ATIVIDADE AMILÁSICA DE LINHAGENS DE LEVEDURAS

ATIVIDADE AMILÁSICA DE LINHAGENS DE LEVEDURAS Luana Cristina Paludo 1 ; Solange Cristina Carreiro 2 ; 1 Aluno do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; e-mail: luana_cpaludo@hotmail.com PIVIC/UFT 2 Orientadora do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; e-mail: solange@mail.uft.edu.br RESUMO As amilases têm ganhado cada vez mais mercado em função da sua capacidade de hidrolisar amido de diferentes fontes, além destas enzimas apresentam grande importância industrial em diferentes vertentes. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade amilolásica de duas das linhagens quanto à atividade enzimática de α-amilase e glicoamilase. Linhagens TAQ 46 e TAQ 647 foram incubadas em caldo sabouraud-glicose a 30 C por 24 horas, logo após as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante foi descartado e a biomassa foi pesada; 10g/L desta biomassa foi adicionada em cada elernmeyers contendo um dos tipos de amido (amido solúvel, de milho e de batata-doce), acrescidos de 0,5% de extrato de levedura. Estas amostras foram incubadas a 30 e 40 C por 96 horas. Após incubação, 50 ml das amostras foram centrifugadas a 3800rpm/ 40 minutos para separação da biomassa e o sobrenadantes (extrato Enzimático Bruto EEB) foi separado e utilizado para avaliar a atividade de α-amilase e glicoamilase, utilizando como temperatura de reação 30, 40 e 60 C. A linhagem TAQ 46 apresentou melhor produção de alfa-amilase em meio contendo amido de milho; A temperatura de incubação não influenciou a atividade amilásica e a melhora temperatura de reação entre 30 e 40 C. Em contrapartida linhagem TAQ 647 apresentou melhor atividade em amido de batata-doce; com temperatura de incubação de 40 C enquanto as temperaturas de reação não influenciaram a produção da enzima. Estas linhagens não apresentaram resultados para produção de glicoamilase Palavra-chave: Amido; Amilases; Leveduras; Enzimas; α-amilase; glicoamilase. INTRODUÇÃO As amilases, enzimas que degradam o amido, apresentam grande importância biotecnológica em diversas áreas, tais como nas indústrias de papel, têxteis e celulose, de couro, detergentes, cervejas, bebidas destiladas, cereais para a alimentação de crianças, panificação, liquefação e sacarificação do amido, entre outros, segundo Gupta et al. (2003, apud, BASTOS, 2011) e Pandey et al. (2005). As enzimas amilolíticas podem ser utilizadas de diversas formas com o objetivo de modificar matérias-primas amiláceas e/ou obter produtos específicos, principalmente quando falamos no uso na Página 1

indústria de alimentos para a modificação de farinhas utilizadas em panificação, na modificação enzimática de materiais amiláceos para a fabricação de bebidas fermentadas e para a obtenção de açúcares (SPIER et al, 2004). Para que isto ocorra é necessário que sejam analisados diferentes fatores, principalmente sobre a natureza do substrato e as condições ambientais, para a escolha da linhagem e microrganismo adequados para a finalidade requerida (PANDEY et al,1999). Analisando todo este contexto esta pesquisa teve o intuito de avaliar a capacidade de leveduras selvagens na produção de enzimas amilolíticas. MATERIAL E MÉTODOS As linhagens foram repicadas em Agar Sabouraud glicose por um período de 48 horas a 25 C. Após esse período duas alçadas foram transferidas para o caldo Sabouraud-glicose (3%), incubado sob agitação de 200 rpm, a 30 C, por 24 horas. Após este período a biomassa foi separada por centrifugação (3800 rpm por 40 minutos); a concentração inicial de células para todos os experimentos foi de aproximadamente 10 g/l (massa úmida). Os ensaios para avaliação da produção de amilases foram realizados em meio líquido contendo 5% de amido (solúvel, de milho e de batata-doce) e 0,5% de extrato de levedura. Os frascos foram incubados a 30 o e 40 o durante 96 horas. As amostras foram centrifugadas (3800 rpm por 40 minutos), a biomassa foi separada e o sobrenadante (EXTRATO ENZIMÁTICO BRUTO EEB) foi utilizado para a quantificação das atividades enzimáticas em 3 temperaturas de incubação: 30, 40 e 60 C. Todos os ensaios foram realizados em três repetições. Para a determinação da atividade α-amilasíca foi avaliada a redução do complexo amido-iodo, utilizado o método descrito por Fuwa (1954). Foi utilizado 1mL de solução amido 0,5% em tampão acetato ph 5,5 e 1mL de extrato enzimático bruto ( EEB). A mistura reacional foi incubada em banhomaria a 30 C, 40 C e 60 C por 60 minutos. Após, as amostras foram diluídas 10 vezes; 200µL do meio reacional foram adicionados a 200µL de ácido acético (1M), 4,4 ml de água destilada e 200µL da solução de iodo/iodeto (1% iodo em etanol absoluto, 10% iodeto de potássio e água destilada na proporção de (1v: 1v: 3v)) em tubos de ensaio. A mistura foi então homogeneizada e a absorbância determinada a 660 nm. A atividade de glicoamilase foi determinada pela quantificação de AR (açúcar redutor) liberado após a reação, utilizando-se o método colorimétrico de DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico) descrito por Página 2

