AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE UMA LIGA DE AÇO

Trabalho original AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE UMA LIGA DE AÇO INOXIDÁVEL COM BAIXA CONCENTRAÇÃO DE NÍQUEL CYTOTOXICITY EVALUATION OF STAINLESS STEEL ALLOY WITH LOW NICKEL CONCENTRATION MATHEUS MELO PITHON* ROGÉRIO LACERDA DOS SANTOS* FERNANDA OTAVIANO MARTINS** TERESA VILELA ROMANOS*** RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade de fios ortodônticos fabricados a partir de ligas de aço convencional e com baixa concentração de níquel. Foram avaliados três segmentos de fio ortodôntico de duas diferentes ligas: A fio aço convencional (Morelli, Sorocaba, Brasil) e B fio aço Biowire (Morelli, Sorocaba, Brasil) com baixa concentração de níquel em sua composição. Utilizou-se três grupos controle: positivo (C+) cilíndro de amálgama, negativo (C-) cilíndro de vidro e controle de célula (CC) onde as células não foram expostas a nenhum material. Os materiais foram previamente esterilizados em luz ultravioleta (UV). Após isso imersos em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) por 24 horas. Procedeu-se a remoção do sobrenadante e colocação em contato com fibroblastos L929. Avaliou-se a citotoxicidade em quatro períodos: 24, 48, 72 e 168 horas. Após contato com o meio, as células foram incubadas por mais 24 horas. Em seguida colocada em contato com 100 µl do corante vermelho neutro a 0,01% e incubadas por três horas para incorporação do corante. Passado esse período as células foram fixadas e seguido da contagem de células viáveis em espectrofotômetro (BioTek, Winooski, Vermont, EUA) em um comprimento de onda de 492 nm (λ = 492 nm). Os resultados demonstraram diferenças estatística entre os grupos C+ com os demais. Nos demais grupos e períodos não foram encontradas diferenças estatísticas. Dessa forma pode-se concluir que os fios ortodônticos avaliados não apresentam citotoxicidade nos tempos avaliados. Unitermos - Citotoxicidade; Técnicas de cultura de células; Aparelhos ortodônticos. ABSTRACT The objective of the present study was to evaluate the cytotoxicity of orthodontic wires made from either conventional stainless steel or stainless steel with low nickel concentration. Three segments of orthodontic wires from two different alloys were evaluated: group A, conventional stainless steel wire (Morelli, Sorocaba, Brasil) and group B, Biowire stainless steel wire with low nickel concentration (Morelli, Sorocaba, Brasil). Three control groups were used: amalgam cylinder as positive control (C+), glass cylinder as negative control (C-), and cell control (CC) in which the cells were not exposed to any material. The materials were previously sterilised with ultraviolet light (UV). Next, the samples were immersed in Eagle s minimum essential medium for 24 hours and the supernatant was removed and placed into contact with L929 fibroblasts. Cytotoxicity was evaluated during four phases: 24, 48, 72 and 168 hours. After medium contact, the cells were incubated for more than 24 hours and then placed into contact with 100 µl of 0.01% neutral red dye and incubated for dye incorporation for three hours. After this period of time, the cells were fixed and the viable cells counted by using a spectrophotometer (BioTek, Winooski, Vermont, USA) at a wave length of 492 nm (λ = 492 m). The results demonstrated statistical differences between the Groups C+ and the other ones, but no statistical differences were found between other groups and periods. One can conclude that the orthodontic wires studied exhibited no cytotoxicity during the experimental periods. Key Words - Cytotoxicity; Cell culture techniques; Orthodontic appliances. Recebido em fev/2009 - Aprovado em jul/2009 * Especialista em Ortodontia pela Universidade Federal de Alfenas - Unifal; Mestre em Ortodontia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ; Doutorando em Ortodontia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ. ** Graduanda de Microbiologia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro; Estagiária do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes - UFRJ. *** Doutora em Ciências (Microbiologia) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ; Professora adjunta da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ. OrtodontiaSPO 2009;42(3):201-9 295

