Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento JULIANA LOUZADA MEDEIROS

Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento JULIANA LOUZADA MEDEIROS ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA REPARAÇÃO TECIDUAL EM DORSO DE RATOS APÓS INCISÃO COM LASER DE DIODO (?970 nm) OU LASER CO 2 (?10600 nm), ASSOCIADO OU NÃO À FOTOBIOMODULAÇÃO LASER (?655 nm) OU LUZ POLARIZADA (?400-2000 nm) São José dos Campos 2008

Juliana Louzada Medeiros ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA REPARAÇÃO TECIDUAL EM DORSO DE RATOS APÓS INCISÃO COM LASER DE DIODO (?970 nm) OU LASER CO 2 (?10600 nm), ASSOCIADO OU NÃO À FOTOBIOMODULAÇÃO LASER (?655 nm) OU LUZ POLARIZADA (?400-2000 nm) Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientadores: Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro e Profª. Drª. Renata Amadei Nicolau São José dos Campos, SP 2008

M439a Medeiros, Juliana Louzada Análise histológica comparativa da reparação tecidual em dorso de ratos após incisão cori laser de diodo (1970 nm) ou laser coz (:10600 nm), associadou não à fotobiomodulação laser (1655 rrm) ou luz pclarizada (1400-2000 nm)i Juliana Louzada Medeiros; Orientadores Profs.Drs. Antonio Luiz Barbosa Pinheiro; Renata Amadei Nicolau. São José dos CamPos, 2008' 1 Disco laser: Color Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenhária Biomédica do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, 2008. 1. Cicatrização de feridas 2. Laseres 3. Fototerapia l. Pinheiro, Antonio Luiã Barbosa Orient ll. Nicolau, Renata Amadei, Üo-orlenX' lll' Título CDU:616-003.9 Autorizo exclusivamente para Íins acadêmicos e científicos, a ÍeproduçãCI total ou parcial desta dissertação, por processo fotocopiadores oli transrnissão eletrônica, desde que citada a fonte. Assinatura da aluna: Ã"^*"' *'*- ü Data: -2) cs I -'a

JULIANA LOUZADA MEDEIROS O'ANÁIISE HISTOIÓCICA COMPARATIVA DA REPARAçÃO TTCTï}UAI ' EM DORSO DE RATOS ApÓS rncisão COM LASBR DE DIODO (1970 nm) ou LASER COz (110600 nm)' ASsocrADo ou NÃo A FoToBIoMoDULAçÃo LASER (1655 nm) a\j LÍJT' p6larizada (1400-2000 nm)" Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da universidade do vale do Pataiba,São José dos campos, SP' pela seguinte banca examinadora: Profl. Dra. RENATA AMADEI NICOLAU GrNIV Prof. Dr. ANTONIO LAIZBARBOSA PINHEIRO (UNIV Prof. Dra. ESTER MARIA DANIELLI NICOLA GrNIC Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco Diretor do IP&D - UniVaP São José dos Campos,22 de agosto de 2008'

Dedico este trabalho ao meu marido Johnny por estar sempre ao meu lado, principalmente, nos momentos mais difíceis e a minha mãe Sueli, por compreender tantas ausências e me incentivar a sempre seguir em frente.

AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por tantos ensinamentos ao longo de todo este período e por me dar a força necessária para superar cada dificuldade. Agradeço ao Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro, pela forma brilhante com que soube conduzir todo este estudo, sempre me incentivando e me apoiando nos momentos adequados. Sinto-me honrada em tê-lo tido como orientador. A Profª Drª Renata Amadei Nicolau por todas as oportunidades de crescimento pessoal e profissional e toda estrutura laboratorial que me foi oferecida. A Profª Drª Cibelle Barbosa Lopes, da Universidade do Vale do Paraíba, que gentilmente disponibilizou o laser de diodo para a fototerapia experimental. Ao Dr. Edmyr Rosa dos Reis do núcleo de medicina e cirurgia experimental da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, pelo apoio e colaboração na cirurgia experimental com o laser de CO 2. Agradeço ao biólogo Rogrigo Ferreira de Oliveira, bolsista de apoio técnico II (FAPESB) do Hospital Universitário Prof. Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia pelo excelente trabalho realizado na reação imunohistoquímica. Ao Prof. Dr. Jean Nunes dos Santos da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, por toda ajuda e orientação durante a fase de análise histológica. A Profª Adna Conceição Barros, da disciplina de patologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, por toda colaboração nas fotomicrografias. Agradeço a Profª Drª Ester Maria Danielli Nicola da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, pela extrema colaboração. Agradeço a Capes-prosup pelo suporte financeiro. Agradeço também a todos os colegas da Universidade do Vale do Paraíba que se dispuseram a ajudar durante todo o período experimental.

ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA REPARAÇÃO TECIDUAL EM DORSO DE RATOS APÓS INCISÃO COM LASER DE DIODO (?970 nm) OU LASER CO 2 (?10600 nm), ASSOCIADO OU NÃO À FOTOBIOMODULAÇÃO LASER (?655 nm) OU LUZ POLARIZADA (?400-2000 nm) RESUMO O processo de reparo tecidual de uma ferida cutânea realizada com laser cirúrgico, é mais complexo que em incisões com bisturi convencional, devido à área de necrose térmica formada mediante o emprego de laser. O presente estudo tem por objetivo analisar o efeito de duas fototerapias, laser e luz polarizada em incisões cutâneas feitas com laser de CO 2 (?10600 nm) ou com laser de diodo (?970 nm) em dorso de ratos. O experimento utilizou 62 animais divididos em seis grupos. Todos os animais receberam incisão em pele de dorso, com medidas aproximadas de 20 mm X 2 mm de profundidade. Três grupos tiveram a incisão realizada com laser de CO 2 (GI, GII, GIII) e três grupos com o laser de diodo (GIV, GV, GVI). Os grupos GI e GIV foram mantidos como controle e não receberam tratamento adicional por fototerapia. Os grupos GII e GV receberam fotobiomodulação laser (λ655nm, 30 mw, φ ~ 3 mm, 12 J/cm 2 ). Os grupos GIII e GVI receberam tratamento com luz polarizada (λ400-2000 nm, 40 mw, φ ~ 5,5 cm, 12 J/cm 2 ). Os animais foram sacrificados imediatamente, sete e 14 dias após a cirurgia. As amostras foram rotineiramente processadas e coradas com H&E, Picrosirius e reação imunohistoquímica com Monoclonal Anti- Actin, a-smooth Muscle. Os resultados deste estudo demonstraram um maior atraso de regeneração epitelial das incisões realizadas com laser de diodo, sem associação à fototerapia, quando comparadas às incisões realizadas com laser de CO 2, com número significativamente menor de miofibroblastos, principalmente no processo inicial de reparação. As incisões com laser de CO 2 responderam melhor à iluminação de luz polarizada, com uma reepitelização mais avançada aos sete dias de cirurgia. As incisões com laser de diodo responderam melhor à iluminação de luz polarizada, com incrementos significativos na quantidade de fibras colágenas, número de miofibroblastos e um processo de reepitelização mais avançado aos 14 dias de cirurgia. Palavras chave: reparação tecidual, diodo (?970 nm), CO 2 (?10600 nm), fotobiomodulação laser (?655 nm), luz polarizada (?400-2000 nm).

