Avaliação dos espermatozóides recuperados comparando duas metodologias de separação espermática

Avaliação dos espermatozóides recuperados comparando duas metodologias de separação espermática Evaluation of recovered spermatozoids by two methologies of separation spermatic Leonni Dascani Zini Moreira * Reginaldo da Silva Fontes * Héctor Javier Narvaez * * Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Brasil. Resumo. O presente estudo teve como objetivo comparar as metodologias de separação espermática por migração ascendente em gradiente de BSA (Albumina Sérica Bovina) com a centrifugação em gradiente de Percoll, avaliando as alterações físicas e morfológicas dos espermatozóides submetidos aos dois tratamentos. Tratamento I - Foram colocados em tubos de microcentrífuga, uma alíquota do sêmen sobre o gradiente descontínuo de Percoll 45% e 90% e centrifugado a 9.000 x g por 5 minutos. O pellet foi resgatado e ressuspendido em meio de fertilização. Tratamento II - Foram depositados no fundo de tubos para microcentrífuga, uma alíquota de sêmen, sobre esta, as camadas de gradiente de BSA 4% e 2% e 600 μl de meio de fertilização, mantido a 37ºC, em posição vertical. A cada intervalo de 10 minutos um sobrenadante de 300 μl foi retirado da amostra e substituído pela mesma quantidade de meio de fertilização. As avaliações foram feitas pré e pós os tratamentos avaliando-se a cinética espermática por análise computadorizada (Hamilton Thorne Research) e a integridade espermática pelo teste hiposmótico. As médias dos tratamentos foram avaliadas estatisticamente pelo teste de Tukey. Após avaliação física do sêmen em relação ao vigor, motilidade total e progressiva, os métodos de separação não se diferenciaram significativamente (P>0,05). A concentração espermática recuperada pelo gradiente de Percoll foi superior a migração ascendente em BSA (61,67 e 14,4 x 10 6 esptz/ ml, respectivamente). Contudo, ambos os métodos foram eficientes em separar espermatozóides viáveis, sendo o Percoll superior. Além de todas as avaliações já feitas no presente estudo para avaliar a capacidade fecundante das concentrações espermáticas resgatadas, seria interessante fazer um teste de fertilização in vitro. Palavras Chave: bovinos, centrifugação, fertilização, gradiente, sêmen. Sumário. Trying to improve the rates of IVF with previously sexed semen, research is being made. The present study had the objective to compare the methodology of spermatic separation by ascendant migration in BSA gradient, with the centrifugation in Percoll gradient. Evaluating the morphological alterations of the spermatozoa submitted to the two treatments. Treatment I A semen sample was put in an Eppendorf tube above the discontinuous Percoll gradient, 45 and 90% and centrifugated at 9000 x g for 5 minutes. The pellet was retrieved and diluted in fertilization medium. Treatment II In the bottom of an Eppendorf tube, an aliquot of semen was deposited, above this, the layers of BSA gradient 4 and 2% and 600 μl of fertilization medium, maintained at 37ºC in vertical position. At every 10 minutes interval. A top layer of 300 μl was removed from the sample, and the same quantity of fertilization medium was added to replace it. The evaluations were made before and after the treatments, evaluating the spermatic motility by computerized analysis (Hamilton Thorne Research) and the spermatic integrity by the hiposmotic test. The averages of the treatments have been statistical analyzed by the turkey test. After the physical evaluation of the semen viability, total and progressive motility, no significant difference was found. The hiposmotic test presented significant difference (Percoll 78,67% and BSA 70%). The spermatic concentration between the Percoll gradient and the BSA gradient (61,67 and 14,4 x 10 6 sptz/ml respectively) had significant difference. About to bring to and end which of the methods is more viable it would be interesting to do one test of in vitro fertilization aside all the evaluations made in the present study to evaluate the ability to fecundate of the spermatic concentrations recovered in both treatments. Key Words: bovine, centrifugation, fertilization, sexed semen.

