Maria Alice Zarur Coelho Priscilla Filomena Fonseca Amaral Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Introdução Comercialmente, uma enzima pode ser um preparado que, além da proteína enzimática, contém quantidades variáveis de matéria contaminante proteica e não-proteica e preservantes; As células constituem-se, até hoje, o único meio para obtenção de biocatalisadores, visto que ainda não é possível destacar-se sua fabricação por síntese química. As enzimas podem ser provenientes de: tecidos de organismos diferenciados (células animais e vegetais) microrganismos.
Introdução - Produção: fermentação; produção agro-pecuária ou cultivo in-vitro ; - Recuperação: separação, extração e concentração; - Purificação: varia de acordo com o tipo de catalisador enzimático; - Formulação: normalização do produto enzimático. (---) enzima extracelular, ( ) enzima intracelular.
Produção de Enzimas de Tecidos Ainda se produz um número importante de enzimas de tecidos animais e vegetais; Ex.: renina usada na elaboração de queijos, proteases vegetais usadas em anti-inflamatórios, amilases para a preparação de mostos de cerveja. As enzimas de origem vegetal são produzidas em grande parte como subprodutos da atividade agrícola; Ex.: papaína, extraída do latéx do papaya, bromelina, obtida do talo da pinha. Situação análoga: enzimas de origem animal que se obtém como subprodutos dos matadouros (renina).
Produção de Enzimas de Tecidos As enzimas de tecidos requerem um processo de ruptura celular para a sua recuperação. A extração é uma operação simples e de baixa incidência no custo de produção. As células animais: desprovidas de parede celular podem ser facilmente rompidas (corte ou choque osmótico) As células vegetais: providas de uma rígida parede celular de natureza celulósica, são muito sensíveis aos esforços de corte, podendo ser eficientemente extraídas em moinhos convencionais.
Produção de Enzimas de Tecidos Produção em grande escala de enzimas em cultivos artificiais de tecidos: pouco factível complexidade do sistema alto custo dos meios de cultivo Produção de enzimas sofisticadas de alto custo: ok competição com a produção por fermentação usando microrganismos geneticamente modificados.
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Animal Tecidos animais são secos e triturados (moinhos ou homogeneizadores) Extraídas com solução aquosa ou tampão Resíduos removidos por filtração (uso de terra diatomácea) ou centrifugação
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Animal Pancreatina apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica Pâncreas de porco Antigamente: realçar sabor de queijos Atualmente: Auxiliar digestivo Pâncreas frescos ou congelados são triturados com tecido duodenal Tripsina presente no duodeno inicia a ativação das enzimas Massa é seca em secadores a vácuo, e desengordurada através de extração com éter de petróleo Flocos são secos em secadores a vácuo, para remoção do solvente, e moídos, obtendo-se um pó fino e peneirado
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Animal Renina Usada na elaboração de queijos Extração do quarto estômago de bezerro alimentado somente com leite Lavagem e corte em tiras do estômago Extração do coalho com uma solução de cloreto de sódio (12-20%) Filtra-se e purifica-se a solução por precipitação salina Acidificação
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Animal Pepsina Origem: Mucosa do estômago de porco Auxiliar digestivo Mucosa é fatiada e misturada com ácido clorídrico ou fosfórico (ph 2,0) por 16 h a temperatura ambiente Eleva-se a temperatura para 40-45 C por 1 h (pepsinogênio é convertido em pepsina) Tecido não digerido é filtrado, e seco no secador a vácuo a 40 C. Pepsina de alta pureza é obtida através da concentração a vácuo do filtrado, resfriamento a 5-8C e adição de etanol para atingir a concentração de 60% Filtração e secagem a baixa temperatura
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Animal Catalase Obtida a partir de fígado e sangue de boi ou porco Pode atuar como peroxidase, degradando álcoois, nitritos e fenóis Fígados são macerados e submetidos a agitação em solução aquosa de 25% com acetona a 25oC Concentração da acetona é aumentada a 35%, a massa obtida é filtrada e os sólidos descartados Mais acetona é adicionada (50%), precipitando a catalase, recuperada através de filtração ou centrifugação Precipitado pode ser seco ou ainda extraído em solução aquosa agitada por 1 h, removendo o material insolúvel Catalase líquida é submetida à filtração estéril e comercializada, com ou sem estabilizante (glicerol)
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Vegetal Papaína Enzima proteolítica Origem: latex do fruto verde do mamão Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo Extraída como suco prensado deste componente e posteriormente purificada A adição de água e cloreto de sódio perfazem um preparado chamado de papaína bruta
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Vegetal Bromelina Enzima proteolítica Origem: talo e fruto do abacaxi Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo Obtida do caule do abacaxi após moagem, prensagem, filtração e precipitação (silfato de amônio, metanol isopropanol ou acetona) do suco deste talo.
