PRODUÇÃO DE HIDROLASES POR LEVEDURAS

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1 PRODUÇÃO DE HIDROLASES POR LEVEDURAS Luana Cristina Paludo 1 ; Solange Cristina Carreiro 2 ; 1 Aluna do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; luana_cpaludo@hotmail.com, PIVIC/UFT. 2 Orientadora do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; solange@mail.uft.edu.br RESUMO O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade hidrolítica de 70 leveduras que foram isoladas de folhas em decomposição que compõem parte da coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia da UFT, coordenado pela Profª Drª Paula Benevides de Morais. Os testes foram realizados em meio sólido especifico de amido, pectina, lípase, protease I (leite) e protease II (gelatina). As leveduras foram inoculadas diretamente na superfície dos meios com o auxilio da alça de Drigask e as placas foram incubadas de 7 a 21 dias a 29 graus Celsius. Os resultados foram dados através do índice enzimático (IE) que é representado pela relação existente entre a média de diâmetro dos halos de degradação pela média de diâmetro da colônia. Apenas 14 leveduras apresentaram IE maior que dois e foram cultivadas em 30 ml de meio liquido e incubadas por 72 horas a 25 graus Celsius, sendo que uma amostra de 5 ml foi retirada a cada 24 horas e armazenada em tubos falcon. As amostras foram centrifugadas a 150 rpm por 15 minutos, após a centrifugação foi retirado 100 μl de extrato Bruto (EB) dessas amostras e estas foram colocadas em poços de 6 mm nos meios sólidos específicos e as placas foram incubadas por 48 horas antes da leitura. Após a leitura das placas constatou-se que não houve formação significativa de halos. Palavras-chave: leveduras; substratos; degradação; enzimas. INTRODUÇÃO As leveduras são comumente encontradas em substratos contendo açúcares como em frutos, grãos de cereais, folhas, entre outros. Apesar de pertencerem ao reino Fungi possuem características que as diferenciam desse reino, pois, possuem um talo predominantemente unicelular, não formam corpo de frutificação, assim como sua reprodução pode se dar por brotamento. Estas podem ser encontradas entre os fungos mitospóricos e nos filos Ascomycota e Basidiomycota, segundo Fuentefria (2004). Fuentefria (2004), diz que atualmente o potencial que estas têm na produção de enzimas é de grande interesse para estudos, para que assim se desenvolva posteriormente o seu uso em escala industrial.

2 As enzimas são moléculas de proteína grandes e complexas que atuam como catalisadoras em reações bioquímicas sem se deixarem consumir na reação. Estas enzimas são frequentemente capazes de digerir substratos para que estes sejam transformados em unidades fundamentais de crescimento (FUENTEFRIA, 2004). Segundo Wanderley et all (2011), desde os primórdios da civilização que o ser humano vem explorando as enzimas para a produção de alimentos e bebidas. Nos últimos 25 anos a utilização de enzimas para realizar os processos industriais vem crescendo consideravelmente, ainda mais quando analisamos o aumento da implementação de novas enzimas em vários ramos das indústrias. Isto acaba por tornar a produção e reprodução destas tão visado, aumentando assim o interesse no estudo e desenvolvimento de testes na área de produção enzimática. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas 70 leveduras isoladas de folhas em decomposição, e as mesmas fazem parte da coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia da UFT, coordenado pela Profª Drª Paula Benevides de Morais, sendo por estes purificadas, identificadas e numeradas. Anteriormente a realização dos experimentos, todas as linhagens foram reativadas em Agar Sabouraud- glicose, meio composto por 2% de glicose, 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 2% de Agar, pela técnica de estriamento, As placas foram incubadas a 28 ºC por 48 horas, sendo inoculadas normalmente 10 linhagens por placa. Utilizando o que foi proposto por Hankin e Anagnostakis (1977), os ensaios para produção de hidrolases foram realizados em meios sólidos específicos, com duas repetições. As placas com cada meio específico foram incubadas por 7 a 21 dias a 29 C, com 7 linhagens por placa. A produção das hidrolases foi confirmada e medida através da observação de halos de hidrólise, calculando assim o Índice Enzimático (IE), representado pela relação entre a média de diâmetro dos halos de degradação pela média de diâmetro da colônia. A atividade amilolítica foi verificada em meio contendo 2,0% de amido solúvel, 0,5% de extrato de levedura e 1,8% de Agar (LOODER, 1970), e a revelação dos halos foi feita através coloração das placas com vapor de iodo, segundo Hankin e Anagnostakis, (1975). A atividade lipolítica foi avaliada em meio contendo, em g/l: óleo de oliva (1%), extrato de levedura (1%), NaCl (0,5%), Tween 80 (1%) e agar (1,8%). A hidrólise dos triglicerídeos foi avaliada

