço de Pillai, Lambda de Wilks, Traço de Lawley- Hotelling e Roy. Entretanto, Lambda de Wilks é o teste mais comumente usado (XAVIER, 2000). Neste caso, a matriz de covariâncias Σ desse modelo é sem estrutura com t(t+1)/2 parâmetros. A matriz de correlações parciais dos resíduos e seus níveis descritivos associados aos testes das correlações parciais é dada por: 1,0000 0,9951 < 0,0001 0,9926 R = < 0,0001 0,9914 < 0,0001 0,9868 0,9951 1,0000 0,9968 0,9937 0,9882 0,9926 0,9968 1,0000 0,9951 0,9940 0,9914 0,9937 0,9951 1,0000 0,9949 0,9868 0,9882 0,9940 0,9949 1,0000 1573

Cestari, A. A.; Costa, S. C. da; Minho, A. P. O teste para o fator Dias, testou a hipótese de perfis horizontais (constantes). Esta hipótese foi rejeitada, indicando que existem diferenças verticais entre as curvas que descrevem os pesos médios dos grupos de animais ao longo do tempo (Tabela 12). Já o teste para a interação Grupo*Dias, testou a hipótese de perfis paralelos, que não foi rejeitada (Tabela 13), embora o teste de Roy tenha sido significativo (p-valor=0,0164). De acordo com Xavier (2000), a análise multivariada pode apresentar menor poder em seus testes e às vezes indicar diferença significativa onde não existem, mas esses riscos podem ser minimizados garantindo a distribuição normal multivariada dos erros. Mauchly (1940) apresentou a estatística de teste para a condição de esfericidade (condição de Huynh e Feldt ou H-F), que verifica se uma população normal multivariada apresenta variâncias iguais e correlações nulas. Caso uma população apresente essa simetria, será chamada de esférica. Tabela 12. Testes multivariados para os fatores intra-indivíduos. Estatística Valor F valor Num GL Den GL Pr > F Lambda de Wilks 0,04032185 71,40 4 12 Traço de Pillai 0,95967815 71,40 4 12 Traço de Hotelling-Lawley 23,80044769 71,40 4 12 Roy 23,80044769 71,40 4 12 Tabela 13. Testes multivariados para os fatores intra-indivíduos. Estatística Valor F valor Num GL Den GL Pr > F Lambda de Wilks 0,32765297 2,24 8 24 0,0604 Traço de Pillai 0,79782995 2,16 8 26 0,0663 Traço de Hotelling-Lawley 1,66903449 2,41 8 15 0,0678 Roy 1,39437789 4,53 4 13 0,0164 1574 No presente trabalho, pelo resultado do Teste de esfericidade (Tabela 14) pode-se verificar que a condição de esfericidade não foi violada, com um nível de significância de 0,0668 (Teste de Mauchly não significativo, com p>0,05). Portanto, a população multivariada apresenta variâncias iguais e correlações nulas. Nesse caso, não se faz necessária a utilização da correção para os graus de liberdade dos fatores intra-indivíduos para o fator Dias e a interação Grupos*Dias. Uma outra desvantagem da análise multivariada segundo Meredith e Stehman (1991), é a falta de poder para estimar os parâmetros da matriz de covariâncias, isto quando t (número de ocasiões medidas ou tempos) é grande e o n é pequeno. Sob a condição de H-F, os testes univariados para o efeito intra-indivíduos são usualmente mais poderosos que os testes multivariados, proporcionando uma maior probabilidade de detectar efeitos significativos, quando esses realmente existem. Os testes sobre as tendências lineares (Tabela 15) mostram que o comportamento dos perfis médios pode ser explicado por um polinômio de 3º grau (p-valor = 0,0185).

Análise de dados longitudinais em experimentação animal Tabela 14. Teste de esfericidade de Mauchly. Teste para a Esfericidade: Critério de Mauchly = 0,3033527 Aproximação Qui-quadrado: 16,004195 Graus de liberdade: 9 Probabilidade > Qui-quadrado = 0,0668 Tabela 15. Testes sobre as tendências lineares. Contraste: linear Causa de variação GL S.Q. Q.M. F valor Pr > F Dias 1 250,1602222 250,1602222 252,65 <,0001 Grupo*Dias 2 3,5314444 1,7657222 1,78 0,2019 Resíduo 15 14,8523333 0,9901556 Contraste: quadrático Causa de variação GL S.Q. Q.M. F valor Pr > F Dias 1 8,54349206 8,54349206 19,93 0,0005 Grupo*Dias 2 4,09388889 2,04694444 4,77 0,0249 Resíduo 15 6,43119048 0,42874603 Contraste: cúbico Causa de variação GL S.Q. Q.M. F valor Pr > F Dias 1 4,23200000 4,23200000 17,94 0,0007 Grupo*Dias 2 2,48633333 1,24316667 5,27 0,0185 Resíduo 15 3,53766667 0,23584444 Contraste: quadrático Causa de variação GL S.Q. Q.M. F valor Pr > F Dias 1 0,42717460 0,42717460 1,92 0,1866 Grupo*Dias 2 0,48677778 0,24338889 1,09 0,3610 Resíduo 15 3,34547619 0,22303175 Uma terceira forma possível para analisar dados longitudinais, seria o ajuste de modelos mistos. Everitt (2005) destacou a importância do uso desses modelos na análise de dados com medidas repetidas. Os modelos mistos englobam a análise de curvas de crescimento ou curvas polinomiais, que levam em conta a matriz de covariâncias que melhor explica o comportamento das observações (VON ENDE, 1993; LITTELL; HENRY; AMMERMAN, 1998). Neste caso, como uma das formas para verificar se a condição Huynn-Feldt, relativa à esfericidade, é satisfeita, ajusta-se o modelo usando-se as estruturas de variâncias-covariâncias não estruturadas (UN) e de Huynh-Feldt, obtendo-se os valores de 2 log-verossimilhança. Então, tem-se que χ 2 = 292,92 254,3 = 38,62 ; com gl = 20 6 = 14 graus de liberdade e um nível de significância de 0,0089. Rejeita-se, portanto, a hipótese de esfericidade. Embora, uma das vantagens de modelos mistos é que não se tem que assumir esfericidade ou simetria composta no modelo. Na análise de modelos mistos, dentre as várias estruturas de matrizes de variâncias e co-variâncias, tem-se o componente simétrico (CS), auto regressivo de primeira ordem (AR1) e não estruturada (UN). 1575

