FICHA TÉCNICA. Que água consumimos? Diretor do curso: Professor Fernando Pereira. Coordenador do Projeto FEUP: João Bastos

QUE ÁGUA CONSUMIMOS? PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS DA ÁGUA NA REDE PÚBLICA Mestrado Integrado em Engenharia do Ambiente Turma: 103 Equipa: 2 0

FICHA TÉCNICA Diretor do curso: Professor Fernando Pereira Coordenador do Projeto FEUP: João Bastos Professora da Unidade Curricular: Margarida Bastos Supervisor: António Vilanova Monitor: Fábio Bernardo Alunos: Ana Raquel Flávio Ana Rita Martinho Francisco Carneiro Inês Silva Maria Inês Rego Sara Rodrigues 1

CONTEÚDO Ficha técnica... 1 Resumo... 4 Introdução... 4 Definição... 5 Legislação... 7 As Águas Portuguesas... 7 Tratamento... 9 Perigo da E. Coli para a saúde... 12 Presença da Escherichia Coli na água da rede pública... 13 Materiais e Métodos... 16 Resultados e Discussão... 18 Conclusão... 20 Bibliografia... 20 2

Tabela 1 - Parâmetros microbiológicos e valores paramétricos para a água fornecida por redes de distribuição, fontanários, cami-ões ou navios-cisterna, reservatórios e água utilizada na indústria alimentar (Decreto-Lei 306/2007, anexo I, parte I). Abe-lho, M. (MANUAL DE MONITORIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA AMBIENTAL).... 7 Tabela 2 - Cumprimento dos valores paramétricos, por parâmetro, na torneira do consumidor... 8 Tabela 3 -Vantagens e desvantagens da filtração por membrana Abelho, M. (2010) Manual de monitorização microbiológica ambiental... 17 Tabela 4 - Observações resultantes da atividade experimental... 18 Figura 1 - Escherichia Coli... 6 Figura 2 - Qualidade da água na torneira do consu-midor em Portugal Continental em 2014 Legenda : verde: % 99 (meta); amarelo: 95 % < 99; vermelho: % < 95... 8 Figura 3 - Pontos de passagem da água desde que é recolhida até que retorna à sua origem... 14 Figura 4 Formação de biofilme nos reservatórios... 15 3

RESUMO Neste trabalho estudou-se a presença da bactéria E.Coli na água da rede pública através de experiências laboratoriais que permitiu verificar a presença de colónias da referida bactéria em 6 amostras de água em que cada uma foi recolhida na área do Porto, permitindo ter uma ideia geral da percentagem de contaminação. Identificou-se as amostras de água e as duas placas de Petri com os meios seletivos; e através de filtrações e da utilização de objetos estéreis e flamejados incubou-se finalmente as amostras de acordo com temperaturas já estipuladas ao nosso grupo e conservadas durante 1 semana (7 dias) em refrigeração. No final deste procedimento laboratorial foi possível observar que em apenas uma das amostras se encontrava uma quantidade relativamente pequena de E.Coli o que permitiu concluir que a água da rede pública na zona do Porto não possui um elevado risco à saúde humana visto que a quantidade existente continha um baixo grau de contaminação segundo o Decreto-Lei 306/2007. INTRODUÇÃO No âmbito da unidade curricular Projeto FEUP foi-nos proposto a realização de um trabalho de investigação e pesquisa cujo tema é Parâmetros microbiológicos da água na rede pública. Uma vez que é um assunto abrangente este foi restringido apenas à apuração da presença de uma bactéria específica na água, a Escherichia Coli, para tal foi necessário investigar o seu desenvolvimento, como pode surgir na rede pública, as formas de tratamento e combate e mesmo a consulta da legislação relativamente à presença E.Coli. Hoje em dia, a sociedade em geral tem acesso facilitado a água potável, a maior parte das casas encontra-se ligada à rede de distribuição pública pelo que para consumir água basta abrir uma torneira. No entanto, este bem essencial à vida percorre vários postos desde o local onde é colhida até estar limpa e cumprir todos os requisitos para que seja qualificada de água própria para consumo humano. Ao longo de todo o processo, a água encontra-se sujeita a diversos perigos, sendo o de maior interesse tratado neste trabalho, o risco de contaminação pela bactéria referida anteriormente. 4