COMPARATIVE HISTOLOGICAL ANALYSIS OF TISSUE REPAIR IN DORSUM RATS AFTER INCISION WITH DIODE LASER (?970 nm) OR CO 2 LASER (?10600 nm), ASSOCIATED OR NOT LASER PHOTOBIOMODULATION (?655 nm) OR POLARIZED LIGHT (?400-2000 nm) ABSTRACT The tissue repair process of the laser wounds is more complex than incisions with conventional scalpel due to the thermal damage that follows irradiation of living tissues. The aim of this study is to analyze the effect of two phototherapy, laser and polarized light on CO 2 laser (?10600 nm) or diode laser (?970 nm) wound. The experiment used sixty-two Wistar rats divided in six groups, with incision of 20 mm x 2 mm created on the dorsum. Three groups had the incision treated with CO 2 laser (GI, GII, GIII) and three groups with the diode laser (GIV, GV, GVI). The groups GI and GIV were maintained as control group. The groups GII and GV received additional treatment of diode laser (λ655 nm, 30mW, φ ~ 3mm, 12 J/cm 2 ) and groups GIII and GVI were illuminated with polarized light (λ400 2000 nm, 40 mw, φ ~ 5.5cm, 12 J/cm 2 ). The animals were sacrificed 0, 7 and 14 days after the surgery. The specimens were taken and routinely processed and stained with Hematoxylin and Eosin, Sirius Red, and alpha-smooth Muscle Actin (asma). The results of this study demonstrated a delay in epithelial regeneration of incisions with diode laser, without association to phototherapy, when compared to incisions with CO 2 laser. The number of miofibroblasts present in diode laser wound was smaller than CO 2 laser wound. The illumination of polarized light in the CO 2 laser wound showed a better result at 7 days after surgery with a quicken reepitheliazation. The illumination of polarized light in the diode laser wound showed a better result at 14 days after surgery with significant increment in the quantity of collagen fibers, miofibroblastic proliferation and quicken reepitheliazation process. Keywords: tissue repair, diode (?970 nm), CO 2 (?10600 nm), laser photobiomodulation (?655 nm), polarized light (?400-2000 nm).

Índice de figuras e quadros Quadro 1: Grupos e subgrupos experimentais (LOUZADA, 2008)... 28 Quadro 2: Critério utilizado para análise histológica por microscopia óptica... 33 Quadro 3: Sumário das análises semi qualitativa e semi quantitativa. (LOUZADA, 2008)... 52 Figura 1: Procedimento cirúrgico com laser de CO 2 (LOUZADA, 2008)... 30 Figura 2: Procedimento cirúrgico com laser de diodo (LOUZADA, 2008)... 30 Figura 3: Fotobiomodulação laser (LOUZADA, 2008)... 30 Figura 4: Iluminação com luz polarizada (LOUZADA, 2008)... 30 Figura 5: Fotografia realizada imediatamente após a cirurgia com laser de CO 2 (LOUZADA, 2008).. 35 Figura 6: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO 2, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 7: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO 2, com FBML (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 8: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO 2 e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 9: Fotografia realizada imediatamente após cirurgia com laser de diodo (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 10: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 11: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, com FBML (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 12: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008)... 35 Figura 13: Aspecto da ferida aos 14 dias pós-incisão com laser de CO 2, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008)... 36 Figura 14: Aspecto da ferida realizada com laser de CO 2 aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008)... 36 Figura 15: Aspecto da ferida realizada com laser de CO 2 aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008)... 36 Figura 16: Aspecto da ferida aos 14 dias pós-incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008)... 36 Figura 17: Aspecto da ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008)... 36 Figura 18: Aspecto da ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008)... 36 Figura 19: Fotomicrografia do grupo GI (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área de necrose estendendo-se da supefície epitelial até a derme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 100X). (LOUZADA, 2008)... 38 Figura 20: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias) mostrando tecido de granulação e ausência de reepitelização (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 38 Figura 21: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou uma presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 39 Figura 22: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias) mostrou pavimentação epitelial completa (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 41 Figura 23: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou miofibroblastos apresentando-se de maneira moderada (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 41 Figura 24: Fotomicrografia do grupo GIII (14 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 42 Figura 25: Fotomicrografia do grupo GIV (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área de necrose estendendo-se da superfície epitelial até a hipoderme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 40X). (LOUZADA, 2008)... 43