Miller (1959). O meio reacional foi composto por 1 ml de amido 0,5%, em tampão acetato com ph 5,5, 1 ml do extrato enzimático bruto. Esta mistura reacional foi incubada em banho-maria à 30 C, 40 C e 60 C por 30 minutos. A 1 ml do meio reacional foi adicionado a 1 ml da solução de DNS e os tubos de ensaio foram fervidos por 5 minutos. Após fervura foram adicionados aos tubos 10 ml de água destilada e estes foram homogeneizados e a absorbância lida no espectrofotômetro a 540 nm. Para cada linhagem foi realizado um experimento fatorial 2x3x3, combinando as 2 temperaturas de incubação (I 1 e I 2 ), os 3 tipos de amidos (A 1, A 2 e A 3 ) e as 3 temperaturas de reação (T 1, T 2 e T 3 ), o que resultou em 18 tratamentos. Os resultados foram avaliados através da análie de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. RESULTADOS E DISCUSSÃO A tabela 1 mostra os valores obtidos para a atividade de alfa-amilase pelas duas linhagens estudadas, TAQ 46 e TAQ 647. Tabela 1: Atividade de alfa-amilase (U/mL) para as linhagens testadas. Médias de 3 repetições. Para a linhagem TAQ 46 o melhor resultado da atividade da alfa-amilase foi obtido em amido de milho. A temperatura de incubação não influenciou significativamente a atividade amilásica, enquanto que a melhor temperatura de reação foi entre 30 e 40 C, Já para a linhagem TAQ 647 a melhor temperatura de incubação para a produção de α-amilase foi a de 40 C, no meio contendo amido de batata-doce. As temperaturas de reação não influenciaram significativamente a produção de alfa-amilase. Segundo Rocha (2007), o tamanho dos grânulos do amido influencia diretamente na ação enzimática, independendo da variedade estudada, quanto menor o grânulo maior a suscetibilidade ao ataque enzimático. Está suscetibilidade enzimática segundo Li et al.(2004) parece estar relacionada principalmente à maior área superficial desses grânulos do que por exemplo ao seu teor de amilose Página 3

(LI et al., 2004). Estes resultados e análises explicariam a divergência dos meios ideais que houve para as linhagens analisadas, levando em consideração que cada levedura teve maior interação com um tipo de amido diferente, com diferença estrutural, pois os amidos diferem em função Da sua origem. Segundo Costa et al. (2011), o tempo de máxima produção da enzima α-amilase foi de 48 horas, em contra partida Marques et al. (2013), observaram que com 96 horas a levedura Saccharomyces cerevisiae CENPK2 consumiu praticamente todo o amido do meio, sendo estipulado 96 horas como tempo ideal, assim como para as linhagens aqui estudadas e as linhagens estudadas por Arraes (2009). Isto mostra que o tempo de incubação influencia a produção e hidrólise enzimática, onde para algumas o período curto pode não resultar na máxima síntese de enzimas amilolíticas, já que as leveduras podem ainda estar se adaptando ao meio e suas condições e um período demasiadamente longo pode esgotar os nutrientes, acarretando no declínio da produção enzimática. O tempo ideal é uma característica especifica para cada linhagem (GARCIA, 2013). Segundo Costa (1996), a temperatura ótima para a atividade de α-amilase para certos tipos de fungos é entre 25 a 37 C sofrendo uma variação conforme a espécie, característica também observada para as leveduras isoladas de folhas em decomposição. As duas linhagens avaliadas não foram capazes de produzir quantidades significativas de glicoamilase nos ensaios realizados com a metodologia proposta. Esta baixa capacidade está de acordo com os resultados encontrados por Costa et al. (2011) que utilizaram linhagens isoladas de batata-doce e Arraes (2009) que utilizou linhagens de Candida homilentoma provenientes de ninhos de formigas cortadeiras, cujas linhagens também apresentaram baixa ou quase nula produção desse tipo de enzima. LITERATURA CITADA ARRAES, A.A.; ABREU-LIMA, T. L.; CARREIRO, S. C.Utilização de leveduras amilolíticas para a produção de hidrolisado de farinha de batata-doce. V Seminário de Iniciação Científica da UFT, Universidade Federal do Tocantins, Campus de Palmas, Palmas, Tocantins, 2009. COSTA, J. A. V. Estudo da Produção de Amiloglucosidase por Aspergillus níger NRRL 3122 em Fermentação Semi-Sólida de Farelo de Arroz. 203 f. Tese (Doutorado em Engenharia de Alimentos) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 1996. Página 4