DEFINIÇÃO A Escherichia Coli, mais conhecida por E. Coli, é uma enterobactéria bacilar 1, cujo tamanho varia entre 1.1-1.5µm por 2.0-6.0µm, que pertence à família enterobacteriaceae. As bactérias que constituem esta família partilham entre si muitas caraterísticas comuns e são as mais utilizadas em laboratório para as mais variadas experiências. A E. Coli, em particular, parece ser a bactéria de eleição entre os microbiologistas (Willey et al. 2008). As bactérias pertencentes a família enterobacteriaceae não libertam esporos e têm gram-negativo 2, múltiplos flagelos em volta da célula, necessidades nutricionais simples e processos metabólicos idênticos. Todas elas são anaeróbicas facultativas. Aquando da degradação de açúcares, produzem grandes quantidades de gases e um complexo capaz de degradar o ácido pirúvico resultante da fermentação, sendo os produtos finais desse processo, maioritariamente, a lactose e o acetato com formação de H 2 ou CO 2 e etanol. A E. Coli é, então, dos poucos seres vivos capazes de produzir todos os componentes que entram na sua constituição. Têm um crescimento ótimo em condições aeróbias a 37ºC e são capazes de o fazer individualmente ou em pares. Sabe-se, ainda que, o seu genoma tem quase 5 milhões de pares de bases azotadas codificando mais de 4000 proteínas, sendo esta uma das bactérias mais usadas em engenharia genética. O habitat natural desta bactéria é o intestino de certos animais de sangue quente, entre os quais o Homem. Podem ser inofensivas e até estimular o sistema imunológico ao impedir o desenvolvimento de outras bactérias nos intestinos, mas também podem ser prejudiciais à saúde humana, dependendo da sua localização, quantidade e estirpe. É devido à sua presença no intestino humano que estas fazem parte de um grupo de bactérias que se denomina coliformes que são os principais indicadores microbiológicos de análise e controlo da qualidade da água, pois a presença de E.Coli na água induz a contaminação da mesma com fezes. Para além disso, são outros os fatores que fazem desta bactéria um indicador importante de contaminação fecal da água: se existirem microrganismos patogénicos na água, a sua presença é certa; a sua concentração na água é proporcional ao nível de poluição de origem fecal; é uma das bactérias mais bem estudadas; as técnicas de identificação desta bactéria são de fácil execução, rápidas, inequívocas e aplicáveis a todos os tipos de água (Willey et al. 2008). 1 Bactérias bacilares ou bacilos são bactérias em forma de bastonetes. 2 Bactérias de gram-negativo têm na membrana celular lipopolisacarídeos (LPS). 5

As bactérias pertencentes a família enterobacteriaceae não libertam esporos e têm gram-negativo 3, múltiplos flagelos em volta da célula, necessidades nutricionais simples e processos metabólicos idênticos. Todas elas são anaeróbicas facultativas. Aquando da degradação de açúcares, produzem grandes quantidades de gases e um complexo capaz de degradar o ácido pirúvico resultante da fermentação, sendo os produtos finais desse processo, maioritariamente, a lactose e o acetato com formação de H 2 ou CO 2 e etanol. FIGURA 1 - ESCHERICHIA COLI A E. Coli é, então, dos poucos seres vivos capazes de produzir todos os componentes que entram na sua constituição. Têm um crescimento ótimo em condições aeróbias a 37ºC e são capazes de o fazer individualmente ou em pares. Sabe-se, ainda que, o seu genoma tem quase 5 milhões de pares de bases azotadas codificando mais de 4000 proteínas, sendo esta uma das bactérias mais usadas em engenharia genética. O habitat natural desta bactéria é o intestino de certos animais de sangue quente, entre os quais o Homem. Podem ser inofensivas e até estimular o sistema imunológico ao impedir o desenvolvimento de outras bactérias nos intestinos, mas também podem ser prejudiciais à saúde humana, dependendo da sua localização, quantidade e estirpe. É devido à sua presença no intestino humano que estas fazem parte de um grupo de bactérias que se denomina coliformes que são os principais indicadores microbiológicos de análise e controlo da qualidade da água, pois a presença de E.Coli na água induz a contaminação da mesma com fezes. Para além disso, são outros os fatores que fazem desta bactéria um indicador importante de contaminação fecal da água: se existirem microrganismos patogénicos na água, a sua presença é certa; a sua concentração na água é proporcional ao nível de poluição de origem fecal; é uma das bactérias mais bem estudadas; as técnicas de identificação desta bactéria são de fácil execução, rápidas, inequívocas e aplicáveis a todos os tipos de água (Willey et al. 2008). 3 Bactérias de gram-negativo têm na membrana celular lipopolisacarídeos (LPS). 6