Leonni Dascani Zini Moreira, Reginaldo da Silva Fontes y Héctor Javier Narvaez INTRODUÇÃO Com o passar dos anos, novas biotecnologias da reprodução vêm sendo desenvolvidas sempre buscando maximizar o uso do gameta feminino, como por exemplo, a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos hoje utilizada de forma comercial e apresentando alta relação custo-benefício. Para realizar a fertilização in vitro (FIV) diversos métodos de separação da fração móvel e eliminação do diluidor e/ou crioprotetor do sêmen vêm sendo utilizados. Basicamente existem 3 princípios para separar a população de espermatozóides funcionais do sêmen: 1) Por simples diluição em meio isotônico e lavagem por centrifugação; 2) Pela migração espermática como os procedimentos Swim-up ou Swim-down, onde ocorre a migração dos espermatozóides com maior motilidade separando de espermatozóides imóveis e elementos não celular do sêmen; 3) Separação através de gradientes de densidades, como o gradiente descontínuo de Percoll. A migração espermática ascendente denominada Swim-up e o gradiente descontínuo de Percoll são os métodos mais utilizadas no processo de FIV convencional, atualmente. Mas a etapa de centrifugação presente em ambos é prejudicial, sendo responsável por danos estruturais nos espermatozóides e queda na motilidade, interferindo nas taxas de fertilização in vitro (MATÁS et al., 2007). Esses danos são ainda mais importantes no sêmen sexado, pois este apresenta espermatozóides que já sofreram um processo de separação celular (sexagem) que altera a viabilidade das células espermáticas. Dessa forma o presente estudo avaliou os espermatozóides recuperados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll e os espermatozóides recuperados pela migração ascendente em gradiente descontínuo de Albumina Sérica Bovina (BSA) que não apresenta a centrifugação em seu protocolo, comparando qual metodologia preserva ao máximo a viabilidade e a motilidade dos espermatozóides a serem utilizado na FIV. MATERIAIS E MÉTODOS O projeto foi realizado no Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal (LRMGA) do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Preparo dos espermatozóides: Foi utilizado no experimento, sêmen convencional criopreservado, de uma única partida e do mesmo touro, da raça Nelore. O sêmen foi descongelado pela imersão das palhetas em banho-maria a 37ºC por 30. Migração ascendente em gradiente de BSA: Para o preparo do gradiente descontínuo de BSA, foram colocados, na ordem em um tubo de microcentrífuga, uma alíquota de 400 μl de sêmen (depois de feita a avaliação inicial do vigor, motilidade total e progressiva, concentração e teste Hiposmótico), em seguida 100 μl de BSA 4%, 100 μl de BSA 2% (BSA com ácidos graxos) e 600 μl de meio TALP-sp modificado (CHAMBERLAND et al, 2001), os tubos foram mantidos em estufa a 37ºC, em posição vertical. A cada intervalo de 10 minutos, 300 μl de sobrenadante foi retirado da amostra e em seguida 300 μl de meio TALP-sp modificado foi adicionado para repor a quantidade retirada. Um total de quatro sobrenadantes foram resgatados e avaliados em relação aos parâmetros qualitativos e quantitativo. Centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll: Em um tubo para microcentrífuga com capacidade de 1,5 ml, foram colocados 400 μl de Percoll a 90% (Nutricell) e sobre esta camada depositado 400 μl de Percoll a 45% (Nutricell), vagarosamente, de modo que as duas camadas não se misturassem. O tubo contendo o gradiente descontínuo de Percoll foi aquecido a 37ºC, antes do descongelamento do sêmen. Após o descongelamento do sêmen e avaliação inicial dos parâmetros qualitativos e quantitativos das amostras, uma alíquota de 400 μl de sêmen foi depositado sobre as camadas de Percoll, sem que ocorresse a mistura destas. Os tubos foram colocados para centrifugar em uma microcentrífuga (CENTRIFUGE 5402, Eppendorf ) a 200 x g por 2 minutos, para estabilização das camadas de Percoll, em seguida, submetido a NÚMERO 6-7 / ABRIL - DICIEMBRE DE 2007 / R EVISTA SPEI DOMUS 39

