USO DE SONDAS FLUORESCENTES PARA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDES OVINOS ANTES E APÓS CONGELAÇÃO

ARS VETERINARIA, 16(3):204-209, 2000. 204 USO DE SONDAS FLUORESCENTES PARA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDES OVINOS ANTES E APÓS CONGELAÇÃO (USE OF FLUORESCENT PROBES TO ASSESS PLASMA MEMBRANE INTEGRITY OF OVINE SPERMATOZOA BEFORE AND AFTER FREEZING) V. H. MEDINA 1, W. R. R. VICENTE 2, C. R. ESPER 2, E. B. MALHEIROS 3 RESUMO Células espermáticas de ejaculados de sete machos ovinos (Ovis aries) de diversas raças foram examinadas quanto à integridade de suas membranas plasmáticas por meio de sondas fluorescentes, antes e após o processo de congelação. De cada macho foram obtidos sete ejaculados e tomadas amostras de sangue para dosagem de testosterona. Após avaliação, os ejaculados foram diluidos em solução de Tris-tampão e congelados em palhetas de 0,5ml (200 x 10 6 espermatozóides/ml). A morfologia e a integridade da membrana plasmática dos espermatozóides foram analisadas antes e após descongelação. Os dados foram submetidos à análise de regressão linear e teste de Tukey, mostrando valores de F significantes (P<0,01) para a integridade das membranas plasmáticas e acrosomo em relação aos tratamentos. Além disso, foi também observada a influência da testosterona em relação a alguns parâmetros analisados. PALAVRAS-CHAVE: Espermatozóides ovinos, sondas fluorescentes, congelação, membrana plasmática ABSTRACT Sperm cells of the ejaculates of seven ovine males (Ovis aries) of several breeds were examined regarding their plasma membrane integrity by means of fluorescent probes, before and after the process of freezing. From each male it was obtained seven ejaculates and it was also taken blood samples to determine testosterone levels. After evaluation, the ejaculates were diluted in Tris-buffer solution and frozen in 0,5 ml straws (200 x 10 6 spermatozoa/ml). The morphology and plasma membrane integrity of the spermatozoa were assessed before and after thawing. Data were submitted to a linear regression analysis and Tukey s test, showing significant F values (P<0,01) for plasma membranes integrity and acrosome in relation to treatments. In addition, was also observed the influence of testosterone in relation to some analysed parameters. KEY-WORDS: ovine spermatozoa, fluorescent probes, freezing, plasma membrane. 1 - Laboratorio de Teriogenologia. Faculdad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional del Comahue. C.C. 85 Cinco Saltos (8303), Rio Negro, Argentina. 2 - Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, FCAV-UNESP- Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, km 05, 14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil. 3 - Departamento de Ciências Exatas, FCAV-UNESP- Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, km 05, 14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil. Autor para correspondência. E-mail: cresper@fcav.unesp.br

205 ARS VETERINARIA, 16(3):204-209, 2000. INTRODUÇÃO A baixa fertilidade do sêmen descongelado na espécie ovina é atribuída, em grande parte, às alterações por que passam as membranas espermáticas (plasmática, acrosomais e mitocondriais) durante os processos de congelação e descongelação. HARRISON & VICKERS (1990) consideraram a integridade da membrana plasmática como um parâmetro essencial para avaliação da função celular de maneira geral. Corantes para microscopia de luz têm sido preconizados na análise morfológica de células espermáticas (WAY et al., 1995). A utilização de sondas fluorescentes, diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propidio, foi descrita por GARDNER et al.(1986) e SÖDERQUIST et al.(1997) com objetivo de visualizar a integridade da membrana plasmática de espermatozóides bovinos. Posteriormente, HARRISON & VICKERS (1990) repetiram sua aplicação para espermatozóides de ovinos e suínos. O diacetato de carboxifluoresceina é um éster não polar, não fluorescente e permeável à membrana plasmática. Dentro da célula é hidrolisado por estereases inespecíficas, resultando em um composto fluorescente e impermeável à membrana plasmática intacta que fluoresce em verde. Por outro lado, o iodeto de propidio, que se liga e cora DNA celular, é impermeável à membrana plasmática, portanto, somente penetra e cora as células lesadas (GARDNER et al. 1986 e HARRISON & VICKERS, 1990). Baseados nestes princípios, o objetivo deste trabalho foi avaliar a integridade da membrana plasmática de espermatozóides de ovinos submetidos à congelação. MATERIAL E MÉTODOS Sêmen Ejaculados de 07 ovinos das raças Corriedale, Suffolk, Merino Australiano, Morada Nova e Ideal, com idade de 2 a 4 anos e em atividade sexual, foram colhidos pelo uso de vagina artificial como descrito por MIES FILHO (1987). Sete ejaculados de cada animal foram comparativamente avaliados quanto ao volume, concentração, motilidade e vigor espermáticos e, em seguida, diluídos na proporção de 1:1 (v/v) em 50% do volume de uma solução Tris-tampão A (SALAMON & VISSER, 1972, modificado por AISEN et al., 1990) a 30 C, mantendo-se a concentração de 200 x 10 6 espermatozóides por doses de 0,5 ml. Após manutenção por 3 horas a 4 0 C, igual volume (50%) de uma solução Tris-tampão B, também a 4 0 C, foi adicionada à solução A. Após homogeneização e estabilização por 30 minutos, os ejaculados foram envasados em palhetas de 0,5 ml, congelados em vapor e imersos em nitrogênio líquido até serem utilizadas. Para análise morfológica foi utilizada microscopia de contraste de interferência diferencial de fase e os espermatozóides tiveram suas alterações classificadas como preconizado por BLOM (1973). Avaliação da Integridade da Membrana Plasmática A integridade da membrana plasmática do espermatozóide de ovinos foi avaliada pela coloração fluorescente utilizando-se mistura de corantes biológicos constituídos por Diacetato de 6-Carboxifluoresceína (DIC) (Molecular Probes, Inc., Eugene, Or, USA) e Iodeto de Propidio (IP) (Sigma, St. Louis, Mo, USA) de acordo com o método descrito por HARRISON & VICKERS (1990). O meio de coloração foi preparado pela adição a cada ml de solução salina estoque (ver abaixo) de 20 μl de formaldeído (2,5 mg/ml em água, preparado no dia do uso), 20 μl de solução estoque de DIC ( 0,46 mg/ml em dimetilsulfóxido), e 10 μl de solução estoque de IP (0,5 mg/ml em salina). Após preparadas, as soluções de DIC e IP foram protegidas da luz e estocadas a 20 C até o momento do uso. Vinte μl de sêmen in natura foram diluídos em 1 ml de solução salina estoque em Eppendorfs de 1 ml, seguido da adição de 40 μl de meio de coloração e incubação em banho-maria a 33 C por 10 minutos. Em relação ao sêmen congelado, o conteúdo de uma palheta foi diluído em 3 ml de solução salina estoque contendo: NaCl (140 mm), glicose (10 nm), KCl (2,5 mm), álcool polivinílico (0,5 mg/ml), polivinilpirrolidona (0,5 mg/ml) e HEPES (20 mm), ph: 7,5 e osmolalidade de 300 m osmol/kg, seguido de centrifugação a 120 g durante 10 minutos. Após a segunda lavagem, o sedimento foi homogeneizado com 0,3 ml do sobrenadante desprezado e exposto à solução de coloração como descrita anteriormente para o sêmen in natura. Alíquotas de 10 μl do sêmen corado foram depositadas em lâmina, cobertas por lamínulas e observadas sob microscópio epifluorescente (Fluovert, Leitz, Germany) com aumento de 600 x. A visualização dos espermatozóides foi feita com filtros padrões de fluorceína e de rodamina para os corante DIC e IP, respectivamente. As células espermáticas que se coravam por DIC e IP foram classificadas em cinco categorias. Os espermatozóides que se coravam em verde (DIC) ao longo de seu comprimento foi considerado como intacto, enquanto os outros, com diversos graus e/ou partes coradas foram classificados como danificados. Os espermatozóides que coravam-se em vermelho (IP) foram considerados lesados em sua membrana plasmática. Avaliação da Integridade Acrosomal A integridade do acrosomo foi avaliada a partir de

ARS VETERINARIA, 16(3):204-209, 2000. 206 células espermáticas fixadas em solução de formol salina, centrifugadas a 600g por 10 minutos e, após remoção do sobrenadante, ressuspensas em solução de salina estoque. Esfregaços foram confeccionados, corados e examinados sob microscopia óptica em imersão como descrito por KOVACS & FOOTE (1992). Radioimunoensaio Após obtenção de cada ejaculado, amostras de sangue foram obtidas por punção da veia jugular externa e, após extração do plasma, dosagens de testosterona foram realizadas pelo método de radioimunoensaio (RIA), em fase sólida com conjuntos de reagentes comerciais (Coat-count,Diagnostic Products Co, Los Angeles, CA, USA), utilizando-se I 125 como elemento radiativo traçador. Análise Estatística O delineamento experimental utilizado constou de blocos casualizados, com repetições dentro de blocos. Foram utilizados dois tratamentos (T1: sêmen in natura e T2: sêmen descongelado), sete blocos (animais) e sete repetições dentro de cada bloco (ejaculações). Para comparação das médias, foi aplicado o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. A análise de regressão linear foi aplicada para avaliar a variação dos parâmetros sangüíneos da testosterona em função da variáveis estudadas. e descongelado (T2) em relação às porcentagens de estreito na base (Eb), cauda fortemente enrolada (CFE) e peça intermediária (PI). As demais características referentes aos defeitos maiores não foram influenciadas pelo tratamento do sêmen. No que concerne aos defeitos menores, observouse aumento da gota protoplasmática distal (GPD) entre animais e da cabeça isolada normal (CIN) no sêmen descongelado. Os resultados de motilidade (vivos x mortos) e motilidade progressiva (Tab.1), mostraram diferenças entre animais e entre tratamentos (P<0,01), com os valores referentes ao sêmen in natura sempre maiores. A Tab.2 reúne as equações de regressão das diversas variáveis em relação aos níveis séricos de testosterona. Podem ser observados efeitos significativos dos níveis de testosterona (P<0,05) nas seguintes variáveis: categoria vermelha, cauda fortemente enrolada, volume do ejaculado e concentração espermática. RESULTADOS Os valores de F, os coeficientes de variação e as médias obtidas da integridade das membranas plasmáticas das células espermáticas de ovinos, nas categorias de membranas íntegras (verde), danificadas (vermelho) e parcialmente danificadas (verde-vermelha) são apresentados na Tab.1. Podem ser observadas diferenças entre animais (blocos), nas variáveis verde-vermelha (P<0,05). As médias, expressas em percentual, revelaramse, nas membranas classificadas na categoria verde, maiores para sêmen in natura (T1) em relação ao sêmen descongelado (T2), observando-se o inverso nas análises feitas para células coradas em vermelho e verde-vermelho. Com relação ao acrosomo, detectou-se também diferenças entre tratamentos (P<0,01). Observou-se que as avaliações feitas com sêmen in natura (T1), apresentaram maior número de acrosomos normais em relação ao sêmen descongelado (T2). Considerando-se a classificação de BLOM (1973) para defeitos maiores, pela Tabela 1 nota-se variação entre animais em relação à alteração estreito na base (Eb) e gota protoplasmática proximal (GPP). Quanto aos tratamentos, foram detectadas diferenças entre o sêmen in natura (T1) Figura 1 Coloração simultânea de células espermáticas com Diacetato de Fluoresceína (DIC) e Iodeto de Propídio (IP). 1. Membrana plasmática íntegra; 2. Membranas plasmática e acrosomal danificadas e mitocondrial íntegra; 3. Membrana plasmática danificada e acrosomal íntegra; 4. Membranas plasmática, acrosomal e mitocondrial danificadas; 5. Membranas plasmática e mitocondrial lesadas e acrosomal intacta. 900x.

