SÍNTESE DE PRIMERS 1- Abra o site http://www.ensembl.org/index.html selecione a espécie no quadro da direita (ex. Mus musculus) 2- Digite o nome do gene desejado no quadro search (ex. lep leptina) e clique em go. 3- Verifique as opções, escolha e clique no link que corresponde ao gene atenção com o nome do gene e a espécie em estudo
4- Role a barra até encontrar as informações do transcrito (further transcript info) e clique no link 5- Novamente role a barra até o quadro Show the following features e selecione exons and codons e clique no botão Refresh
6- Role novamente e visualize a sequência (Transcript sequence) colorida. As listras verticais representam os codons. A cor da fonte (preta ou azul) representam exons diferentes. A parte que está em preenchimento amarelo representa a região não codificadora e a parte que está sem preechimento representa a região codificadora do gene. Os introns não estão representados. 7- Selecione a seqüência, copie e cole no Word. Copie também as informações do topo da página e cole no Word.
8- Copie a parte da seqüência que contenha regiões codificadoras e exons alternados. No caso do gene da leptina, as 10 primeiras linhas servem para síntese de primers. Abra o site http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi e cole a seqüência no quadro. 9- Role a barra até encontrar as informações de Product size range e substitua o conteúdo do quadro por 80-200 (seta vermelha) e no quadro referente a Number to return substitua o conteúdo do quadro por 200 (seta azul). Clique no botão Pick Primers (seta verde).
10- Serão dados diversos primers L e R. Para escolher o par de primers adequados copie a seqüência de um dos primers L dado. 11- Abra o site http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/, clique em Nucleic Acid Quickfold.
12- Cole a seqüência no quadro (seta azul) e clique em Submit (seta verde). 13- Serão exibidos diversos dados, verifique se todos os Tm apresentados são menores que 40. Se o Tm não estiver adequado (abaixo de 40), volte ao passo 10 e repita com outra seqüência dada. Se sim, é possível refazer o procedimento a partir do passo 10 para o primer R. Caso não sejam encontrados primers R satisfatórios, volte ao passo 9, copie a seqüência do primer L no quadro indicado pela seta vermelha e novamente clique em Pick primers. Este procedimento permite que sejam confeccionados primers R para o primer L escolhido.
14- Agora aparecerão apenas o primer L fixado e diversos primers R que devem ser testados repetindo os passos 12 e 13. Achado o primer R com Tm abaixo de 40, abra o site http://www.vivo.colostate.edu/molkit/manip/index.html, role a barra cole o primer R no quadro indicado pela seta vermelha e clique em Inverse complement também indicado pela seta azul. No quadro apontado pela seta verde aparecerá a seqüência inversa complementar. 15- Copie a seqüência inversa complementar dada pelo passo anterior e localize-a na seqüência do gene em estudo (no caso a leptina). Grife o resultado com realce (neste caso está em rosa).
16- Em seguida, localize o primer L na seqüência e realce (neste caso em verde). Se estiverem em exons diferentes (lembre que os exons estão representados por cores de fonte diferentes, azul ou preta), o seu par de primers está pronto!!! Caso contrário, repita os procedimentos 14, 15 e 16. 17- Copie o par de primers selecionados e cole no seu documento do Word. Salve esse documento.
IMPORTANTÍSSIMO!!! BLASTAR OS PRIMERS na página http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi