ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE ESPÉCIES VEGETAIS DO TOCANTINS Tallyta Santos Teixeira¹; Luiz Gustavo de Lima Guimarães 2 1 Aluna do Curso de Engenharia Biotecnológica e Bioprocessos; Campus de Gurupi; e-mail: tallyta.teixeira@uft.edu.br; PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Engenharia Biotecnológica e Bioprocessos; Campus de Gurupi; e-mail: lgguimaraes@mail. uft.edu.br RESUMO A atividade antioxidante e o teor de fenóis e flavonoides de extratos etanólicos de 10 espécies de plantas medicinais do cerrado tocantinense. A parte da planta utilizada foram as folhas, exceto para espécie Buchenavia tomentosa, da qual utilizou-se a casca. A determinação do teor de compostos fenólicos (mg de ácido gálico/g de extrato) foi realizada pelo método espectrofotométrico de Folin- Ciocateau no qual obteve-se os melhores resultados para as espécies de Buchenavia, seguidas pelos dois químiotipos de Lippia sidoides. O teor de flavonoides (mg de quercetina/g de extrato) foi determinado pelo método espectrofotométrico no qual as espécies de Lippia sidoides, apresentaram o melhores resultados, seguidas das espécies de Buchenavia. A atividade antioxidante foi avaliada em relação à neutralização do radical livre DPPH (g de extrato/ g de DPPH), na qual as espécies de Buchenavia, seguida das espécies de Lippia sidoides foram as plantas medicinais que apresentaram resultados mais expressivos, sendo necessários menos de 35 g dos extratos de ambas as espécies para neutralizar 1 g de DPPH. Todas as análises estatísticas foram feitas utilizando o Teste de Scott-Knott (5%) para comparar os efeitos médios e por meio do programa SISVAR. Palavras-chave: Plantas medicinais; Compostos fenólicos; Flavonoides; Atividade Antioxidante. INTRODUÇÃO Os oxidantes e os radicais livres são compostos produzidos normalmente pelo corpo através da oxidação. Porém, se estes compostos provenientes da oxidação não forem controlados podem causar sérios danos no organismo, tais como inativação enzimática, mutação, ruptura de membrana, aumento na aterogenicidade de lipoproteínas plasmáticas de baixa densidade e até morte celular. Os antioxidantes são largamente utilizados na medicina, cosméticos e indústria alimentícia, porém alguns estudos verificaram que os antioxidantes sintéticos possuem potencial carcinogênico e para outras patologias (BOTTERWECK et al., 2000). Óleos essenciais e extratos de plantas têm sido estudados para verificar seu uso como uma maneira alternativa na prevenção de doenças infecciosas e também sua utilização na preservação de
alimentos, protegendo-os contra os efeitos tóxicos de agentes oxidantes, agindo como antioxidantes naturais (REBELO et al., 2009). Assim, as plantas merecem destaque por serem uma importante fonte de moléculas bioativas para descoberta de novos fármacos (DHANANI et al., 2013). Como o Brasil possui áreas com uma rica diversidade de plantas nativas, sendo o Cerrado uma vegetação de relevância neste cenário (NETO & MORAIS, 2003). O Tocantins, estado cuja vegetação típica é o Cerrado, merece bastante atenção visto que possui diversas espécies de plantas, que apesar de muitas delas serem utilizadas pela população local, ainda não tiveram seu potencial terapêutico estudado. Devido à grande importância das substâncias antioxidantes, este estudo tem por objetivo verificar a atividade antioxidante e quantificar os teores de compostos fenólicos e flavonoides em extratos etanólicos obtidos de plantas medicinais coletadas no estado do Tocantins. MATERIAL E MÉTODOS Coleta e extração dos Extratos Vegetais Foram coletadas 10 espécies de planta do cerrado do Tocantins (região Norte), que são utilizadas pela medicina popular regional. As espécies estudadas foram: Buchenavia tomentosa, Buchenavia tetraphylla, Mentha pulegium, Lippia sidoides quimiotipo timol e carvacrol, Brosimum gaudichaudii Trec, Cissus sicyoides L., Acmella oleracea, Fridericia chica e Hyptis sp. Após as coletas, os materiais vegetais foram encaminhadas para o Laboratório de Química do Campus de Gurupi UFT, onde foram secas à sombra em temperatura ambiente, cortadas e submetidas a extrações com etanol a frio, utilizando 100 g de planta para 2,0 litros de solvente por extração num período de 7 dias. Após, a mistura foi filtrada e evaporada sob pressão reduzida, para a obtenção dos extratos (COSTA et al., 2008). E em seguida os extratos foram liofilizados e para as análises foram preparadas soluções dos extratos (1:1 etanol/água) na concentração de 1g/L (1000ppm), sendo depois diluídos nas concentrações necessárias para cada análise espectrofotométrica. Teor de compostos fenólicos totais O teor de compostos fenólicos foi determinado pelo método espectrofotométrico de Folin- Ciocateau utilizando o ácido gálico como padrão de referência. Em um tubo de ensaio adicionou-se 50 µl da solução do extrato, 5mL de água destilada, 500 µl do reagente Folin-Ciocateau (1 M) e 500 µl de carbonato de sódio 20 % (m/v). O experimento foi feito em triplicata e as leituras foram realizadas após 1 hora de incubação no escuro, em espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 765 nm. Foi feita uma curva analítica contendo 10, 25, 50, 75 e 100 ppm de ácido gálico e os resultados foram expressos em mg ácido gálico/ g de extrato (Adaptado de ZHOU et al., 2009).