LEGISLAÇÃO Na legislação portuguesa está estipulado, no Decreto-Lei 306/2007, anexo I, parte I, que a presença de E. Coli na água fornecida por redes de distribuição, fontanários, camiões ou navios-cisterna, reservatórios e água utilizada na indústria alimentar, deve ser nula, isto é, o valor estipulado na lei para a presença de E. Coli para consumo humano é 0 UFC (unidades formadoras de colónias) por 100mL. TABELA 1 - PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS E VALORES PARAMÉTRICOS PARA A ÁGUA FORNECIDA POR REDES DE DISTRIBUIÇÃO, FONTANÁRIOS, CAMI-ÕES OU NAVIOS-CISTERNA, RESERVATÓRIOS E ÁGUA UTI- LIZADA NA INDÚSTRIA ALIMENTAR (DECRETO-LEI 306/2007, ANEXO I, PARTE I). ABE-LHO, M. (MA- NUAL DE MONITORIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA AMBIENTAL). Parâmetro Valor paramétrico Unidade Escherichia coli (E.Coli) 0 Número/100mL Enterecocos 0 Número/100mL De modo a determinar se a legislação relativamente aos valores regulamentados para a presença de E. Coli estava ou não a ser cumprida e se a água da rede pública é segura para consumo humano, fizemos a análise de algumas amostras. AS ÁGUAS PORTUGUESAS Apresentando uma grande diversidade de adaptação ao meio, a E.Coli habita normalmente no intestino humano e no de alguns animais ruminantes, ajudando maioritariamente o corpo na digestão e no absorver de vitaminas importantes. Em alguns casos pode ocorrer a infeção pela E.Coli quando esta se multiplica no intestino chegando ao trato urinário. A E.Coli reproduz-se rapidamente (sendo esta maioritariamente por divisão celular), uma vez que esta bactéria coloniza recém-nascidos logo após o seu próprio nascimento, facto que foi verificável aquando do seu estudo. Face ao seu desenvolvimento, a E.Coli possui dois processos evolutivos fundamentais: a mutação e a transferência horizontal. A combinação das mutações e das transferências horizontais têm vindo a moldar em geral os grupos filogénicos e as respetivas linhagens constituintes dentro das quais as diversas variantes patogénicas têm emergido. 7

Em Portugal, devido ao acréscimo controlo que se tem tido, a distribuição da água tem sofrido uma evolução positiva, obtendo-se valores excecionais. Em 2013, a Entidade Reguladora dos Serviços de Águas e Resíduos referiu que 98,2 % da água que sai das torneiras é controlada e de boa qualidade. Em 2014 esse mesmo valor subiu para 98.41 %. O Mapa 1 mostra a qualidade da água na troneira do consumidor em Portugal Continental em 2014. A meta é indubitavelmente chegar aos 99%, e que, comparando com os relatórios de 1993 Portugal está num bom caminho: já que nessa data apenas 50% era definida como de qualidade. Deste modo, foi possível eliminar as doenças transmitidas pela água da rede pública nestes últimos 20 anos. No relatório mais recente que a ERSAR disponibilizou, também é verificável uma grande evolução face á água distribuída desde 2010 até 2014. O cumprimento dos valores paramétricos na torneira do consumidor tem vindo a subir, como mostra a seguinte tabela: FIGURA 2 - QUALIDADE DA ÁGUA NA TORNEIRA DO CONSU-MIDOR EM PORTUGAL CONTINENTAL EM 2014 LEGENDA : VERDE: % 99 (META); AMARELO: 95 % < 99; VERMELHO: % < 95 TABELA 2 - CUMPRIMENTO DOS VALORES PARAMÉTRICOS, POR PARÂMETRO, NA TORNEIRA DO CONSUMIDOR Vê-se então que o aumento do cumprimento dos valores estabelecidos é também fruto do maior controlo que se tem tido ao longo do tempo. 8