Avaliação dos espermatozóides recuperados comparando duas metodologias de separação espermática uma segunda centrifugação de 9.000 x g por 5 minutos para concentrar os espermatozóides viáveis. Decorrido o tempo de centrifugação, cerca de 900 μl de sobrenadante foi retirado e desprezado, por conter diluente de sêmen e espermatozóides mortos, deixando um pellet com aproximadamente 100 μl. Ao pellet obtido foi acrescentado 400 μl de meio Tyrodes de fertilização (Talp-fec) e uma terceira centrifugação a 700 x g por 3 minutos foi realizada, com a intenção de retirar o Percoll do meio. Após a lavagem, 400 μl do sobrenadante foram retirados e desprezados, ficando um pellet com volume final de aproximadamente 100 μl, que foi avaliado quanto aos parâmetros qualitativos e quantitativos. Avaliação computadorizada da cinética espermática: A avaliação foi realizada no Hamilton Thorne computer-aided semen analyzer (Hamilton Thorne Research, Beverly, USA), utilizando o setup para sêmen de bovino congelado, levando em consideração os resultados qualitativos de vigor (0-5), motilidade total (%) e motilidade progressiva (%) das amostras seminais pré e pós os métodos de separação espermática. Concentração espermática: A concentração espermática foi determinada utilizando-se câmara de Neubauer e microscopia óptica, com aumento de 40x, sendo o sêmen analisado antes e após os métodos de separação espermática, utilizando-se a diluição das amostras na proporção de 1:100 em formol salino tamponado. Os sobrenadantes resgatados do gradiente de BSA foram submetidos à centrifugação a 700 x g por 3 minutos, para concentrar os espermatozóides e posteriormente feita à diluição (1:5) em formal salino tamponado. Para calcular a concentração foram analisados os dois lados da câmara de Neubauer, contando os espermatozóides contidos nos 5 quadrados grandes (contendo 16 quadrados menores cada) de cada lado, totalizando 10 quadrados grandes. O total de espermatozóides (sptz) contados foi colocado na fórmula: Total de sptz X 1 X 1 X diluição X 1000 = sptz/ml 2 10 5 Teste Hiposmótico (THO): O THO para avaliar a integridade e a funcionalidade das membranas espermática foi realizado com a diluição de aproximadamente 10 μl de sêmen em 1 ml de solução hiposmótica (9 g/l de frutose e 49 g/l de citrato de sódio), após 5 minutos, uma lâmina úmida foi montada para se proceder a avaliação. Foram classificados como íntegros os espermatozóides que apresentaram cauda dobrada e lesão de membrana os espermatozóides que apresentaram cauda retilínea (Figura 3). Foram contadas 200 células, classificando individualmente as alterações encontradas. Análise Estatística: Foi realizada por meio de análise de variância no delineamento inteiramente casualizado (teste F a 5% de significância) e a comparação das médias pelo teste de Tukey à 5% de significância, sendo 2 tratamentos com 3 repetições cada um. Foi utilizado o aplicativo computacional SAEG. Versão 9.0, desenvolvido pela Fundação Artur Bernardes (FUNARBE) da Universidade Federal de Viçosa (UFV). RESULTADOS Após a avaliação computadorizada da motilidade total, motilidade progressiva, vigor e avaliação da integridade espermática pelo teste Hiposmótico, os resultados mostraram melhora na qualidade das células espermáticas presentes nas amostras recuperadas após os métodos de separação espermática. Os espermatozóides selecionados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll (45% e 90%) apresentaram um aumento significativo (P<0,05) na motilidade total da amostra (Tabela 1), quando comparada com as amostras antes da centrifugação (86,67% e 67,67% respectivamente), o que não foi observado para outras características como vigor, motilidade progressiva e concentração. Os resultados da avaliação dos espermatozóides submetidos ao THO, após serem recuperados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll, demonstrou a eficiência (P<0,05) do Percoll em separar espermatozóides com boa qualidade. 40 R EVISTA SPEI DOMUS / NÚMERO 6-7 / ABRIL - DICIEMBRE DE 2007

Leonni Dascani Zini Moreira, Reginaldo da Silva Fontes y Héctor Javier Narvaez Tabela 1: Avaliação espermática do vigor, motilidade total (MOT), motilidade progressiva (M. PROG), concentração (CONC) e teste Hiposmótico (THO) do sêmen submetido ao gradiente de Percoll. SÊMEN Antes da centrifugação Após a centrifugação VIGOR (0-5) MOT (%) M. PROG (%) CONC (x 10 6 esptz/ml) THO (%) 3,3 a 67,7 A 21 a 56,7 A 65,7 a 4,0 a 86,7 B 36 a 66,7 A 78,7 b Médias com letras iguais não diferem pelo Teste de Tukey (α<0,05). Os resultados da tabela 2 demonstram que a migração ascendente em BSA foi eficiente em selecionar uma maior (P<0,05) quantidade de espermatozóide com motilidade progressiva, quando comparado com os espermatozóides após o descongelamento. Por outro