INTRODUÇÃO É notável, nos últimos anos, uma crescente preocupação com a biocompatibilidade dos materiais odontológicos. Não se sabe se esse fato está associado a um aumento real na frequência de alergia aos materiais ou a um maior cuidado com os efeitos colaterais provocados pelos mesmos 1. Particulamente na área de Ortodontia, vários são os materiais que permanecem em contato com os tecidos moles da cavidade bucal por períodos prolongados 2-3. Na maioria dos casos em Ortodontia, as reações de hipersensibilidade apresentam manifestações locais, podendo, eventualmente, causar desordens sistêmicas. Com isso, a preocupação em relação à segurança e saúde geral do paciente tem sido objeto de estudos na literatura, uma vez que grande parte dos aparelhos e dispositivos utilizados na especialidade é composta por elementos químicos relacionados a alterações no sistema imune 4. Em decorrência da liberação iônica dos seus constituintes metálicos, a utilização de aparelhos ortodônticos tem sido associada a algumas reações de hipersensibilidade. Dentre os metais, o níquel tem sido considerado uma das causas mais comuns da dermatite de contato 5. Infelizmente, a associação com o níquel faz parte da vida moderna e devido à onipresença do mesmo, as reações a esse metal apareceram com muito mais frequência na população em geral, logo em pacientes ortodônticos, haja vista que braquetes ortodônticos, bandas e fios são na grande maioria das vezes confeccionados com uma liga metálica, com concentrações variadas de níquel 6. Vale relembrar que além do efeito alergênico existe o carcinogênico, mutagênico e citotóxico desses íons 7. Preocupados em atender a necessidade desses pacientes, intolerantes ao níquel, as indústrias desenvolveram uma série de materiais com diferentes concentrações de níquel em sua composição. Dentre estes cita-se em especial o Biowire (Morelli, Sorocaba, São Paulo), fio ortodôntico confeccionado a partir de uma liga de aço inoxidável com baixa concentração de níquel em sua formulação. Na tentativa de elucidar a biocompatibilidade desses material, o objetivo deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade de fio ortodônticos convencionais e fios com baixa concentração de níquel. MATERIAL E MÉTODOS Cultura de células A linhagem celular utilizada foi L929 obtido do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) (fibroblasto de camundongo) cultivada em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) (Cultilab, Campinas/SP, Brasil) suplementado com 2 mm de L-glutamina (Sigma, St. Louis/Missouri, EUA), 50 µg/ml de gentamicina (Schering Plough, Kenilworth/New Jersey, EUA), 2,5 µg/ml de fungizona (Bristol-Myers-Squibb, New York, EUA), 0.25 ml solução de bicarbonato de sódio (Merck, Darmstadt, Aslemanha), 10 mm de Hepes (Sigma, St. Louis/Missouri, EUA), e 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas/SP, Brasil) e mantida a 37 0 C em ambiente contendo 5% de CO 2. Fios ortodônticos avaliados A amostra compreendeu três segmentos de fios ortodônticos (10 mm) confeccionados a partir de duas diferentes ligas, divididos em dois grupos: A fio aço convencional (Morelli, Sorocaba, Brasil); e B fio aço Biowire com baixa concentração de níquel em sua composição (Morelli, Sorocaba, Brasil). Controles Para verificar a resposta celular frente aos extremos, outros três grupos foram inseridos: grupo CC (controle de célula) o qual as células não foram expostas a nenhum material; grupo C+ (controle positivo) constituído de um cilindro de amálgama; e C- (controle negativo), o qual um bastão de vidro ficou em contato com as células. Ensaio de citotoxicidade dos materiais Os materiais foram esterilizados previamente por exposição à luz UV (Labconco, Kansas/Missouri, USA) durante uma hora 8. Em seguida, três amostras de cada material foram colocadas em placas de 24 poços contendo meio de cultura (MEM) (Cultilab, Campinas/SP, Brasil). Os sobrenadantes foram coletados após 24, 48, 72 e 168 horas (sete dias) e avaliados quanto à toxicidade para as células L929. Os sobrenadantes foram colocados, em triplicata, em uma placa de 96 poços contendo monocamada confluente de L929 e incubados por 24 horas a 37 0 C em ambiente contendo 5% de CO 2. Terminado o tempo de incubação, o efeito na viabilidade celular foi determinado através da técnica dye-uptake, descrita por autores 9, com pequenas modificações. Após 24 horas de incubação, foram adicionados 100 µl de vermelho neutro a 0,01% (Sigma, St. Louis/Missouri, 296 OrtodontiaSPO 2009;42(3):201-9