3 através da formação de halo transparente resultante da quebra da emulsão ao redor da colônia produtora, segundo Freire, (1996). A atividade pectinolítica foi constatada em meio contendo, em g/l: pectina cítrica (1%), glicose (1%), extrato de levedura (0,5%) e agar (1%). Os halos de hidrólise foram verificados após tratamento das placas com vapor de iodo, segundo Gainvors et al, (1994) e González et al, (2004). A produção de celulase pode ser verificada em meio contendo, em g/l: carboximetilcelulose (CMC) (1%), extrato de levedura (0,5%) e Agar (1,8%). Os halos de hidrólise seriam evidenciados após coloração das placas com solução 0,1% de vermelho Congo, segundo Maijala et al. (1991). A atividade proteolítica foi avaliada em meio contendo, em g/l: glicose (1%), extrato de levedura (0,5%), leite em pó desnatado (1e agar (1,8%). Os halos foram comprovados após precipitação com HCl 1,5 molar. A atividade proteolítica foi também avaliada pela hidrólise de gelatina, usando-se o mesmo meio, substituindo-se o leite em pó por 1% g/l de gelatina comercial, sem sabor. Nesse caso os halos foram confirmados pela liquefação do meio ao redor das colônias, segundo Yarrow, (1998). Após a medição dos halos, as linhagens que apresentaram valores de IE acima de 2,0 foram cultivados em 30 ml de meio líquido com a mesma composição utilizada nos meios sólidos, sem adição de agar. Os frascos foram incubados a 25 o C sob agitação de 150 rpm. A cada 24 horas foram colhidas amostras de 5 ml até completados 3 dias de incubação. Essas amostras tiveram sua biomassa separada por centrifugação (300rpm/15minutos) e o sobrenadante (extrato enzimático bruto - EB) foi empregado nos ensaios. Alíquotas de 100 μl do EB foram inoculadas em poços de 6 mm de diâmetro perfurados na superfície dos meios de cultura, conforme descrito em Souza et al. (2008). Após um período de 24 a 48 horas de incubação a 25 o C os halos foram revelados como descrito anteriormente e o IE calculado. RESULTADOS E DISCUSSÕES As 70 linhagens de leveduras avaliadas apresentaram valores variados para cada um dos meios sólidos em que foram cultivadas. Somente para o amido houve 14 leveduras que apresentaram valores de IE superiores a 2,0, valor considerado mínimo para se considerar um microrganismo como produtor potencial de enzimas em meio sólido segundo Lealem & Gasbe (1994). Para os outros meios o IE foi inferior a 2 para todas as leveduras analisadas.