lado, a concentração espermática recuperada apresentou redução (P<0,05) nas amostras obtidas em relação às amostras após o descongelamento. O teste Hiposmótico (THO) demonstrou que a migração ascendente em BSA permitiu separar espermatozóides com integridade de membrana, apresentando uma melhora (P<0,05) quando comparado as amostras após o descongelamento (70% e 40,6%, respectivamente). Tabela 2: Avaliação espermática do vigor, motilidade total (MOT), motilidade progressiva (M. PROG), concentração (CONC) e integridade espermática pelo teste Hiposmótico (THO) do sêmen submetido ao gradiente de BSA. SÊMEN Após descongelamento VIGOR MOT M. PROG CONC THO (0-5) (%) (%) (x 10 6 esptz/ml) (%) 3,0 a 62,3 A 12,0 a 48,3 A 40,6 a 1º sobrenadante 3,7 a 71,0 A 33,0 ab 6,7 B 70 b 2º sobrenadante 3,7 a 58,6 A 31,3 ab 7,9 B 70 b 3º sobrenadante 3,7 a 66,7 A 40,3 ab 7,5 B 70 b 4º sobrenadante 4,0 a 79,3 A 54,3 b 1,8 B 70 b Médias com letras iguais não diferem pelo Teste de Tukey (α<0,05). Na Tabela 3, quando se comparou as médias gerais entre os dois métodos (gradiente de Percoll X migração ascendente em BSA), a diferença observada foi em relação à concentração espermática recuperada, a centrifugação em gradiente de Percoll (61,67 x 10 6 sptz/ml) apresentou uma média maior (P<0,05) que a migração ascendente em BSA (14,4 x 10 6 sptz/ml). Por outro lado, as características de vigor, motilidade total e progressiva não apresentaram diferença significativa entre os espermatozóides recuperados em ambos os métodos de separação. No teste Hiposmótico, o gradiente descontínuo de Percoll foi superior (P<0,05) a migração ascendente em BSA (78,7% e 70%, respectivamente) em separar espermatozóides com integridade de membrana. Tabela 3: Avaliação do vigor, motilidade total (MOT), motilidade progressiva (M. PROG), concentração (CONC) e integridade de membrana pelo teste Hiposmótico (THO) dos espermatozóides selecionados pelos métodos gradiente de Percoll e migração ascendente em BSA. TRATAMENTO VIGOR MOT M. PROG CONC THO (0-5) (%) (%) (x 10 6 esptz/ml) (%) Percoll 3,7 a 77,7 A 28,5 a 61,7 A 78,7 a BSA 3,6 a 67,6 A 34,2 a 14,4 B 70,0 b Médias com letras iguais não diferem pelo Teste de Tukey (α<0,05). DISCUSSÃO Dentre os métodos de separação espermática a centrifugação em gradiente de Percoll e migração ascendente swim-up são os mais utilizados atualmente na fertilização in vitro. No presente estudo optou-se em utilizar o gradiente de Percoll para ser comparado com a migração ascendente em BSA pela sua praticidade, menor tempo de execução e necessidade da etapa de centrifugação, a qual pode causar danos aos espermatozóides (MATÁS et al., 2007). Com objetivo de contornar esta dificuldade e preservar ao máximo a integridade espermática, foram feitas modificações no protocolo do gradiente de Percoll tradicional, reduzindo o volume das camadas de Percoll e diminuindo o tempo de centrifugação, este método é denominado Mini-Percoll e já vem sendo proposto por algumas empresas fornecedoras de sêmen sexado. Buscando preservar ao máximo a integridade dos espermatozóides recuperados, o método de separação espermática por migração ascendente em BSA não utilizou a etapa de centrifugação no seu protocolo. Os resultados do estudo comparando as amostras seminais antes e após os métodos de separação espermática demonstraram que ambos os métodos foram efetivos em selecionar espermatozóides com melhor vigor, moti- NÚMERO 6-7 / ABRIL - DICIEMBRE DE 2007 / R EVISTA SPEI DOMUS 41

Avaliação dos espermatozóides recuperados comparando duas metodologias de separação espermática lidade total e motilidade progressiva. Os espermatozóides recuperados pelo gradiente de Percoll apresentaram valores de motilidade total superiores (P<0,05) em relação às amostras após o descongelamento. Baseado na centrifugação e utilizando a força centrífuga (gravidade) para selecionar os espermatozóides, o gradiente de Percoll demonstrou a capacidade de selecionar espermatozóides com integridade de membrana. Em relação à migração ascendente em BSA observou um aumento (P<0,05) na motilidade progressiva dos espermatozóides recuperados quando comparado com as amostras iniciais. Este aumento esta relacionado com o princípio de separação espermática no qual o método se baseia, onde os espermatozóides para serem separados, além de motilidade funcional, devem apresentar uma motilidade progressiva. Essa melhora na motilidade espermática