Histórico da Microbiologia Sec. XIX Duas grandes questões biológicas levaram ao desenvolvimento de técnicas laboratoriais essenciais: O debate sobre a geração espontânea (Louis Pasteur) A natureza das doenças infecciosas (Robert Koch) 1
Geração espontânea prós e contras Francesco Redi (1668): experimentos com carne apodrecidas. John Needham (1745): o aquecimento de caldos nutrientes (de galinha ou milho) não prevenia o aparecimento de MO s. Lazaro Spallanzani (1765): refutou experimentos de Needham. A fervura de frascos previamente lacrados impedia o crescimento de MO s. (crítica de Needham: o lacre impedia a entrada da força vital necessária). Rudolf Wirchow (1858): introduziu conceito da biogênese ( células vivas somente podem surgir de células vivas préexistentes ). Louis Pasteur (1861): experimentos que refutaram definitivamente a teoria da geração espontânea. O experimento de Pasteur 2
O experimento de Pasteur 2004 Pearson Education, Inc. O experimento de Pasteur 2004 Pearson Education, Inc. 3
O experimento de Pasteur 2004 Pearson Education, Inc. Teoria do germe da doença 4
Teoria do germe da doença Experimentos de Pasteur: base das técnicas de assepsia. Pasteurização: para resolver problema de vinhos e cervejas que azedavam por causa das bactérias (álcool ácido acético). Relação entre deterioração dos alimentos e os microrganismos colaborou para a Teoria do germe da doença. Teoria do germe da doença Doenças: punição para os pecados individuais ou crimes. Causa: demônios nos detritos ou nos vapores dos pântanos. 1865: Pasteur descobre a causa da doença do bichoda-seda (protozoário). 1860: Joseph Lister tratou ferimentos cirúrgicos com fenol redução drástica de infecções e mortes. 5
Teoria do germe da doença Robert Koch, médico prático alemão, 1876: comprovou a teoria do germe da doença. Koch estudou o antraz (carbúnculo) doença de gado e ovelhas e descobriu o agente causador Bacillus anthracis. Problema! Como afirmar que a bactéria presente no sangue do animal afetado é o agente causador da doença? Postulados de Koch 1. O organismo patogênico suspeito deve estar presente em todos os casos da doença e ausente em animais sadios. 2. O organismo suspeito deve ser cultivado em cultura pura. 3. Células de uma cultura pura do organismo suspeito devem provocar a doença em um animal sadio. 4. O organismo deve ser isolado e caracterizado como o mesmo encontrado originalmente. 6
Exceções aos aos postulados de de Koch Exceções aos postulados de Koch 1) Nem todos os microrganismos crescem em meios de cultura; 2) Um conjunto de sinais e sintomas podem ser os mesmos em várias doenças; 3) Um microrganismo pode causar várias doenças. 7
Exceções aos postulados de Koch Não são cultivados em meio artificial: Treponema pallidum: sífilis Mycobacterium leprae: lepra Riquétsias e vírus: multiplicam-se somente dentro das células Diversidade Microbiana 1910 Paul Ehrlich Bala Mágica para combater um patógeno sem prejudicar o hospedeiro Dentre várias substâncias testadas salvarsan (derivado de arsênico) para o combate à Sífilis Antes disso, a única substância utilizada pelos Europeus era a quinina, extraída de casca de árvore sul-americana para o tratamento da malária 8
Diversidade Microbiana -Alexander Fleming, médico e bacteriologista escocês Contaminação por fungo em placa alerta para substância inibidora do crescimento bacteriano 1928, Penicillium notatum Penicilina 1940 Importância médica da Penicilina 9
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Instrumentação e técnicas básicas de assepsia Sobre as aulas práticas Profa. Dra. Ilana Camargo Aula 1 11
Biossegurança Conjunto de procedimentos adotados com o objetivo de dar proteção e segurança ao profissional e à sua equipe. Para evitar disseminação e contaminações devem ser empregadas medidas de controle de infecção como a utilização de equipamento de proteção individual (EPI), esterilização de materiais, desinfecção de ambiente e equipamentos. Equipamentos de Proteção Individual (EPI) Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC) Todo dispositivo ou produto de uso individual ou coletivo, utilizado pelo trabalhador destinados a proteção de riscos que podem ameaçar a segurança e a saúde no trabalho 12
Equipamentos de Proteção Individual (EPI) Gorro Óculos de proteção máscara Jaleco branco Luvas 13
A importância do Jaleco 14
Chuveiros e lava-olhos 15
Níveis de Biossegurança Designados em ordem crescente, pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal do laboratório, meio ambiente e à comunidade: O nível de Biossegurança 1, é o nível de contenção laboratorial que se aplica aos laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos pertencentes a classe de risco 1 (não causam doenças nos homens ou outros animais). Não é requerida nenhuma característica de desenho, além de um bom planejamento espacial e funcional e a adoção de boas práticas laboratoriais. Exemplos: Bacillus subtilis O nível de Biossegurança 2 diz respeito ao laboratório em contenção, onde são manipulados microrganismos da classe de risco 2 (causam doenças nos homens ou outros animais). Se aplica aos laboratórios clínicos ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico, sendo necessário, além da adoção das boas práticas, o uso de barreiras físicas primárias (cabine de segurança biológica e equipamentos de proteção individual) e secundárias (desenho e organização do laboratório). Exemplos: Vírus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni. Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, 1999. 250p. Níveis de Biossegurança NB-1 16