Figura 26: Fotomicrografia do grupo GIV (7 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou uma presença discreta de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 44 Figura 27: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrando início de migração epitelial e correspondeu a uma área menor que 50% da ferida em (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 44 Figura 28: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrou presença marcante de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 45 Figura 29: Fotomicrografia do grupo GV (7 dias) mostrou discreta presença de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 46 Figura 30: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou reepitelização recobrindo uma área maior que 50% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)... 47 Figura 31: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 47 Figura 32: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou moderada deposição de fibras colágenas (Picrosirius; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 49 Figura 33: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou uma presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X ). (LOUZADA, 2008)... 49 Figura 34: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou características de reepitelização avançadas recobrindo 100% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 50 Figura 35: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou intensa deposição de fibras colágenas (Picrosirius; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)... 50 Figura 36: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X ). (LOUZADA, 2008)... 51 Figura 37: Reepitelização das feridas aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 57 Figura 38: Reepitelização das feridas aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 57 Figura 39: Infiltrado inflamatório aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 58 Figura 40: Infiltrado inflamatório aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 58 Figura 41: Presença de tecido de granulação aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 59 Figura 42: Presença de tecido de granulação aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 59 Figura 43: Neovascularização aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 60 Figura 44: Neovascularização aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 60 Figura 45: Presença de fibroblastos aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 61 Figura 46: Presença de fibroblastos aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 61 Figura 47: Deposição de fibras colágenas aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 62 Figura 48: Deposição de fibras colágenas aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 62 Figura 49: Presença de miofibroblastos aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)... 63 Figura 50: Presença de miofibroblastos aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 63

Lista de abreviaturas e siglas µm Micrometro CO 2 Dióxido de Carbono COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal g Gramas He Hélio ml Mililitro mm Milímetros N 2 nm PO W J cm 2 cm mw FBML Nitrogênio Nanometro Pós-operatório Watts Joule Centímetro quadrado Centímetro Milliwatt Fotobiomodulação Laser

Lista de símbolos λ Comprimento de onda (lambda) Marca registrada ~ Aproximadamente φ Diâmetro C Grau Celsius

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 20 2 REVISÃO DE LITERATURA... 21 2.1 Cicatrização de feridas... 21 2.2 Fototerapia... 22 2.2.1 Cirúrgica... 22 2.2.1.1 Laser cirúrgico de CO 2... 22 2.2.1.2 Diodo... 23 2.2.2 Não Cirúrgica... 23 3 OBJETIVOS... 25 4 MÉTODOS... 26 4.1 Aspectos éticos... 26 4.2 Animais... 26 4.3 Equipamentos... 26 4.3.1 Equipamentos para realização da ferida cirúrgica... 27 4.3.2 Equipamentos para fototerapia... 27 4.4 Grupos Experimentais... 27 4.5 Procedimento Cirúrgico... 28 4.6 Fototerapia... 29 4.7 Morte Animal e obtenção das amostras... 30 4.8 Preparação das lâminas para análise histológica... 31 4.9 Critérios para análise histológica das amostras... 31 5 RESULTADOS... 34 5.1 Evolução macroscópica... 34 5.2 Análise microscópica... 36 5.3 Análise estatística... 54 6 DISCUSSÃO... 64 7 Conclusão... 69 ANEXO A: Comitê de Ética em Pesquisa... 76

20 1 INTRODUÇÃO É crescente a utilização de fontes de luz mono e policromáticas em especialidades médicas e odontológicas. Estudos da interação da energia eletromagnética com os tecidos vivos, operando tanto em altas quanto em baixas potências, vêm demonstrando resultados positivos e vantagens sobre métodos terapêuticos convencionais. 1,2,3,4,5,6,7 Laseres operando em alta potência são descritos como instrumentos precisos em incisões cirúrgicas, principalmente na Dermatologia, Oftalmologia, Cirurgia Geral e Cirurgia Oral. Estudos descrevem diferentes tipos de laseres, como eficazes em procedimentos cirúrgicos, entre eles o laser de CO 2 e o laser de diodo. 1,2,8,9 As desvantagens deste tipo de terapia são os efeitos térmicos causados pelas altas densidades de energia utilizadas, que podem interferir diretamente no processo de cicatrização. A fim de reduzir os efeitos negativos, a fotobiomodulação laser (FBML) pode ser associada às cirurgias realizadas com alta potência. Laseres operando em baixas potências atuam como antiinflamatório, analgésico e tem ação biomoduladora. A ação este tipo de terapia se baseia na capacidade dos tecidos biológicos em absorver energia luminosa transformando-a em energia útil para células, com incrementos na produção de ATP e conseqüente aceleração de processos metabólicos. 10,11,12,13,14 A FBML se apresenta como uma forma de tratamento sem efeitos colaterais e normalmente é bem tolerada pelos pacientes. Atualmente, estudos divergem sobre o verdadeiro valor da coerência da luz em fototerapia, para se alcançar resultados benéficos na modulação de processos biológicos e autores relatam que fontes de luz não coerentes mono e policromáticas produzem efeitos similares ao da luz laser com efeitos positivos na biomodulação tecidual. 15,16,17,5,18 O restrito número de trabalhos realizados sobre o emprego da fototerapia com fontes de luz coerente comparadas a não coerente em feridas cirúrgicas realizadas com laseres justificam novos estudos nesta área.

21 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Cicatrização de feridas A cicatrização de feridas é um processo dinâmico que envolve diversas respostas teciduais e sua evolução passa por uma série de acontecimentos interrelacionados e superpostos, que vão determinando gradualmente a substituição do tecido lesado por um tecido conjuntivo vascularizado, o tecido de granulação. 19,1,3,20 A ferida é definida como a solução de continuidade anatômica ou funcional do tecido, seguida de dano e morte celular na região em decorrência de trauma mecânico, físico ou térmico; 19 e dependendo do grau de destruição do tecido pode apresentar seu processo cicatricial por primeira ou segunda intenção. 19,3;21,2,1 O processo primário se refere a feridas incisionais e acontecem de maneira mais favorável, devido ao limitado número de células lesadas e bordas coaptadas. Já os ferimentos que apresentam suas margens separadas e têm perda excessiva de tecido, como no caso da cicatrização por segunda intenção, apresentam um processo reparacional mais complexo, com uma quantidade maior de tecido de granulação. 19 A cicatrização por segunda intenção baseia seu processo de reparação no fenômeno da contração da ferida, diminuindo a extensão dos tecidos conectivos envolvidos e os miofibroblastos, são as células apontadas como responsáveis por tal contração. 22,23, 21 Miofibroblastos são células originadas de fibroblastos diferenciados que apresentam características de células musculares lisas. 19 Como o processo reparacional de feridas é um mecanismo dinâmico que requer a participação de várias linhagens celulares e pode ser influenciado por uma série de fatores locais ou sistêmicos que podem acelerar ou retardar a cicatrização, o conhecimento dos possíveis efeitos dos métodos terapêuticos utilizados é de fundamental importância para o sucesso de seu tratamento. 5,24,25,26

22 2.2 Fototerapia 2.2.1 Cirúrgica Laseres operando em alta potência tem alto poder de corte e a ablação acontece devido a absorção do comprimento de onda empregado pelos tecidos biológicos. 26,25,9 A energia térmica absorvida é também responsável pela denaturação de proteínas tissulares em células circundantes promovendo a obliteração de vasos de calibre igual ou inferior a 0,5 mm com coagulação instantânea do sangue, 26 fato que o torna um excelente instrumento para pacientes com distúrbios de coagulação e sangramento excessivo. 3 Além disso, tem poder antibacteriano devido às altas temperaturas empregadas. 27 As vantagens da utilização dos laseres operando em alta potência em relação aos métodos cirúrgicos convencionais são a fotocoagulação, diminuição do edema pós-operatório devido à pequena manipulação da área, precisão cirúrgica, facilidade de acesso ao campo operatório e diminuição do tempo cirúrgico. 3,8,2,1 Porém, o uso de altas densidades de energia pode levar ao acúmulo de calor e conseqüente dano térmico as estruturas adjacentes à ferida interferindo diretamente no processo de 28,29, 9,1 cicatrização. Como os efeitos dos lasers em tecidos moles variam de acordo com a potência e densidades de energia utilizadas é importante o conhecimento das características de cada tipo, visando minimizar a agressão tecidual e conseqüentes danos que poderiam levar a um retardo acentuado do processo de reparação.26,25,9,1 2.2.1.1 Laser cirúrgico de CO 2 O laser de CO 2 é uma mistura de gases de CO 2, N 2 e He cujo comprimento de onda é de 10600 nm na faixa espectral infravermelha. 30

23 Laseres de CO 2 apresentam alta absorção pela água fato que restringe sua absorção a camadas mais superficiais, com zonas de danos térmicas mais estreitas e controladas. 30,31 Como todos os tecidos humanos possuem grande quantidade de água, o laser de CO 2 tem sua energia bem absorvida por todos os tipos de tecido e provocando mínima condução térmica para os tecidos adjacentes. Sua absorção é rápida e superficial, tornando-o um instrumento eficaz para cortes precisos. 30,1,9 2.2.1.2 Diodo Os primeiros trabalhos com laseres de diodo operando em alta potência em tecidos moles surgiram na década de 90. A penetração de seus feixes é mais profunda que a penetração dos feixes de CO 2, devido à transparência de seu comprimento de onda pela água e alta absorção pela hemoglobina e melanina. 32,1 O laser de diodo por sua propriedade de condução por fibra óptica, é utilizado em locais não acessíveis a outros tipos de laser como o de CO 2. e possui excelente capacidade de coagulação. 3,26 Os comprimentos de onda de 810 nm e 980 nm são recomendados nas cirurgias de tecidos moles, periimplantar e pré-protética. 9,28,8 2.2.2 Não Cirúrgica A modulação de processos biológicos através da aplicação de luz, é vastamente descrita na literatura. Diversos comprimentos de ondas, tanto na faixa espectral visível como infravermelha vem sendo utilizados como método terapêutico para tratamento de patologias inflamatórias, 33,7,34 redução de edemas, controle de quadros álgicos, 6 prevenção de infecções 27 e otimização do processo de reparação tecidual. 35,33,5,20 A radiação de ondas eletromagnéticas em tecidos vivos, quando utilizada em doses adequadas, 5,51,53 é caracterizada por sua capacidade de normalizar ou modular atividades celulares através de alterações físicas e/ou químicas no fotorreceptor molecular e componentes da cadeia respiratória, principalmente em

24 células que sofreram stress. 36,10,12,11,13 Os efeitos deste tipo de terapia não causam danos celulares nos tecidos irradiados por não apresentarem características térmicas. 37,38,12 Atualmente, diferentes fontes de luz mono e policromáticas estão sendo utilizadas como método terapêutico nas diversas especialidades médicas e odontológicas.

25 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Avaliar, histologicamente, o processo de reparo em feridas cirúrgicas realizadas com laser de CO 2 (?10600 nm) ou com laser de diodo (?970 nm) associado ou não ao uso da fotobiomodulação laser e da luz polarizada. 3.2 Objetivos Específicos Avaliar histologicamente o efeito da fotobiomodulação laser (?655 nm) e da fototerapia com luz polarizada (?400 2000 nm) em feridas cirúrgicas realizadas com laser de CO 2 (?10600 nm); Avaliar histologicamente o efeito da fotobiomodulação laser (?655 nm) e da fototerapia com luz polarizada (?400-2000) em feridas cirúrgicas realizadas com laser de diodo (?970 nm).

26 4 MÉTODOS 4.1 Aspectos éticos Este estudo seguiu os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal COBEA, sendo aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade do Vale do Paraíba (CEP UNIVAP) sob protocolo Nº: A043/CEP/2007. 4.2 Animais Utilizou-se neste estudo 62 ratos, albinos, machos, jovens, linhagem Wistar (~350 g, ~ 90 dias, Biotério da Anilab, Paulínia, São Paulo). Os animais foram mantidos no Biotério do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba em gaiolas apropriadas de polietileno padrão, em grupos aleatórios de cinco animais por gaiola, com acesso a água e ração ad libitum. A sala foi mantida com temperatura constante (24 C) e com ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais permaneceram por um período de ambientação de 15 dias no biotério de passagem do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba antes do inicio do experimento. 4.3 Equipamentos Para realização do presente estudo foram utilizados dois laseres operando em alta potência, um laser operando em baixa potência e um equipamento de luz não coerente polarizada.