Teor de flavonoides totais O teor de flavonoides foi determinado por método espectrofotométrico utilizando a quercetina como padrão de referência. Em um tubo de ensaio adicionou-se de 500 µl do extrato, 4,3 ml de etanol, 100 µl de nitrato de alumínio 10% (m/v) e 100 µl de acetato de sódio 1 M. O experimento foi realizado em triplicata e as leituras foram feitas após 40 minutos de incubação no escuro, em espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 415 nm. Foi feita uma curva analítica contendo 5, 10, 25, 50, 75 e 100 ppm de quercetina e os resultados foram expressos em mg de quercetina/ g de extrato (CARPES et al., 2008). Atividade antioxidante pelo método de sequestro de radical livre DPPH A partir da solução dos extratos na concentração de 1g/L, preparou-se soluções dos extratos com diferentes diluições. Em ambiente escuro, transferiu-se uma alíquota de 0,1 ml de cada diluição do extrato para tubos de ensaio e adicionou-se com 3,9 ml da solução do radical DPPH 60 µm. Para o controle adicionou-se 0,1 ml de etanol e 3,9 ml do radical DPPH, homogeneizando a solução obtida. As leituras (515 nm) foram monitoradas a cada minuto, onde se observou a redução da absorbância até sua estabilização (tempo EC50), determinando o tempo de reação do extrato de cada planta. Depois de determinado o tempo EC50, a leitura da absorbância final das cinco diluições de cada planta foi feita para o cálculo posterior do EC50. As leituras das amostras foram acompanhadas da leitura inicial do controle. Para obtenção da curva analítica de DPPH, transferiu-se, em ambiente escuro, uma alíquota de aproximadamente, 4 ml de cada solução de DPPH (de concentração 10 µm, 20 µm, 30 µm, 40 µm, 50 µm e 60 µm) para cubetas de vidro. Utilizou-se álcool metílico, como branco, para calibrar o espectrofotômetro e os resultados foram expressos em g de extrato/ g de DPPH (Adaptado de MOURA-RUFINO et al., 2007). Análise estatística O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com três repetições. Foram feitas as análises de variância, para verificar a influência da espécie vegetal sobre os teores de compostos e da atividade antioxidante. Utilizou-se o Teste de Scott-Knott (5%) para comparar os efeitos médios. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa SISVAR (FERREIRA, 2011). RESULTADOS E DISCUSSÕES Os teores de flavonoides, compostos fenólicos e a atividade antioxidante dos extratos das dez espécies vegetais estudadas encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Valores médios do teor de flavonoides, compostos fenólicos e da atividade antioxidante de dez plantas medicinais. Plantas Teor de flavonoides (mg de quercetina/ g de extrato) Teor de fenóis (mg de ácido gálico/g de extrato) Atividade antioxidante (g de DPPH/ g de extrato) Buchenavia macrophilla 23,63 ± 2,28d 360,28 ± 17,35g 17,03 ± 0,67a Buchenavia tomentosa 41,22 ± 1,47e 330,65 ± 8,49f 18,90 ± 0,02ab Lippia sidoides(carvacrol) 61,04 ± 2,94f 280,28 ± 4,81e 23,75 ± 0,84ab Lippia sidoides(timol) 87,52 ± 2,43g 238,61± 4,81d 34,47 ± 2,17b Mentha pulegium 15,48 ± 1,43c 109,15 ± 7,56c 104,94 ± 0,43c Fridericia chica 6,13 ± 0,75ab 117,29 ± 6,42c 204,73 ± 1,59d Cissus sicyoides L 10,59 ± 1,22b 41,50 ± 1,11a 248,32 ± 4,90e Brosimum gaudichaudii 9,46 ± 0,70ab 75,05 ± 4,39b 279,94 ± 3,07f Hyptis sp 7,74 ± 0,39ab 48,78 ±0,00a 286,46 ± 6,67f Acmella oleracea 5,09 ± 0,35a 37,06 ± 2,89a 455,60 ± 14,95g Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P = 0,05). De acordo com os resultados, observa-se que a espécie Lippia sidoides, apresentou teor de flavonoides