TRATAMENTO A bactéria E.Coli é facilmente eliminada da água por processos de desinfeção química (por exemplo: Cloro, Dióxido de Carbono, Ozono, Cloro) e física (por exemplo: ultravioleta, ultrafiltração, filtração rápida). Os fatores principais em qualquer dos processos de desinfeção são o tempo de contacto e a concentração de desinfetante aplicada. ETAR Estações de Tratamento de Águas Residuais mais conhecias por ETAR, são estações que tratam as águas residuais de origem doméstica e industrial com o objetivo de serem escoadas para o mar ou rio com um nível de poluição inofensivo para o meio ambiente recetor. Este processo de tratamento divide-se em diferentes etapas: Pré-tratamento ou tratamento preliminar As águas são sujeitas a processos de separação dos sólidos de maiores dimensões, como a gradagem que pode ser composto por grades de elevada espessura, grades finas e/ou peneiras rotativas e o desengorduramento nas chamadas caixas de gordura ou em pré-decantadores. Tratamento primário Depois do pré-tratamento, as águas residuais possuem as suas características poluidoras quase inalteradas visto que o pré-tratamento é apenas um processo físico. A matéria poluente é separada da água por sedimentação. No entanto, neste processo, exclusivamente de ação física, podem, em alguns casos, serem adicionados químicos que através de uma coagulação/floculação possibilitam a obtenção de matéria poluente de maiores dimensões que permite decantá-los mais facilmente. Tratamento secundário O tratamento secundário consiste num processo biológico, onde a matéria orgânica, os poluentes, é consumida por microrganismos em reatores biológicos. Estes reatores normalmente encontram-se em tanques com grande quantidade de microrganismos aeróbios 4, havendo por isso a necessidade de promover o seu arejamento. Os microrganismos sofrem posteriormente um processo de sedimentação nos designados sedimentadores (decantadores) secundários. Finalizado o tratamento secundário, as águas residuais tratadas apresentam um reduzido nível de poluição por matéria orgânica, podendo na maioria dos casos, serem despejadas no meio ambiente recetor. A eficiência de um tratamento secundário pode ultrapassar os 95%. 4 Microrganismos aeróbios: Microrganismos que necessitam de oxigénio para crescer 9

Tratamento terciário Normalmente é necessário proceder à desinfeção das águas para a remoção dos organismos patogénicos ou, em alguns casos, à remoção de determinados nutrientes, como o azoto e o fósforo, que podem desenvolver a eutrofização 5 das águas. São utilizados diversos métodos como por exemplo a cloração, que também tem contribuído significativamente na redução de odores em estações de tratamento de esgoto, a ozonização, que é bastante dispendiosa e a radiação ultravioleta, que não é aplicável a qualquer situação. A E.Coli é facilmente eliminada da água por processos de desinfeção química (por exemplo: Cloro, Dióxido de Carbono, Ozono, Cloro) e física (por exemplo: ultravioleta, ultrafiltração, filtração rápida). Os fatores que determinam a eficácia de tratamento em qualquer dos processos de desinfeção são o tempo de contacto e a concentração de desinfetante aplicada. Cloro A cloração é um dos métodos mais utilizados na purificação e desinfeção de águas para consumo humano. Neste processo é muito frequente a utilização do ácido hipocloroso (HCIO) como agente de cloração. Este ácido resulta da hidrólise do Cloro (Cl 2 ), em meio aquoso. O ácido hipocloroso e o ião hipoclorito são os principais responsáveis pela oxidação da matéria orgânica poluente e pela inibição do crescimento bacteriano. A soma das suas concentrações é conhecida como cloro residual livre. Para a eliminação da bactéria E.Coli deve ser garantida uma concentração de cloro residual livre igual ou superior a 0.5 mg/l durante pelo menos 30 minutos de contacto, a ph menor que 8.0. Este valor deve ser encarado como um valor guia para água com turvação 6 inferior a 0.5 UNT 7. Ultravioleta O sistema de desinfeção por ultravioleta (UV) consiste na transferência de energia eletromagnética de uma lâmpada de arco de mercúrio para um organismo que contém material genético (DNA e RNA), neste caso a bactéria E.Coli. Quando a radiação ultravioleta incide na parede celular de um organismo destrói a capacidade reprodutora da célula, ou seja, incide no material genético dos microrganismos retardando assim a sua capacidade reprodutora. 5 Eutrofização - fenómeno causado pelo excesso de nutrientes (compostos químicos ricos em fósforo ou nitrogénio) numa massa de água, provocando um aumento excessivo de algas. A maior parte destas algas acabam por morrer. No entanto, a decomposição destas remove o oxigénio existente na água originado a morte da maioria dos peixes e outros organismos aeróbios. Além disso, algumas espécies de algas produzem toxinas que contaminam as fontes de água potável. 6 Turvação: água com presença de partículas coloidais e/ou suspensão. 7 UNT: Unidade de Turvação Nefelométrica unidade de turvação calculada em termos de percentagem de luz refletida pelas partículas contidas numa amostra de água. 10