27 4.3.1 Equipamentos para realização da ferida cirúrgica - Laser de CO 2 (λ10600 nm, 8 W, φ ~ 0.3 mm, Union Medical, modelo UM- L30), procedente da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP; - Laser de diodo (λ970 nm, 4 W, com fibra óptica de 320 µm, Sirona ), procedente do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da UNIVAP. 4.3.2 Equipamentos para fototerapia - Laser de diodo (λ655 nm, 30 mw, φ ~ 3 mm, Kondortech, São Carlos, SP, Brasil), pertencente a Profª Drª Cibelle Barbosa Lopes; - Luz polarizada policromática não coerente (λ400-2000 nm, 40 mw, φ ~ 5,5 cm, Bioptron, Suíça), procedente da Faculdade de Odontologia da UFBA. 4.4 Grupos Experimentais Os 62 animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos (Quadro 1). Três grupos tiveram a pele do dorso incisionada com laser de CO 2 (Grupos I, II e III) e três grupos tiveram a pele do dorso incisionada com laser de diodo (Grupos IV,V e VI). Dos grupos onde a incisão foi realizada com laser de CO 2, o grupo I foi considerado o grupo controle, ou seja, aquele que não recebeu nenhum tratamento adicional após a cirurgia. Este grupo foi subdividido em outros três: morte animal imediatamente após a cirurgia (n=5), morte aos sete dias após a cirurgia (n=3) e morte aos 14 dias após a cirurgia (n=3). O grupo II recebeu a FBML de 48 em 48 horas até o dia do sacrifício e foi subdividido em morte animal com sete dias do pósoperatório (n=5) e 14 dias do pós-operatório (n=5). O grupo III recebeu iluminação

28 com luz polarizada diariamente até a morte animal e foi subdividido em morte animal com sete dias de pós-operatório (n=5) e 14 dias de pós-operatório (n=5). Dos grupos incisionados com laser de diodo, o grupo IV foi o grupo controle, subdividido em outros três: morte animal imediatamente após a cirurgia (n=5), morte aos sete dias após a cirurgia (n=3) e morte aos 14 dias após a cirurgia (n=3). O grupo V foi fotoirradiado de 48 em 48 horas até o dia do sacrifício, subdividido em morte animal com sete (n=5) e 14 (n=5) dias do pós-operatório. O grupo VI foi iluminado diariamente até a morte animal, subdividido em morte animal com sete dias de pós-operatório (n=5) e 14 dias de pós-operatório (n=5). Quadro 1: Grupos e subgrupos experimentais (LOUZADA, 2008) GRUPO SUBGRUPOS FERIDA (dias de morte N CIRÚRGICA animal) I 0, 7 e 14 11 Laser CO 2 (λ=10600 nm) II 7 e 14 10 Laser CO 2 (λ=10600 nm) III 7 e 14 10 Laser CO 2 (λ=10600 nm) IV 0, 7 e 14 11 Laser de diodo (λ=970nm) V 7 e 14 10 Laser de diodo (λ=970nm) VI 7 e 14 10 Laser de diodo (λ=970nm) TRATAMENTO - Laser (λ=655 nm) Luz polarizada (λ=400-2000 nm) - Laser (λ=655 nm) Luz polarizada (λ=400-2000 nm) 4.5 Procedimento Cirúrgico Foi realizada uma incisão em pele de dorso, com medidas aproximadas de 20 mm X 2 mm de profundidade, para ambos os laseres. Todos os animais receberam, por via subcutânea, um pré-tratamento com Atropina (1%, 20 ml, Fagra, 0,04 ml/100 g), aguardando repouso de 15 minutos para o procedimento anestésico 39. A droga anestésica foi administrada em associação por via intramuscular de Cloridrato de Cetamina (10%,10 ml, Syntec, 0,1 ml/100 g) e Cloridrato de Xilazina (2%,10ml, Syntec, 0,1 ml/100 g, 40 com a utilização de seringa de insulina de 1ml para cada animal. Em seguida a região dorsal foi tricotomizada em uma área de 80 cm 2. Para a realização das feridas cirúrgicas foram utilizados os laseres de CO 2 (Fig.1) e de

29 diodo (Fig. 2). Após a cirurgia os animais foram submetidos à profilaxia antibiótica com o uso de Pentabiótico (Fort Dodge, 0,02 ml/100 g). O procedimento experimental teve início no período da manhã e todos os animais receberam a mesma manipulação. 4.6 Fototerapia Para o procedimento terapêutico, os animais foram posicionados decúbito dorsal e imobilizados manualmente. Os grupos submetidos à fototerapia com laser foram irradiados duas horas após a cirurgia e de 48 em 48 horas até o sacrifício. A irradiação foi realizada de maneira pontual em seis pontos ao redor da ferida com laser de diodo (λ655 nm, 30 mw, φ ~ 3 mm, Kondortech, São Carlos, SP, Brasil, 2 J/cm 2 por ponto, dose total de 12 J/cm 2, Fig. 3). Os iluminados com luz polarizada receberam tratamento diário durante cinco minutos (λ400-2000 nm, 40 mw, φ ~ 5,5 cm, Bioptron, Suíça, distância focal de 10 cm, dose total de 12 J/cm 2, Fig. 4).

30 Figura 1: Procedimento cirúrgico com laser de CO 2 (LOUZADA, 2008) Figura 2: Procedimento cirúrgico com laser de diodo (LOUZADA, 2008) Figura 3: Fotobiomodulação laser (LOUZADA, 2008) Figura 4: Iluminação com luz polarizada (LOUZADA, 2008) 4.7 Morte Animal e obtenção das amostras Para a morte animal foi utilizada o mesmo pré-tratamento e administração de drogas anestésica do dia do procedimento cirúrgico. Depois de anestesiados os

31 animais receberam por via intracardíaca a aplicação do anestésico Tiopental Sódico (0,05 ml/100 g, Cristália ) seguido de aplicação de cloreto de potássio (1ml). Uma área de 16 cm 2 ao redor da ferida cirúrgica foi removida e fixada em solução de formol a 10% por 24 horas e posteriormente encaminhado para processamento histológico. 4.8 Preparação das lâminas para análise histológica Os cortes histológicos correspondentes à região da ferida foram semiseriados, no sentido transversal. As amostras foram rotineiramente processadas em parafina, cortadas em secções de 5 µm de espessura para coloração com Hematoxilina-eosina e Picrosirius e de 3 µm para a reação com a Alfa actina de músculo liso (Monoclonal Anti-Actin, a-smooth Muscle, Sigma-Aldrich ). Para reação de imunohistoquímica as lâminas foram silanizadas, desparafinizadas, foi procedido o bloqueio da peroxidase endógena e marcação do corte com caneta Dako Pen para incubação do anticorpo primário (a-smooth Muscle Actin). O anticorpo foi utilizado com diluição de 1:100, sem recuperação antigênica. Em uma segunda etapa foi realizado a incubação do anticorpo secundário com aplicação do complexo streptoavidina através do Kit LSAB 2 (Streptoavidina-biotina-peroxidase, Dako Cytomation ). A reação foi revelada pelo líquido DAB (diaminobenzidina, Dako Cytomation ). A contracoloração foi realizada com hematoxilina de Harris. O procedimento foi realizado no Hospital Universitário Prof. Edgard Santos. da Universidade Federal da Bahia. 4.9 Critérios para análise histológica das amostras Análises descritivas e semi-quantitativas foram realizadas através do microscópio óptico (AxioLab Zeiss ) da Faculdade de Odontologia da Universidade