Produção de Enzimas de Tecidos Enzimas de Origem Vegetal Malte Proteases, lipases e hemicelulases, oxiredutases e amilases (alfaamilases: no grão durante a germinação; beta-amilase presente no grão antes da germinação) Origem: malte de cevada Após germinação é feita secagem: paralisação da atividade biológica do grão e reduzir teor de umidade
Engenharia de Bioprocessos: propagação de células microbianas Aplicação comercial: bactérias, fungos filamentosos e leveduras; Produção de enzimas extracelulares industriais: Bacillus e Aspergillus (80-85% do mercado de enzimas extracelulares)
Enzimas extracelulares: aquelas que passam pela membrana celular
Enzimas extracelulares: aquelas que passam pela membrana celular
Síntese e excreção de proteína extracelulares em bactérias
Síntese e excreção de proteína extracelulares em eucariotos
Síntese e excreção de proteína extracelulares em eucariotos Enzimas segregadas são modificadas extensamente durante sua passagem pelo retículo endoplasmático e pelo aparato de Golgi
Síntese e excreção de proteína extracelulares Enzima segregada: possa difundir livremente através da parede celular e, no caso de fungos e batérias Gram positivas, chegar ao meio externo. Algumas enzimas permanecem associadas a estruturas da membrana ou da parede celular. Nas bactérias Gram negativas a secreção de enzimas é mais complexa, devido a presença de uma membrana externa Única enzima relevante produzida por uma bactéria Gram negativa é a pululanase de Klebsiella pulmoniae. (a) Bactérias Gram positivas; (b) Bactérias Gram negativas; (c) Fungos
Etapa Upstream
Cinética de Produção de Metabólitos As enzimas como agentes metabólicos terão o caráter de metabólitos primários ou secundários dependendo da sua função metabólica Maioria das enzimas comerciais: enzimas degradativas (catabolismo) e têm as características dos metabólitos primários. Isto não é absoluto! Modelo de Ludecking & Piret para a cinética de produção de metabólitos por fermentação: dp dt dx dt X Não-associada ao crescimento Associada ao crescimento
Cinética de Produção de Metabólitos Modelo de Ludecking & Piret para a cinética de produção de metabólitos por fermentação: dp dt Metabólitos primários: Metabólitos secundários, dx dt Situações intermediárias são freqüentes na prática. Ex.: -amilase de Bacillus subtilis, glucoamilase de Aspergillus niger e lactase de Escherichia coli X
Cinética de Produção de Metabólitos Uma enzima não é necessariamente sintetizada durante parte do ciclo de crescimento Meio de composição adequada
Aspectos de controle genético da produção enzimática Indução Enzimas constitutivas: - Proporção minoritária com relação ao total; - Enzimas que estão implicadas com os aspectos centrais do metabolismo. - Produzidas continuamente independente da presença de substrato. Enzimas induzidas: - Proporção maioritária com relação ao total; - Vão sendo sintetizadas em proporções baixas, mas significativas, até que um substrato ou um produto derivado de sua degradação induza um grande aumento na síntese enzimática.
Aspectos de controle genético da produção enzimática Repressão - Repressão pelo substrato Na presença de uma fonte de carbono rapidamente assimilável como a D- glicose, a síntese de muitas enzimas se encontra reprimida. - Repressão por um catabólito é um fenômeno que se dá comumente nos microrganismos e que afeta a muitas enzima constitutivas e induzidas - Repressão pela presença de compostos que contenham enxofre, nitrogênio e outros. Ex.: síntese da proteinase extracelular de Bacillus subtilis é reprimida pela presença no meio de cultivo de certos compostos que contenham nitrogênio, como o glutamato e o aspartato.