Ultrafiltração As membranas de ultrafiltração são compostas por filamentos ocos e porosos de PVDF (Fluoreto de polivinilideno), um termoplástico 8 que é altamente inerte e é obtido através da polimerização do difluoreto de vinilideno, com poros microscópicos na sua superfície, que são milhares de vezes menores em diâmetro do que um cabelo (0,02 micrómetros), e têm como função constituir uma barreira física para as partículas em suspensão e para os microrganismos como bactérias, protozoários e vírus, obtendo-se assim água própria para consumo humano. Prevenção No nosso dia-a-dia podemos adquirir hábitos simples e fáceis que permitem a diminuição da probabilidade de infeção da bactéria E.Coli, alguns desses hábitos de segurança são: Lavar com frequência as mãos utilizando água e sabão desinfetante; Lavar bem os alimentos que são consumidos crus, nomeadamente os legumes e a fruta, desinfetando-os com água; Preparar a carne em separado, não reutilizando os recipientes ou talheres uma vez que poderão estar contaminados; Consumir preferencialmente águas de rede pública visto que têm um elevado grau de controlo o que diminui drasticamente a probabilidade de existência da bactéria. No processo de refrigeração dos alimentos deve-se ter em conta as temperaturas adequadas para evitar reprodução e proliferação da E.Coli. 8 Termoplástico é um plástico (polímero artificial) que, a uma dada temperatura, apresenta alta viscosidade podendo ser conformado e moldado. 11

PERIGO DA E. COLI PARA A SAÚDE Devido à falta de cuidado e de higiene que hoje em dia se tem perante recursos naturais como a água criam-se condições para o desenvolvimento de bactérias. Uma exemplo de uma bactéria extremamente perigosa é a E.Coli que possui um elevado risco à saúde do ser humano podendo causar diversos danos ao organismo como: diarreia, dor abdominal e dor de estômago. Este tipo de bactéria encontra-se principalmente em águas e alimentos contaminados. A maior parte dos sintomas que são provocados pela E.Coli estão relacionados com o sistema urinário como por exemplo: dor ou sensação ardente ao urinar acompanhada de uma frequente vontade de urinar, vómito e em certos casos se houver uma infeção nos rins também há um aumento de temperatura podendo chegar aos 38/39 ºC de febre. Estes sintomas são explicados pelo facto de esta bactéria se alojar nos intestinos e produzir toxinas com um grande grau de nocividade que causam principalmente a referida diarreia. É de referir que uma das razões pela qual a taxa de mortalidade das infeções provocadas pela E.Coli é razoavelmente alta (principalmente nas crianças com idade inferior a 5 anos) deve-se ao facto de estes sintomas serem semelhantes a outros menos perigosos e contagiosos. Temos também variados tipos da bactéria E.Coli, em que cada um apresenta sintomas diferentes como por exemplo: - E.Coli enteropatogénica (EPEC) caracterizadas por colonizarem o intestino e criarem lesões; -E.Coli enterotoxigénica (ETEC) principais responsáveis pelas doenças nas crianças; -E.Coli enteroinvasiva (EIEC) caracterizadas por criarem úlceras nos intestinos; -E.Coli enterohemorrágica (E.Coli O157:H7) que foi a causa do surto de colite hemorrágica em 1982, assim como a EPEC também colonizam o intestino. 12

PRESENÇA DA ESCHERICHIA COLI NA ÁGUA DA REDE PÚBLICA A água que entra na rede pública é recolhida em nascentes, minas, rios, albufeiras, poços e furos. De seguida é submetida a diversos tratamentos químicos, biológicos e físicos. Neste trabalho, o tema analisado é a presença de uma bactéria na água da rede pública, a Escherichia coli, ou seja, o foco será as formas de infeção por parte destes microrganismos. Após a captação da água nas fontes, esta é reencaminhada para as Estações de Tratamento de Águas (E.T.A.) e submetida a uma desinfeção inicial, mais especificamente, a uma pré-oxidação que poderá ser realizada com as seguintes substâncias, por exemplo: ozono, dióxido de ozono, cloro Este passo tem como objetivo a oxidação da matéria orgânica e consequentemente a eliminação de alguns microrganismos presentes na água. De seguida, sofre floculação 9, flotação 10 e filtração 11 e, finalmente, uma desinfeção final realizada com cloro (sob a forma de hipoclorito de sódio, dióxido de cloro ) cujo pressuposto é garantir a qualidade microbiológica da água. Seguidamente aos tratamentos a que foi exposta a água é enviada por adução 12, para grandes reservatórios. Posteriormente, a água destes reservatórios irá abastecer outros existentes na Rede, ou é lançada diretamente para a rede de distribuição dos edifícios. 9 Floculação: processo no qual a água é doseada com sulfato de alumínio conjuntamente com um floculante. 10 Flotação: os flocos formados na etapa da floculação são arrastados para a superfície da água devido à injeção de bolhas de ar que empurram os flocos para cima. 11 Filtração: local no qual a água entra diretamente no filtro constituído por areia e antracite. 12 Adução: processo que se baseia na derivação e/ou condução de águas pelo sistema de distribuição (abastecimento de águas). 13

Captação E.T.A.R. E.T.A. Distribuição Adução Reservatório Reservatório FIGURA 3 PONTOS DE PASSAGEM DA ÁGUA DESDE QUE É RECOLHIDA ATÉ QUE RETORNA À SUA ORIGEM No entanto, ao longo de todo o processo, existem falhas e eventualmente uma das consequências poderá ser o aparecimento agentes microbiológicos indesejáveis na água da rede pública. Entre estes microrganismos destaca-se aqui a bactéria E.Coli, indicador de contaminação. Desde da captação até ao tratamento nas E.T.A.R. s 13, a água está sujeita à contaminação por parte da bactéria referenciada. Fatores e condições que potenciam o aparecimento de E.Coli Captação Recolha de água em fontes contaminadas. E.T.A. Falta de desinfeção adequada a uma desinfeção primordial. As partículas poderão não ser totalmente removidas ou não seres completamente depositadas após os tratamentos a que é submetida. Adução Existências de fissuras ou rutura na rede e nos tubos. Em casos raros: contaminação devido à utilização de materiais e areias não desinfetadas para consertar os tubos e arranjar a canalização. 13 E.T.A.R. s: Estações de Tratamento de Águas Residuais 14

Reservatórios Formação constante de biofilmes 14 microbianos. Este local reúne todas as condições propícias ao alojamento da E.Coli nas zonas onde se verifica a variação do nível de água 15. Consequentemente poderá ocorrer o desenvolvi- Distribuição mento de colónias. FIGURA 4 FORMAÇÃO DE BIOFILME NOS RESERVATÓRIOS Existências de fissuras ou rutura na rede e nos tubos. Em casos raros: contaminação devido à utilização de materiais e areias não desinfetadas para consertar os tubos e arranjar a canalização. Já nas habitações, poderá ocorrer retrocontaminação 16. E.T.A.R. s Falta de desinfeção adequada. 14 Biofilme microbiano: associação de células microbianas fixadas à superfície, bióticas ou abióticas, envolvidas numa complexa matriz extracelular de substâncias polimerias, juntamente com os nutrientes capturados para a formação de matriz. 15 O biofilme aparece na faixa onde se verifica a variação de nível de água e pode ter uma origem química e/ou biológica. 16 Retrocontaminação: 15