32 Federal da Bahia, quanto à presença de reepitelização, infiltrado inflamatório, tecido de granulação, neoangiogênese e fibroblastos, para os espécimes corados com HE. O Picrossirius foi utilizado para descrição de fibras colágenas e o anticorpo de actina de músculo liso para avaliação dos miofibroblastos. Os critérios de avaliação deste estudo podem ser vistos no quadro 2. A análise estatística foi realizada através do teste exato de Fisher com grau de significância de p 0,05. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para identificação estatística da tendência de desempenho do grupo como um todo.

Quadro 2: Critério utilizado para análise histológica por microscopia óptica 33 Critério Reepitelização Inflamação aguda Inflamação crônica Inflamação mista Tecido de granulação AUSENTE DISCRETA Presença de < 25% de neutrórilos entre as células presentes na área correspondente a ferida DISCRETA Presença de < 25% de células inflamatórias crônicas na área correspondente a ferida DISCRETA Presença de < 25% de leucócitos mono e polimorfonucleares na área correspondente a ferida DISCRETA Discreta presença de fibroblastos. Fibras colágenas e celulas inflamatórias. Marcação PRESENTE Recobrindo < 50% da ferida PRESENTE Recobrindo > 50% da ferida PRESENTE Recobrindo 100% da ferida com espessura irregular PRESENTE Recobrindo 100% da ferida com espessura irregular MODERADA Presença de 25-50% de neutrórilos entre as células presentes na área correspondente a ferida MODERADA Presença de 25-50% de células inflamatórias crônicas na área correspondente a ferida MODERADA Presença de 25-50% de leucócitos mono e polimorfonucleares na área correspondente a ferida MODERADA Moderada presença de fibroblastos. Fibras colágenas e celulas inflamatórias. INTENSA Presença de > 50% de neutrórilos entre as células presentes na área correspondente a ferida INTENSA Presença de > 50% de células inflamatórias crônicas na área correspondente a ferida INTENSA Presença de > 50% de leucócitos mono e polimorfonucleares na área correspondente a ferida MARCANTE Intensa presença de fibroblastos. Fibras colágenas e celulas inflamatórias. Neovascularização Presença de fibroblastos Fibras colágenas Presença de miofibroblastos DISCRETA Quantidade de neovasos menor do que observado tecido adjacente saudável. DISCRETA Presença de < 25% de fibrolastos jovens e menos diferenciados que outros tipos celulares. DISCRETA Menos marcado por picrosirius vermelho que o tecido adjacente saudável. DISCRETA Presença de < 25% de células alfa actina positivas, excluindo-se parede de vasos sanguíneos e pequenos lúmen na área correspondente a ferida. MODERADA INTENSA Quantidade de neovasos similar ao observa Quantidade de neovasos maior do no tecido adjacente saudável. que observado no tecido adjacente saudável. MODERADA Presença de 25-50% de fibrolastos jovens e menos diferenciados que outros tipos celulares. MODERADA Marcação por picrosirius vermelho similar ao tecido adjacente saudável. MODERADA Presença de 25-50% de células alfa actina positivas, excluindo-se parede de vasos sanguíneos e pequenos lúmen na área correspondente a ferida. MARCANTE Presença de > 50% de fibrolastos jovens e menos diferenciados que outros tipos celulares. INTENSA Mais marcado por picrosirius vermelho que o tecido adjacente saudável. MARCANTE Presença de > 50% de células alfa actina positivas, excluindo-se parede de vasos sanguíneos e pequenos lúmen na área correspondente a ferida.

34 5 RESULTADOS 5.1 Evolução macroscópica A avaliação macroscópica das feridas feitas com o laser de CO 2 (grupo I) mostrou uma área carbonizada ao redor da ferida com ausência total de sangramento imediatamente após a cirurgia (Fig. 5). Aos sete dias pós-operatório (PO) foi observada a presença de uma crosta na superfície da ferida na maioria dos animais (Fig. 6). A associação da FBML neste tipo de incisão (grupo II), causou diferenças clínicas nos animais quando comparados aos animais do grupo controle (grupo I), com um aspecto de cicatrização mais avançado (Fig. 7). Contudo, no grupo iluminado com luz polarizada (grupo III), observou-se presença de bordas mais regulares e uma redução da ferida aos sete dias PO, quando comparado ao grupo controle ou ao que recebeu FBML (Fig. 8). Aos 14 dias PO as feridas apresentavam características semelhantes em todos os grupos (Fig. 13,14 e 15). No grupo incisionado com laser de diodo (grupo IV) observou-se, imediatamente após a cirurgia, aspecto semelhante ao grupo incisionado com laser de CO 2, com área carbonizada e ausência de sangramento (Fig. 9). Porém, uma área edemaciada foi observada ao redor da ferida algumas horas após a incisão e esta permaneceu até aproximadamente o sexto dia PO (Fig. 10). A evolução clínica deste grupo se deu com uma maior necrose na área adjacente à da ferida percebida a partir do segundo dia PO que evoluiu até aproximadamente o quarto dia PO. As feridas que receberam FBML (grupo V) não apresentaram sinais de evolução de necrose ao redor da ferida, assim como menor área edemaciada (Fig. 11). Nas feridas iluminadas com luz polarizada (grupo VI) os resultados foram semelhantes ao laser, porém observou-se uma pequena área de necrose ao redor da incisão nos primeiros dias PO, contudo, menor que o grupo que não recebeu tratamento (grupo IV, Fig. 12). Aos 14 dias observou-se redução da ferida, em relação ao grupo controle (Fig. 16), nos grupos que receberam tanto FBML (grupo V, Fig. 17) quanto à iluminação com luz polarizada (grupo VI, Fig. 18).