207 ARS VETERINARIA, 16(3):204-209, 2000. Tabela 1 Valores de F, coeficientes de variação e médias obtidas para integridade das membranas, motilidade e morfologia das células espermáticas de ovinos. VARIÁVEL CATEGORIA ESTATÍSTICA F p/blocos F p/ Tratam. C V M é d ia T 1 M é d ia T 2 Integridade de % v e rd e 3,14** 616,70** 18,51 69,26 A. 25,33 B membranas % verm elha 4,2 5 * * 560,35** 18,47 2 6,1 6 B 67,58 A % verde e verm elha 2,20* 3,9 6 * 56,94 5,6 0 B 7,04 A Danos acrosom ais % N o rm a is % D anificados 2,23* 3,09** 111,75** 93,04** 11,92 27,90 80,42 A. B 61,46 19,57 B 3 7,1 7 A Defeitos % E stre ito s n a b a se 5,34** 3,74* 153,81 0,39 B. 0,61 A maiores % G ota prot. prox. 7,37** 0,1 5 NS 225,96 1,07 A 0,90 A % C a u d a fo rt. E n rl. 1,19 NS 9,92** 70,11 0,50 A 0,32 B % P eça in term ed. 1,01 NS 4,84* 45,43 0,35 A 0,29 A Defeitos % Cab. Isol. norm al 1,73 NS 8,36** 152,28 2,69 A. 1,04 B menores % G ota prot. distal 4,25** 1,1 4 NS 166,21 1,7 9 A 1,24 A % Cauda dobrada 2,04 NS 0,01 NS 135,60 1,47 A 1,43 A % Caud.dob./gota 3,77** 0,65 NS 5 0,8 7 A 0,38 A 0,35 A distal M o tilid ad e M o tilid ad e M o tilid ad e progressiva 42,18** 31,19 133,12** 130,74** 36,69 46,22 NS: Não significativo (P<0,05) * : Significativo ao nível de 5% ** : Significativo ao nível de 1% : Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de TUKEY, ao nível de 5%. 4 8,8 8 A. B 17,96 4 3,9 8 A 13,37 B Tabela 2 Valores de F com respectivos Níveis Mínimos de Significância (NMS), equação de regressão linear e coeficiente de correlação R obtidos para testosterona (ng/ml) em função das variáveis estudadas para sêmen in natura. V A R I Á V E I S F N M S E Q U A. Y = a + b x R % V e r d e 2, 8 8 0, 1 0 1 4 Y = 6 7, 3 0 3 3 + 1, 1 3 6 6 x 0, 2 8 % V e r m e l h a 4, 7 7 0, 0 3 6 0 Y = 2 8, 7 2 9 5-1, 3 2 3 9 x 0, 3 5 % V e r d e / V e r m e l h a 3, 2 9 0, 0 7 8 6 Y = 7, 3 0 2 1 2-0, 5 8 8 3 x 0, 3 0 % N o r m a l 3, 6 5 0, 0 6 4 6 Y = 7 7, 7 0 8 7 + 1, 0 7 2 3 x 0, 3 1 % D anificados 3, 2 1 0, 0 8 2 0 Y = 2 2, 1 7 0 3-1, 0 2 7 1 x 0, 2 9 C abeça Isolada N orm al 1, 3 7 0, 2 4 9 8 0, 2 0 E s t r e i t o n a b a s e 0, 1 9 0, 6 6 5 0 0, 0 7 G o t a P r o t o p l a s m. P r o x i m a l 1, 0 6 0, 3 1 1 5 0, 1 7 G o t a P r o t o p l a s m. D i s t a l 0, 6 9 0, 4 1 2 0 0, 1 4 C a u d a d o b r a d a 0, 4 3 0, 5 1 8 4 0, 1 1 C auda forte/ dobrada 5, 0 7 0, 0 3 0 9 Y = 0, 6 0 4 4-0, 0 5 6 4 x 0, 3 6 C a u d a d o b r. / G P D i s t a l 2, 5 9 0, 1 1 6 6 Y = 0, 4 7 5 0-0, 0 3 3 6 x 0, 2 7 P eça Interm ediária 0, 1 4 0, 7 1 4 6 0, 0 6 V o l u m e 4, 0 4 0, 0 5 0 1 Y = 0, 7 8 1 4-0, 0 6 6 3 x 0, 2 8 M o tilid a d e 3, 3 5 0, 0 7 3 8 Y = 5 9, 4 2 2 0-4, 3 4 5 0 x 0, 2 6 M o tilid a d e P ro g re ssiv a 3, 3 8 0, 0 7 2 5 Y = 5 3, 5 5 4 3-3, 9 4 5 4 x 0, 2 6 C oncentração 4, 2 9 0, 0 4 3 9 Y = 3 4 2 3, 1 7 1 8-3 4 0, 2 4 5 9 x 0, 2 9