Meios de cultivo Meio sintético x Matérias-primas naturais Fonte de carbono: carboidrato que ingresse nas vias metabólicas centrais, geralmente na forma de glicose Fonte de Nitrogênio: usualmente sal de amônio Enxofre, fósforo e magnésio: sais inorgânicos (sulfatos e fosfatos) Elementos-traços (K +, Ca 2+, Na +, Fe 2+, Mg 2+, Zn 2+ e Co 2+ ): funções metabólicas indispensáveis; sais inorgânicos. Alguns podem adquirir especial relevância (cofatores da enzima) Ex.: Ca 2+ no caso da amilase; Co 2+ no caso da glicose-isomerase. Hidrogênio e Oxigênio
Meios de cultivo Vitaminas, fatores de crescimento, aminoácidos Compostos que favoreçam a excreção (surfactantes), no caso de enzimas extracelulares Os mecanismos de controle que operam sobre a síntese enzimática (indução e repressão catabólica) devem ser considerados na formulação do meio.
Escolha do microrganismo Produtor da enzima de interesse em grande quantidade; Estável; Não-patogênico; Fácil manipulação.
Sistemas de Cultivo Superfície Submerso - Batelada - Batelada alimentada - Contínuo
Sistemas de Cultivo Superfície - Dificuldades de controle operacional; - Severos problemas de contaminação - Vantagens importantes em relação a transferência de oxigênio e recuperação do produto. - A principal tecnologia de fermentação superficial é a fermentação em estado sólido. É empregada para produzir, em escala comercial, celulases, amilases fúngicas, pectinases, proteases fúngicas e lipases. Microrganismo: fungos filamentosos do gênero Aspergillus. -amilase bacteriana mediante fermentação em estado sólido com farelo de arroz como substrato suporte.
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA - O sistema mais empregado na produção de enzimas. (importância do conhecimento da cinética) - Algumas enzimas são marcadamente instáveis depois da sua etapa de produção. - Efeito das variáveis operacionais mais relevantes: ph e temperatura - compromisso entre os valores ótimos para produção e crescimento; Ex.: Produção de celulase de Trichoderma reesei em meio de cultivo celulósico onde o ph ótimo de crescimento é 4.8, enquanto que o ótimo de produção é 3.5. Solução: valores intermediários ou efetuar alterações programadas de ph e temperatura
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA Cinética de produção de celulases de Trichoderma reesei em batelada, mostrando a instabilidade da fração endoglucanase.
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA - O sistema mais empregado na produção de enzimas. (importância do conhecimento da cinética) - Algumas enzimas são marcadamente instáveis depois da sua etapa de produção. - Efeito das variáveis operacionais mais relevantes: ph e temperatura - compromisso entre os valores ótimos para produção e crescimento; Ex.: Produção de celulase de Trichoderma reesei em meio de cultivo celulósico onde o ph ótimo de crescimento é 4.8, enquanto que o ótimo de produção é 3.5. Solução: valores intermediários ou efetuar alterações programadas de ph e temperatura
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA ALIMENTADA - Batelada seguida de alimentação de forma contínua ou intermitente até alcançar o volume final de operação dentro do reator; - Vantagens: Controlar a velocidade específica de crescimento do microrganismo. Produção de metabólitos secundários, metabólitos sujeitos à inibição por alta concentração de substrato e metabólitos sujeitos a repressão catabólica por substratos altamente metabolizáveis; Esta situação é aplicável a maioria das enzimas de interesse comercial.
Sistemas de Cultivo Submerso: CONTÍNUO -O cultivo, se operado em estado estacionário, deverá se manter em estado fisiológico definido que, a princípio, pode ser aquele de máxima produtividade em relação ao metabólito que se deseja produzir. - Pode-se manipular a velocidade de crescimento através da taxa de alimentação. - Aplicação industrial na produção de enzimas e outros metabólitos é reduzida. Maior complexidade do equipamento e sua operação, Baixa concentração do produto obtido Maiores perigos de contaminação e de desenvolvimento de mutantes devido aos grandes períodos de operação.