MATERIAIS E MÉTODOS PROCEDIMENTO DE RECOLHA As amostras de água da rede pública utilizadas foram todas recolhidas na área do Grande Porto. Para recolher a água, seguimos um procedimento estipulado, que consiste nos seguintes passos: -Marcar um frasco esterilizado de modo a identificar a amostra. -Flamejar a torneira. -Deixar a água correr durante alguns segundos. -Abrir o frasco, mantendo a tampa virada para baixo. -Recolher a amostra de água, 200mL. -Colocar a tampa e fechar bem. PROCEDIMENTO LABORATORIAL "1. Identificaram-se duas placas de Petri contendo o meio de cultura seletivo LSA (Lauryl Sulfate Agar) 2. Colocou-se o funil de filtração estéril na rampa de filtração. 3. Colocou-se a membrana filtrante estéril (0,45 μm de porosidade e 47 mm de diâmetro) com a ajuda de uma pinça espatulada flamejada (isto é, mergulhada em álcool etílico e levada à chama do bico de Bunsen). 4. Agitou-se a amostra e adicionaram-se 100 ml de amostra ao funil com a torneira fechada. 5. Ligou-se a bomba de vácuo e filtrou-se a amostra abrindo a torneira da rampa de filtração. 6. Depois do processo de filtração, fechou-se novamente a torneira e, com a pinça espatulada flamejada, retirou-se a membrana e colocou-se sobre a superfície do meio de cultura (Nota: a membrana deverá aderir bem em toda a superfície ao meio de cultura, caso contrário não haverá crescimento nessas zonas). (Nunes, 2014) 16

O meio utilizado, Lauryl Sulfate Agar, é constituído por: péptido caseína, um produto da hidrólise enzimática realizado por proteínas selecionadas do leite; lactose, açúcar presente no leite; extrato de levedura, produto resultante da fermentação realizada por fungos, nomeadamente, leveduras; lauriléter sulfato de sódio, um desengordurante; vermelho de fenol, um indicador de ph e agarose bacteriana, um açucar em gel extraído de algas marinhas. O meio utilizado, é classificado como meio selectivo pois permite apenas o desenvolvimento de um tipo de bactérias. Assim, deve ser escolhido consoante o tipo de bactérias que queremos estudar. Para esta análise, escolhemos o LSA pois permite apenas o desenvolvimento de bactérias coliformes, como a E. Coli. A utilização da membrana filtrante para este tipo de análise, veio substituir o método da inoculação de meio líquido em tubos múltiplos com leitura do Número Mais Provável (NMP), método de carácter apenas probabilístico. O método de filtração por membrana também tem vantagens e desvantagens, nomeadamente: VANTAGENS E DESVANTAGENS DA FILTRAÇÃO POR MEMBRANA TABELA 3 -VANTAGENS E DESVANTAGENS DA FILTRAÇÃO POR MEMBRANA ABELHO, M. (2010) MANUAL DE MONITORIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA AMBIENTAL Vantagens Tem boa reprodutibilidade. Os resultados são relativamente rápidos. Os filtros podem ser transferidos para diferentes meios de cultura. Permite o processamento de grandes volumes de amostra de forma a aumentar a sensibilidade do teste. As filtrações podem ser efetuadas no local de recolha da água. É um método mais económico que o NMP. Desvantagens As amostras com água muito turva impedem a filtração de grandes volumes. Quando existe grandes populações de outras bactérias, o crescimento pode ser demasiado elevado para permitir a contagem. Se existirem metais e fenóis presentes na amostra, podem adsorver aos filtros e inibir o crescimento bacteriano. 17