Níveis de Biossegurança NB-2 Níveis de Biossegurança O nível de Biossegurança 3 é destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco 3 (causam graves doenças nos homens ou outros animais) ou para manipulação de grandes volumes e altas concentrações de microrganismos da classe de risco 2. Para este nível de contenção são requeridos além dos itens referidos no nível 2, desenho e construção laboratoriais especiais. Deve ser mantido controle rígido quanto a operação, inspeção e manutenção das instalações e equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamento específico sobre procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos. Exemplo: Mycobacterium tuberculosis O nível de Biossegurança 4, ou laboratório de contenção máxima, destina-se a manipulação de microrganismos da classe de risco 4 (causam doenças nos homens ou outros animais representando grande risco para os trabalhadores de saúde, sendo alto o risco de transmissibilidade na comunidade), onde há o mais alto nível de contenção, além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente independente de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos físicos e operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção (instalações, desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança. Exemplo: Vírus Ebola. Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, 1999. 250p. 17
Níveis de Biossegurança NB-3 Fluxo de ar sempre de fora para dentro; Filtro de ar para troca de ar do ambiente; Usar equipamento de contenção de bioaerossol Níveis de Biossegurança NB-4 18
Níveis de Biossegurança NB-4 Níveis de Biossegurança NB-4 Sala de troca de roupas http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/publicmedia/labtour/pages/bsl9.aspx 19
Níveis de Biossegurança NB-4 http://www.agricultura.gov.br/comunicacao/noticias/2014/08/lanagromg-e-o-primeiro-dobrasil-com-nivel-de-biosseguranca-maximo 20
Aula 2 Instrumentação e técnicas básicas de assepsia Sobre as aulas práticas Profa. Dra. Ilana Camargo Conceitos importantes!! Tortora, et al, 6ª ed, 2000 21
Lavagem das mãos Indicação de lavagem das mãos: Sempre Que as mãos estiverem sujas Antes e após Preparo de materiais e/ou equipamentos O uso de luvas A aula de microbiologia Com o uso concomitante de luvas Após coleta de sangue Administração de hemoderivados Higienização de paciente O uso das luvas não substitui a lavagem das mãos!!! Lavagem das mãos 22
Lavagem das mãos - Retirar jóias, relógio, pulseiras (acúmulo de bactérias não removidas) - Abrir a torneira com a mão dominante quando não houver pedal - Molhar as mãos - Aplicar de 3 a 5 ml de sabão líquido nas mãos - Ensaboar as mãos, formando espuma, friccionando-as por 15 a 30 segundos, atingindo todas as suas faces - Enxaguar, deixando a água penetrar nas unhas e espaços interdigitais (mão em forma de concha). Retirar toda a espuma e os resíduos de sabão, sem deixar respingar água na roupa e no piso. - Secar as mãos com papel toalha descartável. Se a torneira for manual, usar o mesmo papel-toalha para fechá-la Verificação das lavagens das mãos Antes Depois Diminuição do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) Placas com 24h a 37 C e 5 dias a 4 C 23
Verificação das lavagens das mãos Antes Depois Diminuição das UFCs e da variedade de colônias (morfologia: tamanho, cor, aspecto) Placas com 24h a 37 C e 5 dias a 4 C Limpar a bancada com álcool 70% ANTES E DEPOIS dos experimentos!! 24
O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança Zona Asséptica Bico de Bunssen Análise de microrganismos Lâmina Lamínula Microscópio óptico Contador de colônias Cubetas Espectrofotômetro 25
Materiais Cabo Cabo de Kohle Haste Agulha de inoculação Alça de inoculação (Niquel-cromo ou platina) Transferência de microrganismos Alça de inoculação Agulha de inoculação Alça de Drigalski 26
O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança Zona Asséptica Transferência de microrganismos Pipeta pasteur Swab (cotonete) Pinça 27
Aula 3 Instrumentação e técnicas básicas de assepsia Sobre as aulas práticas Profa. Dra. Ilana Camargo Instrumentos Câmara de biossegurança / fluxo laminar Autoclave Esterilização pelo calor úmido (vapor sob pressão) Em geral: 15 a 20 minutos a 121ºC 28
Equipamentos Equipamentos Estufa 29
Materiais Fechar com tampão de algodão e cobrir com papel alumínio e papel pardo Rotina do laboratório Tubos cônico (tipo falcon) Microtubos ( tubo Eppendorf ) Balão volumétrico Erlenmeyer Frasco com tampa de rosca Béquer Proveta 30
Rotina do laboratório Balança de precisão Centrífuga phmetro Rotina do laboratório Agitador magnético com aquecimento Banho-maria Barras magnéticas ( pulgas ou peixinhos ) Agitador de tubos (vórtex) 31
Esterilização Bico de Bunsen Autoclave Filtro esterilizante Câmara de Biossegurança NUNCA PIPETE COM A BOCA!!! 32
Instrumentos Pipetas e pipetadores Pipetas automáticas Pipeta Pastuer Ponteiras 33
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