Cestari, A. A.; Costa, S. C. da; Minho, A. P. Os testes obtidos através das duas estruturas de covariâncias apresentaram os mesmos resultados (Tabela 16), indicando que existe diferença entre os Dias e a interação Grupo*Dias, mas não há efeito de Grupo, isto é, não existe diferença significativa entre o grupo tratado com tanino e os controles positivo e negativo (p>0,05). Tabela 16. Testes para os efeitos fixos dos modelos com estruturas para a matriz de covariâncias do tipo Huynh-Feldt e sem estrutura (UN). Matriz de covariâncias Huynh-Feldt Efeito GL numerador GL denominador F valor Pr > F Grupo 2 15 0,04 0,9646 Dias 4 60 140,25 Grupo*Dias 8 60 2,82 0,0100 Matriz de covariâncias Sem Estrutura Efeito GL numerador GL denominador F valor Pr > F Grupo 2 15 0,05 0,9538 Dias 4 15 89,25 Grupo*Dias 8 15 3,13 0,0270 Considerando o número elevado de estruturas de variâncias-covariâncias possíveis, um dos principais objetivos da análise é o de encontrar um modelo que melhor represente os dados, para depois realizar os testes sobre os efeitos fixos. Para a escolha do modelo adequado foi utilizado o critério de Akaike (AIC). O modelo testado foi o de efeito quadrático: y ijk = μ + τ i + δ j + τδ ij + δ 2 + τδ 2 + ε j ij ijk em que y ijk é o peso observado para o i-ésimo grupo, no j-ésimo dia e k-ésima repetição; τ i é o efeito do i-ésimo grupo; δ j é o efeito do j-ésimo tempo e ε ijk o erro associado ao i-ésimo grupo, j-ésimo tempo e k-ésima repetição. As estruturas de covariâncias testadas para esse modelo foram: não-estruturada (UN), Huynh- Feldt (HF), Auto-Regressiva de ordem 1 (AR(1)) e Simetria Composta (CS), e os resultados são apresentados na Tabela 17. Tabela 17. Comparação das estruturas de covariâncias através do critério de Akaike (AIC) e o de Informação Bayesiana (BIC). Parâmetros Não estruturada (UN) Huynh-Feldt (HF) AR(1) Simetria Composta (CS) AIC 369,9 358,4 357,8 358,1 BIC 383,3 363,7 359,6 359,8 1576

Análise de dados longitudinais em experimentação animal De acordo com o critério de Akaike, a estrutura de covariâncias mais adequada foi a AR (1), tornando necessária a verificação dos testes para os efeitos fixos, e caso algum efeito não fosse significativo deveria ser retirado do modelo (Tabela 18). Entretanto, todos os efeitos foram significativos (p<0,05). Tabela 18. Testes para os efeitos fixos do modelo completo com a estrutura da matriz de covariâncias do tipo AR(1). Causa de variação GL numerador GL denominador F valor Pr > F Grupo 2 15 0,01 0,9906 Dias 1 66 54,53 Grupo*Dias 2 66 5,64 0,0055 Dias 2 1 66 3,44 0,0679 Grupo*Dias 2 2 66 3,61 0,0325 Pode-se então realizar testes para verificar se os efeitos dos Grupos podem ser considerados sem diferenças, ou seja, se uma única curva pode explicar o comportamento de mais de um Grupo. Neste trabalho, o teste utilizado foi o de Tukey- Kramer (Tabela 19). Pelo teste de Tukey-Kramer para os Grupos verifica-se que as comparações entre os Grupos: G1-G2, G1-G3 e G2-G3, não são significativas, sugerindo que é possível unir os Grupos em um único, ou seja, não há diferença entre o grupo tratado com o extrato de acácia e os controles positivo e negativo. Assim, a curva ajustada para explicar o comportamento dos Grupos em função dos Dias é dada por: y ijk = 26,3 + 0,151δ j As estimativas dos parâmetros da curva de crescimento para o modelo escolhido são apresentadas na Tabela 20. Tabela 19. Teste de Tukey-Kramer para o fator Grupo com a estrutura da matriz de covariâncias do tipo AR(1). Grupos Diferenças Erro-padrão GL t valor PR > t G1 G2-0,3132 4,3666 15-0,07 0,9438 G1 G3 1,0921 4,3666 15 0,25 0,8059 G2 G3 1,4053 4,3666 15 0,32 0,7520 Tabela 20. Estimativas do modelo final ajustado. Efeitos Estimativas Erro padrão GL t valor Pr> t Grupo 26,2864 1,6894 17 15,56 Dias*Grupo 0,1510 0,02167 70 6,97 1577