35 Figura 5: Fotografia realizada imediatamente após a cirurgia com laser de CO 2 (LOUZADA, 2008) Figura 6: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO 2, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) Figura 7: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO 2, com FBML (LOUZADA, 2008) Figura 8: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO2 e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008) Figura 9: Fotografia realizada imediatamente após cirurgia com laser de diodo (LOUZADA, 2008) Figura 10: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) Figura 11: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, com FBML (LOUZADA, 2008) Figura 12: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008)

36 Figura 13: Aspecto da ferida aos 14 dias pós - incisão com laser de CO 2, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) Figura 14: Aspecto da ferida realizada com laser de CO2 aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008) Figura 15: Aspecto da ferida realizada com laser de CO 2 aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008) Figura 16: Aspecto da ferida aos 14 dias pós - incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) Figura 17: Aspecto da ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008) Figura 18: Aspecto da ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008) 5.2 Análise microscópica Grupo I No grupo controle onde a ferida foi realizada com laser de CO 2 e o sacrifício foi imediato, em 100% dos espécimes observou-se uma área de necrose tecidual que se estendia da superfície epitelial até a derme. Nesta área observou-se total inviabilidade celular e presença de núcleos picnóticos residuais. Os anexos cutâneos também se apresentavam inviáveis (Fig. 19). A marcação por Picrosirius mostrou a presença de fibras colágenas, com feixes dispostos paralelamente à superfície, distantes da área de necrose.

37 Aos sete dias pós-operatório (PO) observou-se a presença de uma extensa úlcera recoberta por crosta espessa, ao lado de remanescente de tecido necrótico; além disso, observou-se ausência de reepitelização na maioria dos casos (66,67%), e em 33,3% dos animais verificou-se que a ferida estava recoberta em uma proporção menor que 50% de sua extensão (Fig. 20). Adicionalmente, o tecido conjuntivo subjacente apresentava um discreto infiltrado inflamatório crônico em 33,37% dos espécimes, inflamação mista discreta em 33,3%, e inflamação aguda moderada em outros 33,3% dos espécimes. O tecido de granulação, rico em vasos sanguíneos, apresentava-se de forma marcante em 66,67% dos casos, com presença marcante de fibroblastos em meio à intensa deposição de fibras colágenas localizadas paralelas à superfície da ferida. A imunomarcação com a-smooth Muscle Actin mostrou uma quantidade moderada de miofibroblastos distribuidos na área adjacente à ferida em 100% dos animais (Fig. 21). Aos 14 dias PO foi observada a presença de uma ulceração recoberta por crosta espessa com remanescente de tecido necrótico. Foi detectada uma migração epitelial em estágio inicial recobrindo uma pequena área (< 50% da ferida). Foi observada a presença de infiltrado inflamatório crônico discreto em 66,67% e infiltrado misto discreto em 33,3% dos casos; uma quantidade moderada de tecido de granulação bem vascularizado e; uma marcante presença de fibroblastos. A marcação por picrosirius mostrou uma intensa deposição de fibras colágenas. Estes dois últimos elementos descritos estavam dispostos paralelamente à superfície da ferida. Observou-se marcante presença de miofibroblastos em 100% dos casos.

38 Figura 19: Fotomicrografia do grupo GI (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área de necrose estendendo-se da supefície epitelial até a derme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 100X). (LOUZADA, 2008) Figura 20: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias) mostrando tecido de granulação e ausência de reepitelização (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)

39 Figura 21: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou uma presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) Grupo II A FBML na região da ferida realizada com laser de CO 2 mostrou aos sete dias PO, a presença de uma úlcera recoberta por crosta não espessa com área de necrose residual na superfície. Um animal não apresentou necrose residual. Quanto ao revestimento epitelial, foi observada migração epitelial em 40% dos casos, com recobrimento de uma pequena área da ferida, porém, nos 60% dos casos restantes a reepitelização apresentou-se ausente. A inflamação foi discreta, aguda ou crônica na maioria dos animais, sendo que dois animais apresentaram inflamação mista. Um marcante tecido de granulação, ora organizado ora desorganizado, altamente neovascularizado também pode ser observado neste tempo; assim como a presença marcante de fibroblastos em meio à discreta deposição de fibras colágenas. Os miofibroblastos apresentaram-se de maneira moderada em 80% dos casos. Aos 14 dias, 60% dos casos apresentaram recobrimento epitelial correspondendo a uma área menor que 50% da ferida; em 20% foi observada uma área maior que 50% da ferida e em 20% a migração epitelial foi completa. Em adição, a presença de infiltrado inflamatório crônico foi predominantemente moderado, com uma

40 quantidade marcante tecido de granulação moderadamente vascularizado. De permeio, foi observada marcante presença de fibroblastos e uma quantidade moderada de fibras colágenas. Os miofibroblastos apresentaram-se de maneira marcante na área adjacente à incisão em 60% dos casos e de maneira moderada em 40% dos casos. Grupo III Aos sete dias foi observada a presença predominante de úlcera recoberta por crosta espessa, com remanescentes de tecido necrótico. Migração epitelial completa foi observada em 40% dos casos e recobrindo uma área menor que 50% da ferida em 40% dos casos (Fig. 22). Um animal não apresentou sinais de reepitelização (20% dos casos). A presença de um infiltrado inflamatório crônico discreto foi observada em 40% dos espécimes e moderado em outros 20%. A presença de inflamação aguda também foi observada em 20% dos casos, assim como uma inflamação mista moderada em outros 20%. O tecido de granulação mostrou-se marcante e altamente vascularizado. Os fibroblastos apresentaram-se de maneira marcante e localizados paralelamente à superfície da ferida, em meio a uma discreta deposição de fibras colágenas. Os miofibroblastos apresentaram-se de maneira discreta em 40% dos casos e moderada em outros 40% (Fig. 23). Aos 14 dias observou-se predominantemente a presença de uma úlcera recoberta por necrose fibrinóide, com migração epitelial recobrindo uma área menor que 50% da ferida em 80% dos casos, bem como recobrimento maior que 50% em 20% dos animais. Estava presente um infiltrado inflamatório crônico que variou de moderado a intenso, com marcante tecido de granulação moderadamente vascularizado. Presença marcante de fibroblastos e moderada quantidade de fibras colágenas também puderam ser vistos neste tempo e estavam dispostos paralelos à superfície da ferida. Em 100% dos casos os miofibroblastos se apresentavam de forma marcante (Fig. 24).