4 Um estudo realizado por Strauss et al. (2001), fez com que este chegasse a conclusão que as leveduras obtidas a partir de vinho produziam pectina, protease e celulase em pequena escala devido acréscimo de 1% de glicose no meio de pectina, a carência de aminoácidos no meio protease e a dificuldade na degradação de celulose no meio de celulose. Estes fatores podem ter influenciado nos resultados obtidos. Após a análise do índice enzimático das leveduras, foi realizada uma avaliação sobre a produção das enzimas em meio liquido. Nos ensaios nenhuma das leveduras analisadas para os meios de amilase, lípase, pectinase e celulase demonstraram o IE acima ou igual a 2. Uma das explicações para esse fenômeno é o fato de que as enzimas produzidas por estas leveduras são produtos intracelulares, ficando assim retidas no espaço periplasmático (SALYERS et. al, 1996). E para que essas enzimas possam ser liberadas para o meio ha vários estudos de técnicas e métodos químicos, físicos e enzimáticos. Um exemplo de um método físico é o de rompimento ultrassônico apresentado e analisado por Lemes, (2012). Outro fato observado foi um pequeno crescimento de colônias ao redor dos poços, o que demonstrou que rotação de 300 rpm pelo período de 15 minutos foi insuficiente para a separação correta da biomassa do sobressalente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS FREIRE, D.M., TELES, E.M.F., BON, E.P.S., SANT`ANNA JR., G.L.. Lipase production by Penicillium restrictum in a bench scale fermenter: Media composition, agitation and aeration. Appl. Biochem. Biotechnol. 63, , FUENTEFRIA, A. M. Identificação e avaliação do potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras isoladas de filoplano do Hibiscus rosa-sinensis. Dissertação de mestrado para Microbiologia Agrícola e do Ambiente, Porto Alegre, Rio Grande do Sul,2004. GAINVORS, A., FRÉZIER V., LEMARESQUIER, H., LEQUART, C., AIGLE, M. AND BELARBI, A. Detection of polygalacturonase, pectin-lyase and pectin-esterase activities in a Saccharomyces cerevisiae strain. Yeast, v.10, p , GONZÁLEZ, J.A.; GALLARDO, C.S.; POMBAR, A; REGO, P. AND RODRÍGUEZ, L.A. Determination of enzimatic activities in ecotypic Saccharomyces and non-saccharomyces yeasts. Electronic Journal of Environmental Agriculture Food Chemistry, v.3, n.5, p , 2004.

5 HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S.L. Solid medium containing carboxymethylcellulose to detect Cx cellulase activity of microorganisms. Journal of General Microbiology, v.98, p , LEALEM, F.; GASHE, B.A. Amylase production by a gram-positive bacterium isolated from fermenting tef. (Eraglostis tef.). Journal of Applied Bacteriology, v. 77, p , LEMES, A. C. et all. Extração de β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 por método ultrassônico. BBR - Biochemistry and Biotechnology Reports. Jul./Dez., v.1, n.2, p. 7-13, LOODER, J. General classification of the yeast. In: The yeast a taxonomic study, 2.ed. Amsterdam: North-Holland Publishing Co., MAIJALA, P., FAGERSTEDT, K.V. AND RAUDASKOSKI, M. Detection of extracellular cellulolytic and proteolytic activity in ectomycorrhizal fungi and Heterobasidion annosum (Fr.) New Phytology, v.117, p , SALYERS, A.A.; REEVES, A.; D ELIA, J. Solving the problem of how to eat something as big as yourself: Diverse bacterial strategies for degrading polysaccharides. J. Ind. Microbiol., v. 17, p , STRAUSS, M.L.A. Strauss, Screening for the production of extracellular hydrolytic enzymes by non-saccharomyces wine yeasts. Journal of Applied Microbiology, 91, p , SOUZA, H.Q., OLIVEIRA, L.A., ANDRADE, J.S. Seleção de basidiomycetes da Amazônia para produção de enzimas de interesse biotecnológico. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 28, p , YARROW, D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts. In: Kurtzman, C. P., Fell, J. W.(eds). The yeasts a taxonomic study. 4rd ed. Elsevier Science Publ., p , WANDERLEY M.D, NEVES E., ANDRADE C.J. Aspectos da Produção industrial de enzimas. Revista Citino, Vol. 1, No. 1, Página 44-50, outubro-dezembro AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus e a minha família pelo apoio e oportunidade de estar cursando Engenharia de alimentos. Em seguida a todos os meus companheiros, amigos, a orientadora e a minha tutora por me ensinarem e me ajudarem tanto nessa caminhada acadêmica.