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados Atualmente: Todas as enzimas produzidas comercialmente provém de microrganismos que são um produto de programas de melhoramento genético Perspectivas: produzir enzimas com microrganismos manipulados por técnicas modernas de recombinação genética. Técnica: Clonagem genética, clonagem molecular ou DNA recombinante. Obtenção por síntese química, por biossíntese ou por purificação de uma fonte natural, um fragmento de DNA que codifique a síntese de uma determinada enzima e introduzir este fragmento através de um vetor na célula hospedeira onde o código genético vai se reproduzir e se expressar.
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados Clonagem do DNA em um plasmídeo vetor Clonagem do DNA utilizando vetores de fago
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados As enzimas são produtos genéticos primários, o que torna muito atrativa sua produção por esta via. Através dela pode-se conseguir: - Produzir enzimas de organismos superiores em sistemas microbianos; - Transferir a capacidade produtiva de uma cepa mais adequada do ponto de vista sanitário ou econômico; - Melhorar o nível de produção e a pureza da enzima produzida. Problemática: estabilidade genética do microrganismo; Na prática: a reversão a estados sub-produtivos ou não-produtivos; Destaca-se o enorme potencial desta técnica: êxitos mais significativos na produção de enzimas com microrganismos clonados.
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados Ex.: renina: protease de origem animal com alta demanda - Substituição por renina microbiana (de Mucor miehii): parcial. -Produção por tecnologia de DNA recombinante: Celltex, Genex, Genencor e Codon: produção de renina com cepas de Escherichia coli (sem excreção); Genecor: produção de renina animal extracelular com cepas Aspergillus nidulans. Outros centros: produção de renina excretável com cepas de Saccharomyces e Kluyveromyces. Gist-Brocades: renina animal produzida por cepas clonadas de Kluyveromyces marxianus.
Produção de Enzimas Sintéticas Introdução Uma enzima, apesar de conter muitos aminoácidos, utiliza somente uma pequena porção destes no processo catalítico. Ex.: tripsina contém 254 resíduos de aminoácidos: três aminoácidos são implicados no mecanismo de proteólise. Os demais aminoácidos: importantes para formar o sítio de união ao substrato.
Produção de Enzimas Sintéticas Métodos Basear a estrutura em proteínas ou peptídeos - Modificar uma enzima ou proteína existente - Construir uma estrutura peptídica totalmente nova Ex.: mioglobina: proteína transportadora de oxigênio Modificada para produzir uma enzima do tipo oxidase: - Une-se um catalisador de transferência de rutênio [Ru(NH 3 ) 5 ] 3+ a cada um dos três resíduos de histidina na mioglobina - Enzima bio-inorgânica, semi-sintética : capaz de reduzir o oxigênio enquanto que oxida vários compostos tais como o ascorbato. - Construir uma nova enzima ainda é inviável: não é possível predizer a estrutura tridimensional
Sintéticas Métodos Produção de Enzimas Desenvolvimento dos sítios de união para moléculas orgânicas simples: construir análogos não protéicos de enzimas -Sistemas mais estudados: dextrinas de Schardinger: oligosacarídeos cíclicos com resíduos de D-glicose unidos por ligações - 1,4 e que formam sólidos cristalinos. ciclomaltohexose ( -ciclodextrina): 6 resíduos de glicose ciclomaltoheptose ( -ciclodextrina): 7 resíduos de glicose ciclomaltooctose ( -ciclodextrina): 8 resíduos de glicose
Produção de Enzimas Sintéticas Métodos dextrinas de Schardinger: Estrutura da ciclomaltohexose ( -ciclodextrina) Orientação dos resíduos: formação de uma estrutura cilíndrica - Interior relativamente hidrofóbico - Grupos hidroxila estendendo-se a partir das bordas da molécula - Proporcionam um sítio hidrofóbico - Com o acoplamento covalente dos grupos reativos apropriados: possibilidade de produzir um análogo enzimático.
Métodos Desenvolvimento dos sítios de união para moléculas orgânicas simples: construir análogos não proteicos de enzimas - Resultados Produção de Enzimas Produção de Enzimas Sintéticas -ciclodextrina com 0-[-4(5)-mercaptometil 2 il] benzoato covalentemente unido à borda da molécula: imitando centro ativo da quimotripsina. Enzima sintética: máximo de atividade em ph 10 ( -benzima) capaz de catalisar a hidrólise de certos ésteres tão rápido quanto a quimotripsina. cinética de Michaelis-Menten é mais estável ao calor e ao alcali que seu equivalente natural.
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