ARS VETERINARIA, 16(3):204-209, 2000. 208 DISCUSSÃO A pobre motilidade das células espermáticas nem sempre indica dano celular. GARNER et al.(1986) consideraram espermatozóides moribundos aqueles que se apresentavam imóveis e retendo DIC ao longo da célula. Por outro lado, HARRISON & VICKERS (1990) comprovaram que estas células não estavam danificadas e eram capazes de aumentar significativamente a motilidade em condições favoráveis do meio ambiente. Neste estudo, detectou-se diferenças significativas tanto para animais (blocos) como para tratamentos do sêmen (in natura e descongelado). Quando consideram-se os parâmetros, motilidade e motilidade progressiva, detectados pelas sondas fluorescentes (Tab.1), diferenças foram observadas entre os tratamentos comprovando a ocorrência de grande perda de espermatozóides pela criopreservação. Estas perdas foram computadas como danos de membranas, tanto plasmática, como acrosomal e mitocondriais, Isto também foi observado por diversos autores ( GARNER et al., 1986; HARRISON & VICKERS, 1990; COELHO, 1993 e VALCÁRCEL et al.,1994) ao estudarem danos de membranas espermáticas após criopreservação, identificando 4 categorias de células. Neste estudo as observações foram relativamente semelhantes, além de se ter acrescentado uma quinta categoria, ou seja, espermatozóides apresentando acrosomo de cor verde e cabeça e PI vermelhas. Isto pode ser interpretado como conseqüência de danos das membranas plasmáticas e mitocondriais e membrana acrosomal intacta, talvez pela maior resistência desta última em relação às outras (GARNER et al., 1986 e HARRISON & VICKERS, 1990), não podendo ser afastada a possível influência da espécie. Deve ser destacada a grande influência da congelação (tratamento) sobre a membrana plasmática de espermatozóides ovinos. Observa-se pela Tab.1, que aproximadamente 40% dos espermatozóides apresentaram em suas membranas plasmáticas algum grau de lesão após a descongelação. Estas observações também foram detectadas por VALCÁRCEL et al., (l994,1996). Ao se analisar os resultados da avaliação morfológica do acrosomo observam-se diferenças entre animais e entre tratamentos. Seria interessante destacar a influência da congelação sobre a incidência de acrosomos danificados. Diferenças significativas foram detectadas após a descongelação dos espermatozóides (Tab.1). Estas observações já haviam sido mencionadas por KOVACS & FOOTE (1992). Neste trabalho, podem ser vistas sob o aspecto morfológico, diferenças significativas, entre animais, de defeitos maiores como estreito na base e gota protoplasmática proximal (Tab.1). Por outro lado, as diferenças significativas encontradas entre os tratamentos, mostraram que a criopreservação exerceu alguma influência sobre o aumento de defeitos maiores. Entre os defeitos menores, a incidência de gota protoplasmática distal (GPD) mostrou-se significativa, bem como quando associada com cauda dobrada (CD) em relação aos animais, indicando variações individuais. Pela Tab.2 verifica-se coeficiente de regressão negativos em relação ao volume e concentração espermáticas. Embora os resultados possam, em uma análise superficial, parecerem paradoxais, isto poderia ser explicado pelas observações de SHARPE (1990) e SPITERI- GRECH & NIESCHLAG (1993), quando se referiram aos fatores parácrinos envolvidos na espermatogênese. Acreditavam que, além do microambiente testicular, a