após a separação pelo gradiente de BSA também foi observada em um estudo de Perrone & Testart (1985) com espermatozóides de humanos. O gradiente de Percoll foi superior na concentração espermática recuperada pelo seu princípio de separação que se baseia na força centrífuga (gravidade), enquanto o gradiente de BSA separa espermatozóides apenas com motilidade funcional, ou seja, somente aqueles que conseguirem passar pelas camadas de BSA, resultando em uma baixa concentração final, porém com espermatozóides de boa qualidade. Estienne et al., (1987) trabalhando com espermatozóides de bovinos, relataram a baixa concentração espermática recuperada após a separação pelo gradiente descontínuo de BSA, o que está de acordo com o presente estudo, onde o gradiente de Percoll foi superior à migração ascendente em BSA (61,67 x 10 6 sptz/ml e 14,4 x 10 6 sptz/ml, respectivamente). Martí et al. (2006), trabalhando com diferentes métodos para separar espermatozóides de ovinos, também observaram a superioridade do Percoll em recuperar uma maior concentração espermática. Sabendo-se da importância da integridade da membrana plasmática e do potencial mitocondrial dos espermatozóides para que ocorra a fertilização, com posse dos resultados, observou-se que ambos os métodos foram eficientes, separando espermatozóides de melhor qualidade quando comparados com as amostras iniciais logo após o descongelamento. No THO, o gradiente de Percoll foi superior a migração ascendente em BSA em recuperar espermatozóides com integridade de membrana (78,67% e 70%, respectivamente). A força de centrifugação presente no gradiente de Percoll induz a seleção de espermatozóides com membrana plasmática íntegra sem levar em consideração o potencial mitocondrial. Porém, os resultados apresentados demonstraram que a migração ascendente em BSA foi superior em separar espermatozóides com motilidade funcional. Jefrey et al. (1998), já haviam recuperado espermatozóides de humanos com boa motilidade funcional através da separação espermática em gradiente de HSA (Albumina Sérica Humana), em estudo comparando outras metodologias de separação com o gradiente de Percoll. Através desse estudo, podemos concluir que ambos os métodos foram efetivos na separação de espermatozóides bovinos sendo o gradiente de Percoll superior. A baixa concentração espermática das amostras selecionadas pela migração ascendente em BSA pode comprometer sua utilização. Porém, é necessário investigar se a qualidade das células presentes nas amostras resgatadas poderia compensar a baixa concentração espermática. Além das avaliações feitas seria indicado um teste de fertilização in vitro, para analisar a capacidade fecundante dos espermatozóides selecionados em ambos os métodos. AGRADECIMENTOS Em especial a Mauricio Mogollon e Profº Reginaldo Fontes, pela amizade e colaboração nesse estudo e a todos os funcionários do Setor de Reprodução de Ruminantes do Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA Chamberland, A.; Fournier, V.; S. Tardif, S.; Stard, M. A.; Sullivan, R.; Barley, J. L. (2001). The effects of heparin on motility parameters and protein phosphorylation during bovine sperm capacitation. Theriogenology, v. 55 p. 823-835. 42 R EVISTA SPEI DOMUS / NÚMERO 6-7 / ABRIL - DICIEMBRE DE 2007

Leonni Dascani Zini Moreira, Reginaldo da Silva Fontes y Héctor Javier Narvaez Estienne, M.J. Knight, M.J., Beal, W.E. (1987). Isolation of a population of intact, highly-motile porcine spermatozoa using a discontinuous bovine serum albumin gradient. Theriogenology, 29:771-778. Jefrey, S.; Armstrong; Mahadevan Rajasekaran; Wayne, J.H.; And Suresh C.S. (1998). Antioxidant potencial of human serum albumin: role in the recovery of high quality human spermatozoa for assisted reproductive technology. Journal of Andrology, 19:412-419. Martí, E.; Pérez-Pé, R.; Muiño-Blanco, T.; Cebrián-Pérez, A. (2006). Comparative study of Four Different Sperm Washing Methods Using Apoptotic Markers in Ram Spermatozoa; Journal of Andrology, 27(6):746-53. Matás, C.; Decuadro, G.; Martý Nez-Miro, S.; Gadea, J. (2007). Evaluation of a cushioned method for centrifugation and processing for freezing boar semen. Theriogenology, V. 67, p. 1087-1091. Perrone D, Testart I. (1985). Use of bovine serum albumin column to improve sperm selection for human in vitro fertilization. Fertil Steril, 44: 839-841. NÚMERO 6-7 / ABRIL - DICIEMBRE DE 2007 / R EVISTA SPEI DOMUS 43