EUA), em meio de cultura, em cada poço das microplacas e estas foram incubadas a 37 o C por três horas para penetração do corante nas células vivas. Passado esse período, após desprezar o corante, foram adicionados 100 µl de solução de formaldeído (Reagen) a 4% em PBS (NaCl 130 mm; KCl 2 mm; Na 2 HPO 4 2H 2 O 6 mm; K 2 HPO 4 1 mm, ph7,2) por cinco minutos, para promover a fixação das células às placas. Em seguida, para a extração do corante, foram adicionados 100 µl de uma solução de ácido acético (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) a 1% com metanol (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil) a 50%. Após 20 minutos a leitura foi realizada em espectrofotômetro (BioTek, Winooski/Vermont, EUA) em um comprimento de onda de 492 nm (λ = 492 nm). Análise estatística As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa SPSS 13.0 (SPSS Inc.,Chicago/Illinois). Análise estatística descritiva incluindo média e desvio padrão foi calculada para os grupos avaliados. Os valores da quantidade de células viáveis foram submetidos à análise de variância (Anova) para determinar se havia diferenças estatísticas entre os grupos e, posteriormente, ao teste de Tukey. RESULTADOS Os resultados demostraram ausência de citotoxicidade entre os materiais avaliados. Citotoxicidade foi observada apenas no grupo controle positivo, sendo esse grupo diferente estatisticamente dos demais em todos os tempos avaliados (Quadro 1). DISCUSSÃO A corrosão dos fios ortodônticos podem ocasionar a liberação de íons metálicos como o níquel para a cavidade bucal, ocasionando reações no organismo como as dermatites de contato 10. Essa hipersensibilidade ao níquel provoca manifestações bucais e estomatites de contato alérgicas, que podem confundir o diagnóstico com hiperplasias gengivais e ulcerações bucais. A solução é buscar fios ortodônticos com baixo teor de níquel 10-11. Os fabricantes de materiais ortodônticos se esforçaram na manufatura de ligas ortodônticas com baixa concentração de níquel em sua composição, como o Biowire (Morelli, Sorocaba, Brasil), liga odontológica de uso ortodôntico com reduzida concentração de níquel em sua composição. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico de duas ligas de uso ortodôntico com concentrações diferentes de níquel em sua composição. A determinação da biocompatibilidade representa um processo complexo e pode ser avaliada por testes de toxicidade in vitro (citotoxicidade e genotoxicidade) e in vivo, utilizando diversas metodologias regulamentadas e padronizadas 4. A utilização de cultura de células vem sendo utilizada como parte de uma série de testes recomendados para avaliar o comportamento biológico dos materiais a serem colocados em contato com tecidos humanos 2,8,12. Neste estudo, testes foram realizados para avaliar a citotoxicidade dos fios ortodônticos. Para tal utilizou-se linhagem de célula L929 (fibroblastos de camundongos) 13-16. Os resultados demonstraram ausência de citotoxicidade entre os grupos experimentais (fio de aço convencional e Biowire). Apenas o grupo controle negativo apresentou alta citotoxicidade quando comparado aos grupos controle de célula e controle negativo. Um estudo concluiu 17 que concentrações maiores de cloreto de níquel são responsáveis por reduzir em 50% a QUADRO 1 - MÉDIA, DESVIO PADRÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS GRUPOS AVALIADOS 24 horas 48 horas 72 horas 7 dias Grupos M. Cel/DP Est.* M. Cel/DP. Est.* M. Cel/DP Est.* M. Cel/DP Est.* A 0,61 (± 0,091) A 0,571 (± 0,058) A 0,326 (± 0,019) A 0,998 (± 0,058 ) A B 0,536 (± 0,059) A 0,654 (± 0,111 ) A 0,319 (± 0,027 ) A 0,957 (± 0,077) A C+ 0,274 (± 0,062) B 0,251 (± 0,05 ) B 0,212 (± 0,037 ) B 0,648 (± 0,049 ) B C- 0,539 (± 0,006) A 0,513 (± 0,03 ) A 0,318 (± 0,026 ) A 0,951 (± 0,055 ) A CC 0,532 (± 0,031) A 0,579 (± 0,126 ) A 0,319 (± 0,018 ) A 1,041 (± 0,081 ) A M. Cel: valores médios da quantidade de células viáveis. DP: Desvio padrão. Est: Estatística, onde letras iguais representam ausência de diferenças estatísticas. OrtodontiaSPO 2009;42(3):201-9 297