superior ás demais plantas, sendo o quimiotipo timol superior ao carvacrol. Segundo Gomes et al. (2011) a planta Lippia sidoides possui diversos fitoconstituintes, no qual os flavonoides cirsimaritina, luteolina, flavona, quercetina e taxifolina foram identificadas nesta espécie. As espécies do gênero Buchenavia também se destacaram quanto á quantidade de teor de flavonoides totais, tendo Buchenavia tomentosa uma quantidade ainda mais expressiva do que a Buchenavia macrophilla. De acordo com os resultados obtidos pela análise do teor de compostos fenólicos, observou-se que as espécies de Buchenavia foram as plantas que apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos, seguidas pelos dois químiotipos de Lippia sidoides. Em relação à atividade antioxidante, avaliada pelo método de neutralização do radical DPPH, verificou-se que dentre todas as plantas estudadas a espécie Buchenavia macrophilla apresentou maior atividade antioxidante. As espécies Buchenavia tomentosa, Lippia sidoides (carvacrol) e Lippia sidoides (timol) foram outras espécies que também se destacaram quanto à atividade antioxidante, sendo necessários menos de 35 g dos extratos de ambas as espécies para neutralizar 1 g de DPPH. Observou-se ainda que quanto maior o teor de fenóis, maior foi a atividade antioxidante analisada pelo método de sequestro de radicais livre. Diante de tais resultados é possível concluir que plantas que apresentam teores consideráveis de compostos fenólicos e flavonoides, apresentam maiores atividades antioxidantes pelo método de neutralização do radical estável DPPH. O estudo também demonstrou o potencial das espécies de
Buchenavia, conhecidas popularmente como mirindiba, como fonte de compostos fenólicos, flavonoides e com alto potencial antioxidante. LITERATURA CITADA BOTTERWECK, A. A. M. et al. Intake of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene and stomach cancer risck: Results from analyses in the Netherlands cohort study. Food and Chem. Toxicol., Oxford, v. 38, n. 7, p. 599-605, 2000. CARPES, S.T. et al. Avaliação do potencial antioxidante do pólen apícola produzido na região Sul do Brasil. Quim. Nova, v.31, n.7, p.1660-1664, 2008. COSTA, F. J. et al. Constituintes Químicos de Vernonia chalybaea Mart. Quim. Nova, v.31, n.7, p.1691-1695, 2008. DHANANI, T. et al. Effect of extraction methods on yield, phytochemical constituents and antioxidant activity of Withania somnifera. Arabian Journal of Chemistry, 2013, p. 1-7. FERREIRA, D. F. Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciênc. e Agrotecnol. v. 35, n. 6, p. 1039-1042, 2011. GOMES, S. V. F.; NOGUEIRA, P. C. L.; MORAES, V. R. S. Aspectos químicos e biológicos do gênero Lippia enfatizando Lippia gracilis Schauer. Eclét. Quim. São Paulo. v. 36, n. 1, 2011, p. 64-77. MOURA-RUFINO, M. S. et al. Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPH. Embrapa - Comunicado Técnico, 127, Fortaleza, Julho, 2007. NETO, G. G.; MORAIS, R. G. Recursos medicinais de espécies do Cerrado de Mato Grosso: um estudo bibliográfico. Acta bot. bras., n. 17, v. 4, p. 561-584, 2003. REBELO, M.M. et al. Antioxidant capacity and biological activity of essential oil and methanol extract of Hyptis crenata Pohl ex Benth. Journal of Pharmacognosy. Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian. v.19, n.1b, p.230-235, 2009. ZHOU, S. et al. Phenolics and antioxidante properties of bayberry (Myrica rubra Sieb. Et Zucc.) pomace. Food Chem. v. 112, p. 395. 2009. AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil e da Universidade Federal do Tocantins (UFT).