concentração de testosterona seria fundamental na manutenção da espermatogênese. Portanto, é possível admitir-se que a testosterona circulante no sangue periférico de reprodutores adultos, seja solicitada para a continuidade da espermatogênese, determinando assim, diminuição deste hormônio na circulação geral. Por outro lado, a integridade da membrana plasmática mostrou-se relacionada com a concentração de testosterona (Tab.2). Neste estudo, o percentual de espermatozóides com membranas íntegras aumentou à medida que se aumentava o nível de testosterona. Assim, quanto maior o nível de testosterona circulante, ocorria diminuição do percentual de membranas plasmáticas lesadas. Pelos resultados apresentados neste trabalho, pode-se concluir que os níveis de testosterona parecem ser fundamentais para a manutenção da integridade da membrana plasmática, além de influenciarem diretamente parâmetros como volume, motilidade, concentração e morfologia de espermatozóides de ovinos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AISEN, E.G., CISALE, H., FERNÁNDEZ, H. Criopreservación de semen ovino. Nueva técnica. Veterinaria Argentina, v.vii, n.63, p.176-182, 1990. BLOM, E. The ultrastructure of same characteristic sperm defects and a proposal for a new classification of the bull spermiogram. 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209 ARS VETERINARIA, 16(3):204-209, 2000. 1986. HARRISON, R.A.P., VICKERS, S.E. Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. Journal Reproduction and Fertility, v.88, p.343-352, 1990. KOVACS, A., FOOTE, R.H. Viability and acrosome staining of bull, boar and rabbit spermatozoa. Biotechnic Histochemistry, v.67, n.3, p.119-124, 1992. MIES FILHO, A. 6.ed. Inseminação Artificial. Porto Alegre: Sulina, 1987. 695p. SALAMON, S., VISSER, D. Effect of composition of trisbased diluent of thawing solution on survival of ram spermatozoa frozen by the pellet method. Australian Journal Biological Science, v.25, p.605-618, 1972. SHARPE, R.M. Intratesticular control of steroidogenesis. Clinical Endocrinology, v.33, p.787-807, 1990. SÖDERQUIST, L., MADRID-BURY, N., RODRIGUES- MARTINEZ, H. Assessment of ram sperm membrane integrity following different thawing procedures. Theriogenology, v.48, p.1115-1125, 1997. SPITERI-GRECH, J., NIESCHLAG, E. Paracrine factors relevant to the regulation of spermatogenesis a review. Journal Reproduction and Fertility, v.98, p.1-14, 1993. VALCÁRCEL, A., de las HERAS, M.A., PEREZ, L.J., MOSES, D.F., BALDASSARRE, H. Fluorescent staining as a method of assessing membrane damage and post-thaw survival of ram spermatozoa. Theriogenology, v.41, n.2, p.483-489, 1994. VALCÁRCEL, A., de las HERAS, M.A., MOSES, D.F., PEREZ, L.J., BALDASSARRE, H. Comparison between Sephadex G-10 and Percoll for preparation of normospermic, asthenospermic na frozen/thawed ram semen. Animal Reproduction Science, v.41, p.215-224, 1996. WAY, A,L., HENAULT, M.A., KILLIAN, G.T. Comparison of four staining methods for evaluating acrosome status and viability of ejaculated and cauda epididymal bull spermatozoa. Theriogenology, v.43, p.1301-1316, 1995.