O GRUPO CONTROLE NEGATIVO CONSTITUIU-SE DE UM CILINDRO DE VIDRO, RECONHECIDAMENTE NÃO TÓXICO AS CÉLULAS, HAJA VISTA QUE AS CÉLULAS CORRIQUEIRAMENTE SÃO CULTIVADAS EM GARRAFAS DE VIDRO. ESTE CONTROLE VISOU AVALIAR APENAS A AÇÃO FÍSICA SOBRE AS CÉLULAS. O CONTROLE NEGATIVO COMO ESPERADO NÃO FOI CITOTÓXICO ÀS CÉLULAS, NÃO APRESENTANDO DIFERENÇAS ESTATÍSTICAS COM OS GRUPOS CONTROLE DE CÉLULAS E COM OS EXPERIMENTAIS AVALIADOS. viabilidade e síntese de DNA dos fibroblastos. Tal resultado não foi visto neste trabalho, talvez possa ser explicado pelo pequeno período de avaliação, onde não houve corrosão dos fios e por conseguinte liberação de íons metálicos em particular o níquel no sobrenadante que foi colocado em contato com as células. Em 2008 18 autores avaliaram a toxicidade genética associada ao uso de aparelhos ortodônticos e observaram, através do ensaio cometa, que houve um incremento no nível de dano primário do DNA, embora não significativo, dez dias após a montagem do aparelho ortodôntico, resultado esse que corrobora com o encontrado no presente. Tais resultados podem ser explicados pela pequena liberação de íons metálicos nos períodos iniciais, uma vez que nesses períodos o processo de corrosão não teriam iniciado. Entretanto, é importante a avaliação dos efeitos citotóxicos desses metais mesmo em períodos menores, uma vez que pequenas quantidades liberadas podem ser de considerável importância para os indivíduos com alto grau de sensibilidade ao níquel 19. Vale ressaltar que os corpos-de-prova ficaram em contato com o meio de cultura por 24, 48, 72 e 168 horas e em seguida foi coletado o sobrenadante do meio de cultura que então foram colocados em contato com as células. Os corposde-prova não foram colocados diretamente sobre as células, uma vez que o contato mecânico poderia lesar as mesmas, como sugerido 20. Visando avaliar a resposta celular frente a situações extremas, foi inserido ao trabalho um grupo controle positivo (C+) que teve como função gerar lesões as células. O material utilizado como controle positivo foi o amálgama odontológico 21, que é um material com comprovada citotoxicidade 22. Como esperado, o controle positivo apresentou alta toxicidade, sendo diferente estatisticamente de todos outros grupos (P<0.05). O grupo controle negativo constituiu-se de um cilindro de vidro, reconhecidamente não tóxico as células, haja vista que as células corriqueiramente são cultivadas em garrafas de vidro. Este controle visou avaliar apenas a ação física sobre as células. O controle negativo como esperado não foi citotóxico às células, não apresentando diferenças estatísticas com os grupos controle de células e com os experimentais avaliados. Um material para ser usado na cavidade oral, deve ser biocompatível, não absorvível pelo sistema circulatório e não deve provocar injúrias nos tecidos orais. Materiais não biocompatíveis podem mostrar-se mutagênicos ou ainda influenciar mediadores da inflamação provocando respostas sistêmicas, incluindo toxicidade, teratogenias ou efeitos carcinogênicos. CONCLUSÃO Pode-se concluir com a realização desse trabalho que: Ligas de aço inoxidável convencional e ligas com baixa concentração de níquel não apresentaram citotoxicidade às células L929 no período de 24 à 168 horas. Endereço para correspondência: Matheus Melo Pithon Av. Otávio Santos, 395 - sala 705 - Recreio 45020-750 Vitória da Conquista - BA Tel.: (77) 3084-2020 matheuspithon@bol.com.br 298 OrtodontiaSPO 2009;42(3):201-9

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