RESULTADOS E DISCUSSÃO Após o tempo de incubação regulamentado pelo protocolo (18 horas), as amostras foram conservadas durante 7 dias em refrigeração a 4ºC, por impossibilidade de observar os resultados num intervalo de tempo mais curto, temperatura que conserva os resultados, visto não permitir o desenvolvimento das bactérias. Em seguida, observámos os resultados em laboratório, recolhendo os seguintes dados: TABELA 4 - OBSERVAÇÕES RESULTANTES DA ATIVIDADE EXPERIMENTAL U.F.C. U.F.C. de não coliformes Amostra 1 0 0 Amostra 2 1 0 Amostra 3 0 1 Amostra 4 0 0 Amostra 5 0 0 Amostra 6 manto 0 A amostra utilizada como referência para controlo negativo é a número 1, controlo esse em que se observa que não se formaram colónias de bactérias. A amostra utilizada como referência para controlo positivo é a número 6. Não é possível quantificar o número exato de unidades formadores de colónias, assim, é comum utilizar a expressão "manto" para situações em que toda a amostra se encontra coberto por manchas amarelas, machas estas que sugerem a existência de E. Coli na amostra em causa. Na amostra 2 é possível identificar uma unidade formadora de colónias, através da observação da cor amarela, o que sugere a presença de E.Coli na referida amostra. Na amostra 3 é observável uma unidade de formação de colónias não coliformes, visível pela alteração de cor de vermelho para cor-de-rosa. Na amostra 4 e 5 não se observa qualquer formação de colónias, a cor mantém-se a mesma em toda a amostra. Fig. 1 - Amostra de controlo positivo 18

Fig. 2 Amostra 2 Fig. 3 Amostra de controlo negativo A presença de lactose no meio, permite às bactérias realizar fermentação. Os produtos resultantes da fermentação realizada por bactérias, E.Coli entre outras, são ácidos, o que provoca uma alteração do ph do meio. Alteração essa que é visível através da mudança de cor da amostra, graças à presença do vermelho de fenol, que passa de vermelho para amarelo quando se econtra em meios ácidos. Assim, a observação da cor amarela nas amostras sugere a presença de E.Coli no meio. Partindo dos resultados obtidos através desta análise, podemos concluir que a água da rede pública na zona do Grande Porto está em conformidade com a legislação e é segura para consumo humano, pois apenas uma em quatro amostras de água analisadas se encontraram sinais de uma provavél contaminação pela E. Coli. Na informação disponibilizada online pela empresa responsável pela distribuição da água da rede pública do Porto, Águas do Porto, encontram-se os valores de cada parâmetro de controlo de qualidade da água definidos pela legislação e os respetivos resultados da análise de variadas amostras de água recolhida da rede pública. Os dados relativos à presença de E. Coli indicam que esta bactéria não está presente na água, o valor encontrado no 1º e 2º semestre do ano que decorre, 2015, são ambos 0. Ou seja, o valor que indica a presença de E. Coli na água (0 UFC) está em conformidade com a lei, está dentro dos valores expectáveis e confirma os dados que obtivemos em laboratório. Sendo este mais um argumento para podermos afirmar que, analisando a presença de E. Coli, a água da rede pública do Porto é segura para consumo humano e está em confimidade com a lei. 19

CONCLUSÃO É do conhecimento geral que a segurança e potabilidade da água da rede pública deve ser assegurada ao mais elevado grau. É de notar, que todos os tratamentos a que a água é sujeita antes de retornar à rede pública são eficazes pois, de acordo com os resultados, apenas uma das amostras continha vestígios de E.coli, vestígios estes de pouca importância e gravidade. Assim, podemos concluir que, de facto, a água da rede pública é perfeitamente passível a consumo humano. Por outro lado, há também outras formas de assegurar a qualidade da água, como por exemplo o uso de filtros de vários tipos. Todas estas medidas são em prol da segurança pública. Assim deduzimos que a maior parte dos casos de contaminação de E. coli na água da rede pública não tem como origem uma deficiência no tratamento em si mas sim o contágio por uma outra entidade já contaminada pela bactéria. BIBLIOGRAFIA Ministério da Saúde, Administração Regional de Saúde do Norte. 2004-2015. Significado dos parâmetros incluído na vertente analítica do Programa de Vigilância Sanitária da Água para Consumo Humano. Disponível em http://portal.arsnorte.minsaude.pt/portal/page/portal/arsnorte/conte%c3%bados/sa%c3%bade %20P%C3%BAblica%20Conteudos/Agua_Consumo_tabela.pdf 20

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