Tabela 20. Estimativas do modelo final ajustado. Efeitos Estimativas Erro padrão GL t valor Pr> t Cestari, A. A.; Costa, S. C. da; Minho, A. P. Grupo 26,2864 1,6894 17 15,56 Dias*Grupo Na Figura 0,15103 é apresentado 0,02167 o ajuste 70 do 6,97 modelo Agradecimentos Fonte: Elaboração final para dos os autores. valores médios dos pesos dos animais, Os autores agradecem o suporte financeiro também demonstrado na Tabela 20. É possível oferecido pelo Conselho Nacional de ra 3 é apresentado verificar o que ajuste houve do modelo um bom final ajuste para dos valores pesos em médios dos pesos dos animais, Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) rado na Tabela função 20. É do possível tempo, verificar demonstrado que houve através um da bom pouca ajuste e dos Instituto pesos Agronômico em função do do Paraná (IAPAR). variabilidade encontrada. do através da pouca variabilidade encontrada. Referências Figura 3. Ajuste do modelo final para os valores médios 3. Ajuste do do modelo peso vivo final dos para ovinos. os valores médios do peso vivo dos ALEXANDRE, ovinos. J. C.; ARAÚJO, S. I.; ARAÚJO, C. V. de; REGAZZI, J. A. Análise de dados longitudinais em experimentação com animais usando a metodologia de modelos mistos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA, 10., 2005, Campo Grande. Anais... Campo Grande: UEMS, 2005. p. 1-4. BARBOSA, M. Uma abordagem para análise de dados com medidas repetidas utilizando modelos lineares mistos. 2009. Dissertação (Mestrado em Agronomia) Universidade de São Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. COLES, G.; BAUER, C.; BORQSTEEDE, F. H.; GEERTS, S.; KLEI, T. R.; TAYLOR, M. A.; WALLER, P. J. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v. 44, n. 1, p. 35-44, 1992. CROWDER, M. J.; HAND, D. J. Analysis of repeated measures. London: Chapman & Hall, 1990. 257 p. DAVIDIAN, M. Applied longitudinal data analysis: Conclusões lecture notes. North Carolina: North Carolina State ente trabalho não No foi presente encontrado trabalho efeito não significativo foi encontrado sobre efeito o peso University, vivo, da suplementação 2005. 528 p. ácia, em ovinos significativo experimentalmente sobre o peso infectados vivo, da com suplementação Haemochus contortus. EVERITT, B. S. An R and S-Plus companion to multivariate analysis. London: Springer-Verlag, 2005. odologias utilizadas com extrato para de acácia, a análise em ovinos dos dados: experimentalmente delineamento em 221 parcelas p. subdivididas, infectados com Haemochus contortus. iada e de modelos mistos apresentaram resultados semelhantes. GITHIORI, E, considerando J. B.; a ATHANASIADOU, S.; As metodologias utilizadas para a análise dos THAMSBORG, S. M. Use of plants in novel approaches observações relacionadas à variável peso, recomenda-se o ajuste for de control modelos of gastrointestinal mistos, que helminths in livestock with dados: delineamento em parcelas subdivididas, curvas de crescimento ou modelos polinomiais que incluam a matriz emphasis de covariâncias on small ruminants. que Veterinary Parasitology, análise multivariada e de modelos mistos Amsterdam, v. 139, n. 4, p. 308-320, 2006. o comportamento apresentaram dos dados. resultados semelhantes. E, LITTELL, R. C.; HENRY, P. R.; AMMERMAN, C. B. considerando a dependência das observações Statistical analysis of repeated measures data using SAS relacionadas à variável peso, recomenda-se o ajuste procedures. J. Anim. Sci., Madison, v. 76, n. 4, p. 1216- de modelos mistos, que podem envolver curvas de 1231, 1998. res agradecem crescimento o suporte financeiro ou modelos oferecido polinomiais pelo que Conselho incluam Nacional MALHEIROS, de Desenvolvimento E. B. Precisão de análise de dados a matriz de covariâncias que melhor explique o longitudinais, com diferentes estruturas para a matriz de ológico (CNPq) e Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). variância e covariâncias, quando se utiliza o esquema comportamento dos dados. em parcelas subdivididas. Revista de Matemática e Estatística, São Paulo, v. 17, n. 1, p. 263-273, 1999. 1578

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