41 Figura 22: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias) mostrou pavimentação epitelial completa (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) Figura 23: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou miofibroblastos apresentando-se de maneira moderada (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)

42 Figura 24: Fotomicrografia do grupo GIII (14 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) Grupo IV Nas feridas cirúrgicas realizadas com laser de diodo com sacrifício imediato observou-se área de necrose tecidual que se estendia da superfície até a hipoderme; presença de alguns núcleos picnóticos residuais; fibras colágenas localizadas distante do local da ferida (Fig. 25). Aos sete dias PO, observou-se extensa ulceração recoberta por uma crosta espessa. A reepitelização estava ausente em 100% dos casos. Evidenciou-se a discreta presença de infiltrado inflamatório que se apresentou ora agudo ora crônico ou misto. Outro aspecto freqüente foi a presença de um marcante tecido de granulação, que se mostro u rico em vasos sanguíneos. Adicionalmente foi observada uma presença marcante de fibroblastos e intensa deposição de fibras colágenas. Os miofibroblastos apareceram de forma discreta em 100% dos casos (Fig. 26). Aos 14 dias PO, observou-se uma úlcera recoberta por uma crosta espessa com reepitelização ausente em 33,3% dos casos. Quando o revestimento epitelial estava presente, recobria uma área menor que 50% da ferida em 66,67% dos casos (Fig. 27).

43 Observou-se também um infiltrado inflamatório discreto ora agudo, ora crônico ou misto, com uma presença moderada de tecido de granulação, moderadamente vascularizado. De permeio, observou-se uma presença marcante de fibroblastos e uma intensa deposição de fibras colágenas. Na maioria dos casos, foi notada presença marcante de miofibroblastos (66,67%) e uma presença moderada foi observada em 33,3% dos casos (Fig. 28). Figura 25: Fotomicrografia do grupo GIV (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área de necrose estendendo-se da superfície epitelial até a hipoderme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 40X). (LOUZADA, 2008)

44 Figura 26: Fotomicrografia do grupo GIV (7 dias). A imunomarcação por a-sma mostrou uma presença discreta de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) Figura 27: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrando início de migração epitelial e correspondeu a uma área menor que 50% da ferida em (Hematoxilina - eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)

45 Figura 28: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrou presença marcante de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) Grupo V Nos casos no qual a FBML foi utilizada em ferida cirúrgica realizada com laser de diodo, observou-se ora a presença de uma úlcera revestida por crosta de espessura variável ora somente crosta irregular com presença de remanecentes de tecido necrótico. A reepitelização foi ausente em 100% dos animais. O infiltrado inflamatório variou de discreto a moderado e pode ser classificado ora como agudo; crônico; ou misto. Marcante presença de tecido de granulação com neovascularização de moderada a intensa; marcante presença de fibroblastos, organizando-se paralelamente à superfície; em meio à moderada quantidade de fibras colágenas também foi observada neste estágio. Evidenciou-se também uma discreta presença de miofibroblastos em 100% dos animais (Fig. 29). Aos 14 dias observou-se presença de uma crosta de espessura variável e predomínio de uma discreta inflamação crônica de celularidade mista. A reepitelização se apresentou ausente em 20% dos casos, presente recobrindo uma área menor que 50% da ferida em 40% dos casos, recobrindo uma área maior que 50% da ferida em

46 20% dos casos e recobrindo 100% da ferida em outros 20% (Fig. 30). O tecido de granulação apresentou-se discreto ou marcante e apresentou moderada neovascularização. De permeio, havia presença marcante de fibroblastos e uma marcação moderada de fibras colágenas. Miofibroblastos se apresentaram de maneira moderada em 80% dos animais (Fig. 31). Figura 29: Fotomicrografia do grupo GV (7 dias) mostrou discreta presença de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)

47 Figura 30: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou reepitelização recobrindo uma área maior que 50% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) Figura 31: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)

48 Grupo VI No grupo iluminado com luz polarizada, aos sete dias, observou-se a presença de uma crosta espessa com remanescente de tecido necrótico em 60% dos espécimes e úlcera extensa recoberta por crosta em outros 40%. A reepitelização estava ausente em 80% dos casos e presente recobrindo área menor que 50% da ferida em 20% dos casos. Infiltrado inflamatório foi predominantemente discreto, ora crônico, ora de celularidade mista. A presença de tecido de granulação moderadamente vascularizado foi marcante. De permeio, notou-se a presença marcante de fibroblastos e moderada deposição de fibras colágenas (Fig. 32). Os miofibroblastos se apresentaram de forma moderada em 80% dos casos (Fig. 33). Observou-se a presença de edema intersticial em alguns espécimes. Aos 14 dias, 60% dos espécimes mostraram a presença de crosta. A reepitelização aconteceu recobrindo 100% da ferida em 60% dos casos, recobrindo mais que 50% da ferida em 20% dos casos e recobrindo menos que 50% da ferida em 20% dos casos (Fig. 34). Observou-se uma presença moderada de tecido de granulação o qual era moderadamente vascularizado; e o infiltrado inflamatório foi discreto predominantemente crônico em 60%. De permeio, evidenciou-se uma marcante presença de fibroblastos e intensa deposição de fibras colágenas (Fig. 35), ambos distribuídos paralelamente à superfície. Os miofibroblastos se apresentaram de forma marcante em 80% dos casos (Fig. 36). Um resumo dos resultados pode ser visto no Quadro 3.

49 Figura 32: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou moderada deposição de fibras colágenas (Picrosirius; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) Figura 33: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou uma presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X ). (LOUZADA, 2008)

50 Figura 34: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou características de reepitelização avançadas recobrindo 100% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) Figura 35: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou intensa deposição de fibras colágenas (Picrosirius; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)

Figura 36: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X ). (LOUZADA, 2008) 51