COSTA, S. T.; ABREU-LIMA, T. L.; CARREIRO. S. C. Atividade amilolitica de leveduras isoladas de batata-doce(ipomoea batatas (L.) Lam). RevBio - Revista de Biociências da Universidade de Taubaté, v.17, n. 2, 2011. FUWA, H. A. A new method for microdetermonation of amylase activity by the use of amylase as the substrate. The journal o Biochemistry, v.41, p. 583-603, 1954. GARCIA, R.C.; Produção e caracterização parcial das amilases de Colletotrichum graminicola. Monografia (Graduação em Biologia), Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, São Paulo, 2013. GUPTA, R.; MOHAPATRA, H.; GOSWAMI, V.K. ; CHAUHAN, B. Microbial α- Amylases: a Biotechnological Perspective. 2003. In: BASTOS, C. M. S. Efeito das condições de cultivo na produção de amilase por duas linhagens de leveduras. Palmas, UFT, 2011, p. 26. Dissertação (Mestrado em Agroenergia), Universidade Federal do Tocantins, Tocantins, 2011. LI, J. H.; VASANTHAN, T.; HOOVER, R.; ROSSNAGEL, B. G. Starch from hull-less barley: V. In-vitro suscetibility of waxy, normal, and high-amylose starches towards hidrolysis by alpha-amylases and amyloglucosidase. Food Chemistry, v. 84, n. 4, p. 621-632, mar, 2004. MARQUES, D. R.; et al. Enzymatic hydrolysis of raw cassava starch and bioethanol production by Saccharomyces cerevisiae CENPK2 expressing a glucoamylase from Aspergillus awamori. Biochemistry and Biotechnology Reports BBR, v.2, n.4, p. 22-29, 2013. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Washington: Anal. Chem., v. 31, p. 426-429, 1959. ROCHA, T. S.; Estudo da hidrólise enzimática do amido de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza): Efeito do tamanho dos grânulos. Dissertação (Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos) Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Campus de São José do Rio Preto, São José do Rio Preto, SP, 2007. SPIER, M.R.; WOICIECHOWSKI, A. L.; SOCCOL, C. R. Produção de α-amilase por Aspergillus em Fermentação no Estado Sólido de Amido de Mandioca e Bagaço de Cana-de- Açúcar. VI SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA. Anais Enzitec 2004. Rio de Janeiro: Enzitec, v. 1, p. 116-116, 2004. PANDEY, A.; SELVAKUMAR, P.; SOCCOL, C. R.; NIGAM, P.;Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Current Science, vol. 77, N. 1, pg. 149,1999. PANDEY, A.; WEBB, C.; SOCCOL, C.R.; LARROCHE, C. Enzyme Technology New Delhi: Asiatech Publishers, Inc,. 1ª ed., p. 760, 2005. VITOLO, M. Aplicações de enzimas na tecnologia de alimentos. 2001. In: BORZANI, W.; SCHIMIDELL, W; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia Industrial - Fundamentos, v.1, p.351-353, São Paulo: Edgard Blücher LTDA, 2001. AGRADECIMENTOS A todos que me ajudaram ao longo dessa caminhada. Obrigada pelo apoio. Página 5